Abstract

A quimioterapia é um tratamento primário para câncer, mas sua eficácia é frequentemente limitada pelos efeitos adversos de agentes citotóxicos. entrega de drogas específicas podem reduzir a toxicidade não específica de quimioterapia por dirigir selectivamente fármacos anti-cancerígenos para as células tumorais. proteína MUC1 é um alvo atractivo para a posse de administração de fármaco específica do tumor a sua sobre-expressão na maioria dos adenocarcinomas. Neste estudo, um romance MUC1 aptâmero é explorado como o ligando de direccionamento para o transporte de doxorrubicina (Dox) para as células cancerosas. Nós desenvolvemos um aptâmero DNA 86-base (MA3) que se liga a um epitopo péptido de MUC1 com um

K

d de 38,3 nM e reactividade cruzada mínima à albumina. Usando o cancro do pulmão A549 e células MCF-7 de cancro da mama como modelos que expressa MUC1, MA3 foi encontrado para se ligarem preferencialmente a células-MUC1 positivo mas não MUC1-negativo. Um complexo de aptâmero-doxorrubicina (Apt-Dox) foi formulado por intercalantes doxorrubicina na estrutura de ADN de MA3. Apt-Dox foi encontrado capaz de transportar doxorrubicina em células do tumor de MUC1-positivo, enquanto reduz significativamente a ingestão de drogas pelas células MUC1-negativo. Além disso, Apt-Dox mantida a eficácia da doxorrubicina contra as células do tumor de MUC1-positivo, mas reduzido a toxicidade para as células de MUC1-negativa (P 0,01). Os resultados sugerem que o aptâmero MUC1 podem ter uma utilidade potencial como um ligando de direccionamento para entrega selectiva de um agente citotóxico para tumores que expressam MUC1

citação:. Hu Y, J Duan, Zhan Q, Wang M, Lu X, Yang XD (2012) Novel MUC1 Aptamer seletivamente Proporciona agente citotóxico às células cancerosas in vitro. PLoS ONE 7 (2): e31970. doi: 10.1371 /journal.pone.0031970

editor: Aamir Ahmad, Faculdade de Medicina da Wayne State University, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Setembro, 2011; Aceito: 19 de janeiro de 2012; Publicação: 22 de fevereiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por fundos do Ministério chinês da Ciência e Tecnologia (2011CB933504, 2011CB911004, 2011CB911003) e da Fundação de Ciência Natural da China (81.071.870)

Conflito de interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a quimioterapia é um tratamento essencial para câncer, especialmente para a doença metastática em estágio final. No entanto, a eficácia da quimioterapia está frequentemente limitada por efeitos adversos de agentes citotóxicos que são empregues na maior parte dos regimes terapêuticos. Um dos principais problemas associados com drogas citotóxicas é que eles causam danos para ambas as células cancerosas e tecido normal, gerando efeitos adversos graves que limitam muitas vezes a intensidade e a duração da quimioterapia. Por conseguinte, é frequentemente difícil para drogas citotóxicas para eliminar todas as células cancerosas no interior do corpo, resultando em falha do tratamento e prognóstico pobre. Tal falha sublinha a necessidade de desenvolver a terapia cada vez mais potente com toxicidade reduzida. Uma abordagem para alcançar a meta é alvejado a terapia do cancro, em que as drogas anti-cancro estão selectivamente entregue a células de cancro, de modo que a citotoxicidade contra tumor é aumentada, enquanto os efeitos adversos reduzidos. terapia do câncer alvo é uma promessa na melhoria da eficácia anticancerígena. Tem sido relatado que as transportadoras guiada-aptâmeros contendo paclitaxel podem melhorar significativamente a eficácia contra o cancro da próstata em modelos animais [1]. Os anticorpos monoclonais têm sido também covalentemente ligado a medicamentos para a terapia do cancro orientada [2]. Um estudo de emtansine trastuzumab (T-DM1), um conjugado do anticorpo anti-HER2 humanizado e uma droga química, actualmente em fase de ensaio clínico III [3].

