Abstract

α-Actinins (ACTNs) são conhecidos para reticular filamentos de actina em adesões focais em células migrando. Entre as quatro isoformas de ACTNs de mamíferos, e ACTN1 ACTN4 são expressos ubiquamente. Recentemente, foi relatado ACTN4 para melhorar a motilidade celular do cancro, invasão e metástase. No entanto, o mecanismo pelo qual ACTN4 dirige estes fenótipos malignas permanece obscura. Aqui, mostramos que ACTN4, mas não ACTN1, induz a formação de adesões focais imaturos em células DLD-1, levando ao rápido volume de negócios de adesões focais. Curiosamente, zyxin (ZYX) montagem para adesões focais foi marcadamente reduzida em células DLD-1 que expressam ACTN4, enquanto o recrutamento de paxilina (PAX) ocorreu normalmente. Por outro lado, em células DLD-1 que expressam ACTN1, PAX e ZYX foram normalmente recrutados para adesões focais, sugerindo que ACTN4 danifica especificamente a maturação de adesão focal através da inibição do recrutamento de complexos de ZYX para focal. Usando proteínas recombinantes purificadas, descobrimos que ZYX ligação a ACTN4 estava com defeito em condições em que foi observada ZYX ligação a ACTN1. Além disso, a invasão de Matrigel de células SW480 que expressam elevados níveis endógenos de proteína ACTN4 foi inibida pela expressão ectópica de ACTN1. Em conjunto, os nossos resultados sugerem que o defeito ZYX ligação a ACTN4, que ocupa adesões focais em vez de ACTN1, induz a formação de adesões focais imaturos, resultando no aumento da motilidade celular e invasão

citação:. Fukumoto H, Kurisu S, T Yamada, Takenawa T (2015) α-Actinina-4 Melhora Câncer Colorretal invasão celular através da supressão de Adesão focal maturação. PLoS ONE 10 (4): e0120616. doi: 10.1371 /journal.pone.0120616

Editor do Academic: Yves St-Pierre, INRS, Canadá |

Recebido: 05 de outubro de 2014; Aceito: 24 de janeiro de 2015; Publicação: 10 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Fukumoto et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Sociedade Japonesa para a Promoção da Ciência (JSPS) através jsps Grants-in-Aid de Investigação científica Grant 25.860.215 (para S. Kurisu ) e JSPs Grants-in-Aid para a Investigação Científica Grant 23227005 (para T. Takenawa). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

α-Actinins (ACTNs) são ubiquamente expressa citoesqueleto proteínas que reticulam filamentos de actina nas junções de aderência em células epiteliais e adesões focais em células migratórias polarizados [1,2]. Em adesões focais, ACTNs interagir com uma variedade de outras proteínas associadas focais-adesão tais como vinculina (VCL) [3,4] e integrinas [5,6], e, em seguida, ligar os filamentos de actina para adesões focais [7-9]. Existem quatro isoformas de ACTNs em células de mamíferos [10-12]. ACTN1 e ACTN4 são ubiquamente expressos e são chamados isoformas não-musculares, enquanto ACTN2 e ACTN3 são expressos especificamente nos tecidos musculares. Entre ACTNs, ACTN4 está principalmente envolvida na motilidade celular e invasão câncer [12-21]. Durante o movimento celular, ACTN4 nível de expressão da proteína é marcadamente aumentada e ACTN4 concentra-se no bordo dianteiro das células migratórias [12]. ACTN4 knockdown suprime a migração e a invasão de células cancerosas [15-18,20-22], enquanto que a sua sobre-expressão em células de cancro colo-rectal induz linfa metástases em ratinhos imunodeficientes [13]. Além disso, a expressão da proteína ACTN4 está intimamente relacionado com pior prognóstico em pacientes com câncer de mama [12], colorectal [13], pâncreas [20,23], ovário [19], bexiga [21], e pulmão [24] câncer. No entanto, a razão pela qual ACTN4, ao invés de ACTN1, está frequentemente associada a doenças malignas do câncer apesar das semelhanças na estrutura de domínio, actina vinculativo atividades e-reticulação e Ca

2 + -sensitivity entre os dois continua a ser elucidado [25] .