Um sistema de administração de fármaco alvo típico consiste geralmente de um fármaco anticancerígeno e um ligando de direccionamento, que pode se liga especificamente a marcadores tumorais que expressam abundantemente em células [4] cancerosas. Um marcador tumoral ideal para terapia-alvo deve ser uma proteína de membrana que é sobre-expresso na superfície de células cancerosas, com relativamente baixa expressão em tecido normal. MUC-1 é uma glicoproteína grande transmembranar bem caracterizado que pode, potencialmente, servir como o alvo para a terapia anti-cancro. A sua expressão é aumentada em pelo menos 10 vezes na maioria dos adenocarcinomas malignas, incluindo cancro da mama, cancro do pulmão, e cancro do cólon, tornando-o um marcador de tumor alvo atraente para a terapia de [5]. Além do marcador tumoral, o ligando de direccionamento tumor é também um elemento importante para a terapia do cancro alvo. Um ligando alvo ideal deve ter uma elevada afinidade de ligação para o marcador de tumor, com boa especificidade e baixa imunogenicidade [6]. Ultimamente, novos agentes de segmentação, incluindo aptâmeros [7], peptídeos curtos [8] e outras pequenas moléculas [9], tornaram-se a nova geração de segmentação moléculas. Os aptâmeros são oligonucleótidos de cadeia simples que se podem ligar a moléculas alvo com elevada afinidade e especificidade. Comparando-se a anticorpos monoclonais, aptâmeros possuem vantagens distintas como ligando de direccionamento: alta afinidade de ligação para a maioria das moléculas, de custo limitado síntese, de baixa imunogenicidade, e são de tamanho pequeno que permite-lhe penetrar tumores sólidos [10]. Devido a estas vantagens, os aptâmeros foram empregues como novos ligandos alvo em sistemas de entrega de drogas contra o cancro da próstata [11], [12], [13] e leucemia [14]. Para o marcador de tumor de MUC1, Ferreira et ai têm desenvolvido vários aptâmeros que se podem ligar às células do tumor de MUC1-positivos [15]. Também tem sido demonstrado que os aptâmeros MUC1 poderia ser empregue para fornecer selectivamente agente fototerapia para células cancerosas

in vitro

[16].

Os fármacos citotóxicos são os componentes principais da maioria dos regimes de quimioterapia para o cancro tratamento. É, portanto, importante investigar se MUC1 aptâmero pode ser utilizada directamente para fornecer selectivamente agente citotóxico para as células cancerosas. Até agora, no entanto, nenhum desses estudos tem sido relatado na literatura. Aqui neste estudo, desenvolvemos um romance MUC1 aptâmero, e avaliada a sua capacidade para a entrega de doxorrubicina às células cancerosas

in vitro

. Especificamente, foram selecionados um aptâmero DNA 86-base (MA3 denominada) contra um epitopo péptido de MUC1, e avaliada a sua afinidade de ligação às células MUC1 positivos e negativos. Para explorar a especificidade de ligação do aptâmero, nós também avaliada a sua ligação a albumina, que é a proteína mais abundante no plasma, e pode-se ligar não especificamente a aptâmeros e interferir com a sua função de direccionamento. A doxorubicina é um dos fármacos antineoplásicos mais largamente utilizados, e pode inibir a proliferação das células cancerosas através de intercalação para a estrutura do DNA nos núcleos celulares. Um complexo de aptâmero-doxorrubicina (Apt-Dox) foi formulada através da incorporação de doxorubicina na estrutura de aptâmero MA3. Temos agora relatam que Apt-Dox pode entregar seletivamente doxorrubicina às células MUC1-positivos

in vitro

.

Materiais e Métodos

Reagentes

Os iniciadores oligonucleotídicos foram sintetizados pela Invitrogen (Xangai, China). Os péptidos de pelo menos 95% de pureza foram sintetizados por SBS Genetech (Beijing, China). albumina de soro bovino (BSA) foi adquirida a partir de Tbdscience (Tianjin China). microesferas de ureia-formaldeído magnéticas monodispersas foram adquiridos a partir da linha de base Chromtech (Tianjin China). A tripsina foi adquirida a Amresco (EUA). contas magnéticas revestidas com estreptavidina foram adquiridos a partir de Promega (EUA). 1-etil-3- (3-dimethyllaminopropyl) carbodiimida (EDC) foi adquirido da Sigma (EUA).

As linhas celulares

cancro da mama humano (MCF-7), cancro do fígado humano (HepG2), cancro de pulmão humano (A549), e células de fígado normais humanos (L02) foram obtidos a partir do Centro celular da Academia chinesa de Ciências Médicas (Pequim, China). As células foram cultivadas em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e uma mistura de penicilina /estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO

2. Todas as experiências foram realizadas em células em fase de crescimento exponencial.

Imobilização de alvo em esferas magnéticas

O alvo para a selecção é um aptâmero péptidos 9-AA (peptide1) com a sequência de APDTRPAPG. A conjugação do alvo a esferas magnéticas foi realizado através de ligação cruzada de COOH e -NH2. Duas ug de peptide1 foi misturado com 5 × 10∧5 esferas magnéticas carboxilados, e incubadas com 200 uL de EDC (40 mM) à temperatura ambiente com agitação suave durante 2 h. As pérolas magnéticas foram então lavadas por três vezes com tampão de Hanks, e armazenadas a 4 ° C. método semelhante foi utilizado para conjugar as contas com outras substâncias, incluindo BSA e um 29-AA longos peptídeos com a sequência de GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP (peptide2).

biblioteca SELEX e primers

Uma biblioteca de ADN de partida consistindo de oligonucleotídeos 86-mer com 40 bases longas sequências de randomizados centrais foi sintetizado. A sequência de biblioteca é 5’AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-N40-CACAGACACACTACACACGCACA3 ‘, em que N representa um nucleótido de qualquer uma das aleatório A, G, C ou T. Uma marcado com FITC iniciador 5′ (5’-FITC AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTC-3 ‘) e um marcado com biotina iniciador 3 ‘(5′-B-TGTGCGTGTGTAGTGTGTCTGTG-3’) foram usados ​​na PCR para a síntese da dupla marcado, as moléculas de ADN de cadeia dupla, que foi então misturado com as esferas magnéticas revestidas com estreptavidina durante 10 min a temperatura do quarto. Após desnaturação em condições alcalinas (NaOH 0,1 M), o sentido de FITC-conjugado de ADN de cadeia simples (ADNcs) foi separada a partir da cadeia anti-sentido marcada com biotina de ADNcs com esferas magnéticas revestidas com estreptavidina e utilizados para selecção aptâmero.

seleção in vitro de aptâmeros de ligação ao alvo

Os procedimentos de selecção foram os seguintes. A piscina ADNcs (200 pmol) foi aquecida primeiro a 95 ° C durante 5 min e depois arrefeceu-se imediatamente até 0 ° C, em tampão (tampão de Hanks) de ligação durante 15 min antes de ligar a sequências alvo. Para reduzir a interferência de fundo, 0,1 mg /ml de DNA de esperma de salmão e 1 mg /ml de BSA foram adicionados ao tampão de ligação. Na ronda de selecção inicial, as esferas revestidas com peptide1 foram suspensos em 200 ul de tampão de ligação contendo 200 pmol de ADNcs aleatoriamente. Após incubação da mistura a 37 ° C durante 30 min com agitação suave, os oligonucleótidos não ligados foram removidos por lavagem quatro vezes com 500 ul de tampão de ligação. Subsequentemente, os oligonucleótidos ligados a grânulo misturas foram amplificados por PCR com FITC ou iniciadores marcados com biotina (25 ciclos de 40 seg a 94 ° C, 30 seg a 65 ° C, 40 seg a 72 ° C, seguido de 10 min a 72 ° C, a polimerase Taq e os dNTP foram obtidos a partir de Takara). O dsDNA resultante de PCR foi separado em ADNcs através do procedimento descrito acima. O sentido selecionado ssDNA separada da cadeia de DNA antisense biotinilado por pérolas magnéticas revestidas com estreptavidina foi usado para a próxima rodada de SELEX. Após várias rodadas de seleção, a piscina ssDNA selecionado foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores não modificados e clonados em Escherichia Coli com o kit de clonagem TA para sequenciamento de DNA.

A citometria de fluxo análise

Para monitorar o enriquecimento de candidatos de aptâmeros após selecção, a piscina ADNcs marcado com FITC foi incubada com esferas magnéticas revestidas com peptide1 em 200 ul de tampão de selecção contendo 10% de FBS a 37 ° C durante 30 min. As esferas foram lavadas duas vezes com 0,5 ml de tampão de ligação e, em seguida, suspenso em 0,2 ml de tampão de ligação. A fluorescência de FITC foi determinada com um citómetro de FACScalibur (Accuri C6, EUA). A biblioteca de ADNcs randomizado marcado com FITC foi utilizada para gerar o sinal de controlo.