adesões focais são, estruturas macromoleculares grandes baseada integrina dinâmicas que ligam a matriz extracelular com os feixes intracelulares de filamentos de actina chamadas fibras de estresse. adesão focal é a estrutura principal que transmite a força de tracção extracelular numa célula. Assim, a força de adesão das células ao substrato e o período de vida ou a dinâmica de adesões focais afecta criticamente a organização dinâmica da forma da célula, incluindo a motilidade celular. Na migração lamellipodia celular, aderências nascentes, consistindo de integrinas em cluster e outras proteínas citoplasmáticos tais como quinase de adesão focal (FAK), ACTN e vinculin (VCL) formam inicialmente. Estes são estruturas de curta duração que tanto o volume de negócios rapidamente em cerca de 60 segundos ou madura para maior (cerca de 1 m de diâmetro) aderências dot-like referidos complexos como focais que persistem por vários minutos. complexos focais crescer ainda mais centripetamente alongadas em adesões focais e, simultaneamente, as fibras de stress de actina associados tornam mais espessas [26]. A polimerização de actina lamellipodial é catalisada pela actina factores de nucleação promovendo, verprolin-família homóloga WASP proteína (WAVE) e as proteínas da família da proteína relacionada com a actina 2/3 (Arp2 /3) complexo, que também é necessário para a montagem de aderências nascentes. filamentos de actina Lamellipodial, em concerto com ACTNs, precursores de formulário que servem como modelos para a maturação de adesões nascentes dentro de adesões focais [27,28]. A maturação de adesão focal nascente envolve a participação de proteínas de andaime, ou seja, paxilina (PAX) e zyxin (ZYX), para formar adesões focais estáveis ​​[7,26,29-31]. PAX parece regular a transição de aderências nascentes focal complexos através de múltiplos resíduos de tirosina fosforilados de PAX. Por outro lado, a participação ZYX em adesões focais é um evento relativamente tardio, que ocorre após os complexos são formados focais. Assim, ZYX é pensado para ser envolvido na formação e reorganização das adesões focais totalmente maduras, centrípetas. Em conformidade, relatórios recentes sugerem o papel do ZYX no espessamento de fibras de tensão em resposta a tensões mecânicas [32]. ACTN1 é tradicionalmente pensado para ser um ligante entre complexos de integrina e fibras de stress, uma vez que ACTN1 pode ligar diretamente para integrina β1, VCL e ZYX [33,34]. No entanto, o papel de ACTN4, o qual exibe uma elevada semelhança de aminoácidos (86%) para ACTN1, não foi testado precisamente, tanto em função e em interacções proteína-proteína na formação de adesão focal.

Neste estudo , demonstramos os efeitos opostos de ACTNs não-musculares na maturação de adesão focal em células de câncer colorretal. ACTN1 regula positivamente a formação de adesão focal, enquanto ACTN4 induz desestabilização e rápida rotatividade de adesões focais em células-superexpressão ACTN4. Nós também demonstram, pela primeira vez, uma clara diferença entre as duas isoformas ACTN em ZYX de ligação. ACTN4 não se liga a ZYX, o que provavelmente está na base da elevada taxa de rotação observada de adesões focais em células que sobre-expressam ACTN4, enquanto se liga a ACTN1 ZYX como relatado anteriormente. falha ACTN4 de se ligar a ZYX de perto associa a patogênese do câncer, porque comprometido a adesão de células-substrato frequentemente leva ao aumento da motilidade celular e invasão de câncer.

Materiais e Métodos

Reagentes e anticorpos

O anticorpo anti-ACTN1 (H00000087) foi comprado de Abnova (Taipei City, Taiwan). O anticorpo anti-ACTN4 (ALX-210-356) foi adquirida a partir de Life Sciences Enzo (Plymouth Meeting, PA, EUA). Os anticorpos anti-RhoA (SC-418) e a cadeia leve reguladora da miosina anti-(MRLC) (SC-28329) foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA, EUA). O anticorpo anti-fosfo-MRLC (T18 /S19) (# 3674) e anticorpo anti-His-tag (# 2365) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Danvers, MA, EUA). O anticorpo anti-FLAG (F3165), anti-VCL (V9131), anti-ZYX (HPA004835), e anticorpos pan-ACTN (A5044) foram adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). O anticorpo anti-PAX (610051) foi adquirida a BD Biosciences (San José, CA, EUA). O anticorpo anti-fosfo-SRC (Y418) (44-660G) e anti-fosfo-FAK (Y397) anticorpo (44-624G) foram adquiridos a Life Technologies (

Carlsbad

, CA, EUA). O anticorpo anti-actina (MAB1501) foi adquirido a Merck (Billerica, MA, EUA). faloidina marcada com rodamina foi adquirida a partir de Life Technologies. Factor de Crescimento Reduzida Matrigel (# 354230) foi adquirida a partir de Corning (New York, NY, EUA). Actina proteínas purificadas a partir de músculo esquelético de coelho (AKL99-A) foram adquiridos a partir de citoesqueleto, Inc. (Denver, CO, EUA)

cultura celular

As linhas celulares de cancro colorrectal humano DLD-1. , HT-29, LoVo, NCI-H508, e Caco-2 foram generosas doações de Dr. T. Azuma (faculdade de Odontologia de Tóquio, Tóquio, Japão). A linha de células de câncer colorretal humano SW480 foi uma oferta generosa do Dr. K. Nagano (Instituto de Ciências Médicas, da Universidade de Tóquio, Tóquio, Japão). DLD-1 e LoVo foram originalmente comprado de JCRB Cell Bank (Osaka, Japão). HT-29, NCI-H508, Caco-2, e SW480 foram da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, EUA). Todas as linhas celulares, excepto SW480, foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM; Wako, Osaka, Japão) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 4 mM de L-glutamina, e penicilina /estreptomicina. células SW480 foram cultivadas em Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640; Wako, Osaka, Japão) suplementado com FBS a 10%. células FreeStyle 293F foram cultivadas em FreeStyle meio 293 Expression (Life Technologies).

Plasmids e transfecção

Full-length ACTN1 humana, ACTN4 e ZYX cDNAs foram obtidos por reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando ADNc de células DLD-1 como um modelo. Os seguintes mutantes de deleção de ZYX foram amplificados por PCR: ZYX-N (aminoácidos [AA] 1-51) e ZYX-C (AA 52-572). Todos os ADNc foram sequenciados e, em seguida, subclonado no pCMV2A, pCMV4A (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, EUA), pEGFP-N2, pEGFP-N3, pEGFP-C1, pmCherry-N1 (TAKARA BIO Inc., Otsu, Japão), pGEX-6P-1 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, EUA), e pFastBacHT A (Life Technologies). A GFP-vinculina (VCL) foi previamente descrito [35]. Para a expressão estável em células de ACTN DLD-1, que codifica a GFP ADNc, ACTN1-GFP, e ACTN4-GFP foram amplificados por PCR e inserido no vector de pIRESpuro3 (TAKARA BIO Inc.).

Os plasmídeos foram transfectados em DLD- 1 ou SW480 células usando Lipofectamine reagente 2000 ou no FreeStyle 293F células com reagente FreeStyle Max de acordo com as instruções do fabricante (Life Technologies).

RNA de interferência (RNAi)

Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) alvejando ACTN1 humana e ACTN4 (siGENOME SmartPool) e siGENOME não-segmentação de Controle siRNA Pool # 2 foram adquiridos da GE Dharmacon (Lafayette, CO, EUA). siRNAs foram transfectados em células DLD-1 com o reagente Lipofectamina RNAiMAX (Life Technologies) a uma concentração final de 10 nM. As células transfectadas foram cultivadas num meio de crescimento durante 48-72 h antes de ser submetido a blotting ou imunofluorescência coloração ocidental.

A geração de linhas celulares estáveis ​​DLD-1-GFP-ACTNs

DLD- As células foram transfectadas com 1 pIRESpuro3-GFP, -ACTN1-GFP, ou-ACTN4-GFP. As colónias simples foram isoladas após 2 semanas de selecção puromicina (1,5 ug /mL). A expressão da proteína nos lisados ​​celulares foi avaliada por imunotransf erência com um anticorpo anti-GFP. As células resultantes foram denominados como DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, ou DLD-1-ACTN4-GFP.