A afinidade de ligação dos aptâmeros foi determinada por incubação de pérolas magnéticas revestidas com peptide1 com concentrações variáveis ​​de aptâmero marcado com FITC em 200 ul de tampão de ligação a 37 ° C durante 30 min. As esferas foram lavadas duas vezes com 0,5 ml de tampão de ligação, suspensas em 0,2 ml de tampão de ligação, e submetido a fluxo de citometria de análise. A biblioteca de ADNcs não seleccionada marcado com FITC foi utilizada como um controlo negativo para determinar a ligação não específica. Todas as experiências de ensaio de ligação foram repetidos três vezes. A intensidade média de fluorescência de alvo marcada por aptâmeros foi usada para calcular a ligação por subtracção da intensidade de fluorescência média de ligação não específica de ADN da biblioteca não seleccionada [17] específico. As constantes de dissociação em equilíbrio (

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d), da interacção aptâmero-peptide1 foram obtidos ajustando a dependência da intensidade de fluorescência de ligação específica sobre a concentração dos aptâmeros com a equação Y = B X max /(Kd + X).

para avaliar a ligação de aptâmeros para alvo específico, o aptâmero FITC foi incubada separadamente com peptide1-, peptied2-, ou esferas magnéticas BSA-revestidos. As esferas foram lavadas duas vezes com 0,5 ml de tampão de ligação, suspenso em 0,2 ml de tampão de ligação, e analisadas por citometria de fluxo. Para avaliar aptâmero ligação a células, as células foram raspadas do frasco de cultura e lavou-se com tampão de Hanks. O aptâmero marcado com FITC foi incubada com 10∧5 de qualquer das células MCF-7, A549, HepG2 ou L02 células em tampão de ligação a 37 ° C durante 30 min. As células foram então lavadas três vezes com tampão de Hanks e analisados ​​com cytometrey fluxo.

células e transfecção siRNA

As células A549 foram semeadas em placas de 6 poços a 1-3 x 10

5cells /assim, cultivadas em meio isento de antibiótico durante a noite, e transfectadas com MUC1 ou ARNsi de controlo [18], utilizando Lipofectamine 2000 em Opti-MEM I meio de soro reduzido de acordo com as instruções do fabricante (Invitrogen Life Technology, Inc.). Após 72 horas, as células foram colhidas e coradas com FITC aptâmero para ensaio de citometria de fluxo, e os lisados ​​celulares foram preparados para análise de imunotransf erência.

análise Western blot

Os lisados ​​foram preparados a partir de células confluentes. Quantidades iguais de proteína foram separadas por SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. Os imunoblots foram sondadas com anticorpo anti-MUC1. Os imunocomplexos foram detectados com anticorpos secundários conjugados com peroxidase de rábano e quimioluminescência aumentada (ECL).

Carregamento de aptâmero com doxorrubicina

aptâmeros foram primeiramente aquecida a 95 ° C durante 5 min e depois arrefeceu-se imediatamente a 0 ° C em água durante 15 min. Os aptâmeros foram incubadas numa solução aquosa de doxorrubicina (3 nM) durante 1 hora numa placa de 96 poços pretas em vários aptâmero /DOX proporções molares. O espectro de fluorescência da doxorrubicina foi então examinada por um analisador Synergy4 (λEx = 488 nm, λEm = 500-700 nm). Marcado com FITC Apt-Dox ou Apt-Dox foram incubadas com células A549 em tampão de ligação a 37 ° C durante 30 min. As células foram então lavadas três vezes com tampão de Hanks e analisados ​​com cytometrey fluxo.

absorção celular de doxorrubicina

A absorção celular específica de Apt-Dox por células A549 MUC1-positivas foi estudado por varrimento de fluorescência confocal microscopia (Perkin Elmer Ultraview, EUA) e citometria de fluxo. células HepG2 foi utilizado como um controlo de MUC1-negativo. As células foram deixadas a aderir a uma lamela de vidro durante 24 h. As células foram então incubadas com 1,5 uM de Dox ou Aptâmero-Dox durante 2 h a 37 ° C. Depois de ser lavado duas vezes com tampão de Hanks, as células foram fixadas com formaldeído a 4% durante 10 min e analisadas por microscopia de varrimento de fluorescência confocal.