purificação de proteínas recombinantes

Human ZYX full-length e ZYX-C foram clonados no vector pCMV2B que codifica uma etiqueta FLAG N-terminal e transfectado para células 293F Freestyle. As células foram colhidas por centrifugação 48 horas após a transfecção, e o sedimento foi ressuspenso em imunoprecipitação (IP) de tampão (Tris 20 mM, pH 7,4, 100 mM de NaCl, 0,5% de NP-40, ácido etilenodiaminotetracético 1 mM [EDTA], e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo [PMSF]) suplementado com leupeptina e aprotinina. As células foram lisadas por sonicação e centrifugadas a 100000 ×

g

durante 30 min. O sobrenadante foi incubado com anti-FLAG gel de afinidade M2 ​​(Sigma-Aldrich) durante 2 h e, em seguida, lavou-se quatro vezes com tampão IP. A FLAG-ZYX-integral e ZYX-C ligado ao gel anti-FLAG M2 foram imediatamente utilizados para o ensaio de pull-down. Humana ZYX-N foi clonado no vector pGEX-6P-1. Esta construção foi usada para transformar a BL21 (DE3) pLysS

Escherichia coli

células (Promega, Madison, WI, EUA). As células que expressam as proteínas de fusão GST foram recolhidas, ressuspensas em tampão de lise (Tris 40 mM, pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,5% de Triton X-100, 5 mM EDTA, e 1 mM de PMSF, e Completa Protease Inhibitor Cocktail Tablet [ ,,,0],Roche, Basileia, Suíça]), lisadas por sonicação e centrifugadas a 12000 ×

g

durante 30 min. O sobrenadante foi incubado com glutationa Sepharose 4B (GE Healthcare) durante 2 h e, em seguida, lavou-se com tampão de lise. Limite de GST-ZYX-N foi eluida com glutationa.

marcada com His ACTN1 comprimento completo humano e ACTN4 foram expressos em células Sf9 usando o sistema de expressão Bac-to-Bac de Baculovírus (Life Technologies). As proteínas recombinantes foram purificadas utilizando Ni-NTA agarose (Qiagen, Venlo, Holanda).

Microscopia de imunofluorescência

As células foram transfectadas com plasmídeos ou siRNAs e re-semeadas em lamelas de Matrigel-revestidas após 24- 48 horas de transfecção. As células foram deixadas aderir e distribuídos por 24 h, e, em seguida, fixadas com 4% de paraformaldeído durante 10 min à temperatura ambiente, seguido de permeabilização com 0,2% de Triton X-100 em solução salina tamponada com fosfato (PBS) durante 5 min. As lamelas foram lavadas duas vezes com PBS e incubadas com os anticorpos primários durante 2 h à temperatura ambiente, e depois tratou-se com anticorpos secundários durante 1 h à temperatura ambiente. Alexa Fluor 568 IgG de cabra anti-coelho (H + L), anticorpo e Alexa Fluor 647 anticorpo de cabra anti-IgG de ratinho (H + L), anticorpo (ambos a partir de Life Technologies) foram utilizados como anticorpos secundários. As lamelas foram montadas com PermaFluor Aqueous meio de montagem (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) e observada utilizando um FluoView 1000-D microscópio confocal (Olympus, Tóquio, Japão).

Western blot

Todas as células utilizadas para a transferência de western foram semeadas em pratos de plástico pré-revestidas com Matrigel. As células foram lisadas com tampão de amostra de Laemmli, sonicadas brevemente para cortar o ADN, e ferve-se a 95 ° C durante 5 min. Western blotting foi realizado por procedimentos padrão, com detecção por anticorpos secundários conjugados com fosfatase alcalina de cabra anti-ratinho ou IgG de coelho-(Promega). software ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD, EUA) foi utilizado para quantificar intensidades de banda.

Quantificação de adesões focais e fibras de stress

adesões focais foram quantificados como segue. As células foram fixadas e coradas com anticorpo anti-VCL e rodamina-faloidina, ou com anticorpos anti-anti-PAX ZYX e. As imagens foram obtidas por microscopia confocal e thresholded por três vezes o fundo. números de adesão focal foram quantificados por contagem VCL ou PAX placas. Para quantificar a maturidade de adesão focal, Pax e ZYX placas positivas por unidade de área (células DLD-1) ou por célula (células SW480) foram contadas. Oito a oitenta por células obtidas a partir de três experiências independentes foram analisadas. A proporção de ZYX-positivos (totais) para placas PAX-positivas foi calculada para cada célula e então a média entre as células. Para quantificar o tamanho de adesão focal, a área média das placas PAX-positivas foi calculada para cada célula e então a média entre as células. Todo o processamento de imagem foi realizado utilizando o software ImageJ.

a formação de fibras de stress foi quantificada como se segue. As células transfectadas com o controlo, ACTN1, e ACTN4 siRNAs, ou células que expressam GFP, ACTN1-GFP, ou ACTN4-GFP foram coradas com anticorpo anti-VCL e rodamina-faloidina e fotografada por microscopia confocal sob as mesmas configurações de aquisição. sinais faloidina foram thresholded ao mesmo nível e a percentagem de células que formam fibras de stress discerníveis ligados a placas VCL em pelo menos uma extremidade foi quantificada. As experiências foram repetidas três vezes. Pelo menos 23 células foram pontuadas para cada experimento.

processamento de imagem de células vivas de células DLD-1 e análise de volume de negócios

células DLD-1 transfectadas com GFP-VCL e mCherry, ACTN1-mCherry, ou ACTN4-mCherry foram re-plaqueadas em Matrigel-revestido, de 35 mm pratos de vidro de fundo (IWAKI, Tóquio, Japão) 24 h após a transfecção. Cerca de 16 horas após re-plaqueamento, foram observadas nas células durante mais de 2 h por microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRF) (Olympus). Antes de recolha de imagens, o meio foi substituído com uma média de CO

2-independente (Life Technologies) suplementado com 10% de FBS e 4 mM de L-glutamina. As imagens foram tomadas como um quadro a cada minuto durante 120 minutos. As aderências fotografada se ajustam aos critérios em que eles foram localizados a uma lamellipodia salientes. Uma sequência de kymographs foi obtido utilizando o software ImageJ. A mudança de lapso de tempo na intensidade de fluorescência de GFP-VCL foi traçada usando o Microsoft Excel (Microsoft Corporation, Redmond, WA, EUA), e as taxas de montagem de adesão focal, estabilidade, e a desmontagem foram determinadas como anteriormente descrito [28]. Estas medições realizaram-se para 2-10 aderências por célula em células 8-10 para cada condição.

ensaio de invasão de Matrigel

O ensaio de invasão foi realizada como descrito anteriormente [36], com alguns modificações. DLD-1-GFP, DLD-1-ACTN1-GFP, e as células DLD-1-ACTN4 GFP (2,0 × 10

5 células em DMEM isento de soro) foram semeadas no compartimento superior do TB BioCoat Matrigel Invasão Secção (BD Biosciences) e incubadas com 10% de FBS DMEM no poço e meio isento de soro inferior na câmara superior. Após 26 h, as células foram fixadas com formaldeído a 3,7% em PBS durante longo de 30 min. As células foram lavadas com PBS e as células positivas para GFP invadidas sobre a superfície inferior da membrana de filtro foram observadas por microscopia confocal. As células em seis campos microscópicos seleccionados aleatoriamente a partir de câmaras de duplicados foram contadas em três experiências independentes. células SW480 foram transfectadas com GFP ou GFP-ACTN1 plasmídeos. Após 24 h, as células (5,0 x 10

5 células) foram semeadas na câmara de topo e incubadas com 10% de FBS em meio RPMI 1640 e o fundo do poço de meio isento de soro na câmara superior.

Pull -down ensaio

proteínas GST-ZYX-N obrigados a glutationa Sepharose 4B foram incubadas com purificado His-ACTN1 ou Seus-ACTN4 proteínas em tampão (tampão de lise mais 1,0% de albumina sérica bovina [BSA]) de ligação para 2 h, lavou-se três vezes com tampão de ligação, e ACTNs ligadas foram analisadas por SDS-PAGE. proteínas FLAG-ZYX-completos e FLAG-ZYX-C ligados a gel de afinidade anti-FLAG M2 foram misturados com purificado His-ACTN1 ou His-ACTN4, incubadas por 2 h em tampão IP, e ACTNs encadernados foram analisados. As quantidades de RhoA activa foram quantificadas por ensaios de pull-down com GST-Rhotekin-RBD, como previamente descrito [36]. As intensidades de sinal foram medidos usando software ImageJ.

A análise estatística

Para as comparações múltiplas,

valores

P foram gerados por análise de uma via de variância (one-way ANOVA) utilizando o teste de Dunnett para comparações múltiplas. Para as análises de dois grupos,

t

-test foi usada Student. As análises foram realizadas utilizando GraphPad Prism 6 software (GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EUA).

Resultados

ACTN1 e expressão ACTN4 em células de cancro do cólon

ACTN4 foi relatado para melhorar a motilidade celular e promover linfonodo metástase do câncer colorretal [13]. No entanto, não é claro se estes efeitos são atribuídos a funções específicas de isoformas ACTN4 ou se ACTN1 isoforma clássica é capaz de induzir fenótipos cancerosos como ACTN4 faz. O primeiro quantificados os níveis de expressão relativos de proteínas endógenas ACTN4 ACTN1 e em várias linhas celulares de cancro do cólon usando proteínas recombinantes purificadas como controlos externos (Fig 1A). ACTN4 expressão foi mais elevada do que a de ACTN1 em todas as células, excepto as células DLD-1. As células DLD-1 expressa ACTN4 a uma baixa, mas semelhante, o nível do que a de ACTN1 (Fig 1B). Assim, a fim de clarificar a função diferencial de ACTN1 e ACTN4, utilizou-se as células DLD-1, porque os efeitos da expressão ectópica ou silenciamento de ACTNs eram detectáveis.

(A) análise de transferência de Western de ACTN1, ACTN4, e actina em linhas celulares de cancro do cólon humano. os níveis de proteína e ACTN1 ACTN4 foram medidos em comparação com proteínas His-tag e ACTN1 ACTN4 recombinantes utilizados como padrões externos. Actina foi utilizado como um controlo de carga e de actina do músculo esquelético de coelho purificada foi utilizada como um padrão externo. intensidades (B) da banda foram quantificados, e as razões molares de ACTNs foram calculadas e representadas como% molar contra actina. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes.

Papéis

diferenciais de ACTN1 e ACTN4 na formação de adesões focais

ACTN1 e expressão ACTN4 em células DLD-1 foi silenciada por siARN (Fig 2A). ACTN1 knockdown diminuiu o número de fibras de stress e adesões focais. No entanto, ACTN4 knockdown aumentou inesperadamente fibras de stress e adesões focais (Fig 2B-2D). Estes resultados mostram que tanto ACTN1 ACTN4 e estão envolvidos na formação de fibras de stress e adesões focais em células DLD-1, mas claramente em sentidos opostos: ACTN1 reforça-la, enquanto ACTN4 suprime. Os papéis contrastantes de ACTNs também foram observados pela expressão ectópica de ACTN1-GFP e ACTN4-GFP em células DLD-1 (figura 2E). ACTN4 superexpressão suprimida a formação de fibras de stress e adesões focais (Figura 2F-2H). Por outro lado, a sobre-expressão induzida ACTN1 o desenvolvimento de fibras de stress e adesões focais.

(A) e ACTN1 ACTN4 expressão foi silenciados por ARNsi siGENOME SmartPool em células DLD-1. knockdown eficiente foi confirmada por transferência Western usando anticorpos específicos para a isoforma ACTN. A seta indica ACTN1 endógeno. O asterisco indica uma banda de reacção cruzada não específica. (B) As células transfectadas com os ARNsi indicados foram coradas para vinculina (VCL) e F-actina e observadas por microscopia confocal. As setas e setas indicam adesões focais e fibras de stress, respectivamente. Barra de escala = 10 mm. (C) As percentagens de células tratadas com siRNA que formam fibras de stress são representados graficamente. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. *

P Art 0,05, **

P Art 0,01. (D) Os números de adesão focal por células de células tratadas com siRNA foram representados graficamente. Os dados representam a média ± DP de 71 células de controlo, 73 células para células SI-ACTN1 e 55 células para células Si-ACTN4. *

P Art 0,05. (E) Expressão transiente de ACTN1-GFP e ACTN4-GFP em células DLD-1 foi confirmada por transferência Western usando anticorpos específicos para a isoforma ACTN. (F) GFP, ACTN1-GFP, e ACTN4-GFP foram expressos em células DLD-1, que foram, em seguida, coradas para VCL e F-actina e observadas por microscopia confocal. As setas e setas indicam adesões focais e fibras de stress, respectivamente. Barra de escala = 10 mm. (G) As percentagens de células transfectadas que formam fibras de stress são representados graficamente. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. TFX indica transfecção. **

P Art 0,01. (H) Os números de adesão focal por célula de células que expressam GFP, ACTN1-GFP, e ACTN4-GFP foram representados graficamente. Os dados representam a média ± DP de 130 células para GFP, 52 células para ACTN1-GFP, e 73 para as células ACTN4-GFP. *

P Art 0,05.

Maior moléculas que transmitem informações a partir de placas de adesão à actina fibras de stress incluem miosina II de sinalização, de GTPases da família FAK, cinases da família Src, e Rho. Assim, examinamos as proteínas que estão envolvidas na formação de adesões focais por transferência de Western em células em que a expressão foi ACTN silenciados por ARNsi (Fig S1). Fosforilação das cadeias de miosina reguladoras leves (MRLC) em treonina 18 e serina 19, e fosforilação da tirosina da FAK e SRC não foram alterados. RhoA actividade foi reduzida especificamente em células tratadas com siRNA ACTN1. Apesar de diminuição da actividade da miosina II em ACTN1 ou células ACTN4 knockdown foi anteriormente relatado [14,17,37], não foi possível detectar alterações significativas na fosforilação MRLC. Além disso, a diminuição observada na actividade RhoA era modesto (inferior a 40% de redução para ACTN1 siRNA). Estas mudanças não se correlacionou com alterações fenotípicas na formação de fibras de stress e adesões focais observadas em células ACTN knockdown na Fig 2B-2D e 2F-2H. Além disso, a actividade de reguladores da formação de aderências nascente, isto é, FAK e SRC, foi semelhante em controlo e 4 células ACTN1 /tratadas com siRNA, sugerindo que as alterações de formação de fibras de stress e os números de adesão focal em resposta à manipulação da expressão ACTN poderia ser atribuído às actividades diferenciais de moléculas de ação em atraso no amadurecimento gradual de adesões focais, tais como reguladores da estabilidade do complexo focal ou reguladores de montagem de adesão focal centrípeta.

ACTN4 aumenta a adesão focal taxa de rotatividade

em seguida, co-expressa ACTN1-mCherry ou ACTN4-mCherry com GFP-VCL e observou VCL imagens de lapso de tempo por microscopia TIRF para rastrear a montagem e desmontagem de adesões focais. Como mostrado na Fig 3A, S1 Filme, S2 filme, e S3 de filme, a taxa de rotação de adesões focais em células que expressam ACTN4 apareceu mais rápida do que a de células que expressam ou ACTN1 controlo. O tempo requerido para um único adesão a ser desmontado foi de 34 min, em média, em células de controlo mCherry-expressam, o que indica que a adesão demarcada por sinal GFP-VCL é presumido para alcançar uma adesão focal madura. O tempo de vida de tais adesões focais pode ser dividido em três passos; montagem, estabilidade, e a desmontagem (Fig 3A). Mediu-se o tempo necessário para cada passo (Fig 3B-3D). Em células que expressam ACTN4, o tempo requerido para a estabilização e a desmontagem foi menor do que em células que expressam o controlo ou ACTN1. Estes resultados demonstram que, em células que expressam ACTN4, o tempo de vida de adesões focais é reduzido devido a uma taxa acelerada de desmontagem, o que sugere que as adesões focais são desestabilizadas numa forma específica de isoforma por sobreexpressão ACTN4.

(A) mCherry , ACTN1-mCherry ou ACTN4-mCherry foram co-expressa com imagem lapso de tempo VCL GFP-VCL e foi observada por microscopia de fluorescência de reflexão total interna (TIRF) para traçar a montagem e desmontagem de adesões focais. painéis superiores mostram kymographs representativas de GFP-VCL fluorescência ao longo longas filas 5 mícrons desenhados em regiões de estender lamellipodia. A intensidade de fluorescência no painel superior foi representada graficamente contra o tempo e mostrado como um gráfico para a parte inferior de respectivos kymographs. As fases volume de negócios de focal montagem aderência, estabilidade e desmontagem são apresentados como linhas tracejadas vermelhas no gráfico vector mCherry. (B-D) Duração de cada fase rotatividade exemplificado no gráfico à esquerda, em A foi analisada e quantificada a partir de 51 aderências para células mCherry-expressam, 57 aderências para células ACTN1-mCherry-expressam e 64 aderências para ACTN4-mCherry células que expressam . Os dados são apresentados como a caixa e suiça parcelas com caixas representando 25o-75o gama percentil e bigodes representam décima-nonagésimo gama percentil. n.s., não significativa, **

P Art 0,01.

recrutamento ZYX a complexos focais é prejudicada em células que expressam ACTN4

Dado que adesões focais são desestabilizadas pela expressão ACTN4 em células DLD-1, a hipótese de que ACTN4 inibe a função de proteínas envolvidas na transformação de complexos focais para adesões focais centrípetas. Em particular, foi examinada a localização de ZYX, que é relatado para localizar especificamente em adesões focais centrípetas maduras [30]. Usamos PAX como um marcador geral de adesões focais ao longo de maturação. Como mostrado na linha superior da Fig 4A, as células DLD-1 de controlo que expressam GFP formada placas PAX-positivos na periferia da célula lamelar. foram assumidas essas placas para corresponder a ambos os complexos focais e adesões focais centrípetas. Entre estas placas, adesões focais centrípetas maduras podem ser distinguidos com base na co-localização ZYX. Os números médios de Pax e placas ZYX-positivos em células de controlo foram de 0,14 e 0,073 por micrômetro quadrado, respectivamente (Fig 4B e 4C). Assim, cerca de metade das adesões focais eram ZYX-positiva e, assim, foram considerados madura em células de controlo. ACTN4 células que expressam GFP-ACTN1-GFP e formado números similares de placas PAX como observado nas células de controlo, sugerindo que ACTNs tem pouca influência sobre a formação de complexos focais (Fig 4B). Em contraste, tanto o número e proporção de placas ZYX-positivos em células que expressam ACTN4 foram significativamente reduzida para 0,049 placas /iM

2 e 40%, respectivamente, em comparação com as de células que expressam ACTN1 controlo e (Fig 4C e 4D). Além disso, a forma predominante de adesões focais em células que expressam ACTN4 foi alterado para uma estrutura redonda, ponto semelhante, em contraste com as aderências centrípetas alongados que foram frequentemente observadas em células que expressam ACTN1 controlo e (ver setas na Fig 4A, inferior linha). A alteração da forma reflectiu-se no tamanho das placas PAX-positivos, que se tornou mais pequeno em células que expressam ACTN4 (Figura 4E). Estes resultados mostram que os complexos de contacto não pode atingir as adesões focais centrípetas amadurecidas em células que expressam ACTN4. Além disso, ACTN4 inibe especificamente o recrutamento de ZYX adequada para complexos focal, o que pode explicar as diferenças fenotípicas entre ACTN1- e células que expressam ACTN4.

(A) GFP, ACTN1-GFP, e ACTN4-GFP ( mostrado em verde) foram expressos em células DLD-1, que foram coradas para PAX (azul) e ZYX proteínas (vermelho) e fotografada com um microscópio de fluorescência confocal. regiões enquadradas na coluna mais à esquerda indicam as lamelas periférico utilizado para PAX e ZYX quantificação placa. Uma série de imagens ampliadas das regiões enquadradas são mostradas à direita. As setas e setas indicam PAX-positivo e placas PAX /ZYX-double-positivos, respectivamente. Barra de escala = 30 mm. (B-C) Números de PAX e ZYX placas por área de unidade de lamelas periférica foram contadas em GFP, ACTN1-, ou células que expressam ACTN4. Oito a dezasseis células foram analisadas em cada grupo. As barras de erro referem-se a desvios padrão entre as células. n.s., não significativo, *

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P Art 0,01. (D) Rácio de ZYX-positivos para placas PAX-positivos, ou seja, o total de adesões de placa. As barras de erro referem-se a desvios padrão entre as células. n.s., não significativa, **

P Art 0,01. (E) PAX tamanho de placa em GFP, ACTN1- ou células que expressam ACTN4 foi medido em pelo menos 171 células aderências de 8-11 por grupo. As barras de erro referem-se a desvios padrão entre as células. n.s., não significativo, *

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