Para análise de citometria de fluxo, as células foram raspadas a partir do frasco de cultura e lavou-se duas vezes com tampão de Hanks. As células foram incubadas com 1,5 uM ou Dox Aptâmero-Dox durante 4 h a 37 ° C, e lavou-se duas vezes com tampão de Hanks. As células foram então fixadas com formaldeído a 4% durante 10 min e analisadas com cytometriy fluxo.

MTS ensaio de viabilidade celular

Para avaliar a citotoxicidade de Apt-Dox ou Dox contra A549 e células HepG2, ambas as linhas celulares foram primeiro cultivados em placas de 96 poços, e, em seguida, co-incubou-se a 37 ° C com Apt-Dox, Dox, ou aptâmero a uma concentração de 3 uM, durante 4 h. As células foram lavadas com tampão de Hanks por duas vezes, e foram cultivadas durante mais 48 h. Depois, MTS ensaio (Promega, EUA) foi utilizado para determinar a viabilidade celular por protocolo padrão descrito pelo fabricante.

Estatísticas

A análise estatística foi realizada utilizando Statistical Analysis System (SAS, Versão 9.2 ). One-way ANOVA com diferença mínima significativa de Fisher (LSD) pós comparações hoc no intervalo de confiança de 99% foi utilizado para comparações estatísticas. Todos os dados são apresentados como um valor médio com o seu desvio padrão indicado (média ± SD).

Resultados

selecção Aptamer e caracterização

O núcleo da proteína extracelular de MUC1 é feita -se de um número variável de uma sequência de repetição em tandem altamente conservado composto por 20 ácidos aminados (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) [19]. Entre a repetição em tandem, o APDTRPAPG sequência tinha sido identificado como o péptido epitopo mais imunodominante [20], e foi utilizado como alvo para a selecção aptâmero MUC1 em pesquisas anteriores [15]. Aqui neste estudo, também utilizou este peptídeos como o alvo em nosso processo SELEX. Os péptidos foram alvo conjugado de forma covalente a esferas magnéticas usando EDC como catalisador. Durante cada ronda de selecção, as esferas foram incubadas com piscina ADNcs marcado com FITC, e o enriquecimento de aptâmeros foi monitorizada por citometria de fluxo. Em comparação com o ADN aleatórias a partir do conjunto da biblioteca, uma quantidade crescente de ADNcs obrigado a atingir-pérolas magnéticas revestidas após cada ronda de selecção (Fig. 1). Os aptâmeros foram subsequentemente clonadas, e os clones foram analisados ​​50 para posterior caracterização. Entre estes clones, um designado apatmer MA3 mostrou relativamente elevado de ligação para os péptidos alvo de MUC1. A sequência de ADN do aptâmero é MA3 5′AACCGCCCAAATCCCTAAGAGTCGGACTGCAACCTATGCTATCGTTGATGTCTGTCCAAGCAACACAGACACACTACACACGCACA3′.

Compared com o conjunto de ADN aleatória de partida (histograma sombreado), citometria de fluxo revelou um aumento na intensidade de fluorescência de aptâmeros ligado ao péptido MUC1 (APDTRPAPG) após a ciclos de selecção terceiro (curva cinzenta) e para trás (a curva de preto).

especificidade de ligação é importante para a avaliação do desempenho aptâmero. Como a albumina é a proteína mais abundante no sangue, foi examinada a ligação do aptâmero MA3 a albumina. grânulos albumina ou péptidos de MUC1 revestidos foram incubados com MA3 marcado com FITC e analisadas por citometria de fluxo. ADN aleatório não seleccionada a partir do conjunto da biblioteca foi utilizado como controlo. Como apresentado na Figura 2, o aptâmero MA3 gerada uma ligação significativa aos péptidos de MUC1 (Fig. 2a), mas uma ligação a BSA semelhante à gerada pelo DNA aleatório (Fig. 2B) relativamente fraca. Os resultados sugerem que, entre os péptidos de MUC1 e albumina, o aptâmero MA3 exibiu uma especificidade de direccionamento para o ex. Como comparação, experimentos similares foram conduzidos para uma outra aptâmero MUC1, S2.2, que teve o menor

K

d entre todos os aptâmeros MUC1 publicados [15], [16]. Os resultados mostraram que enquanto S2.2 poderia ligar-se a péptidos de MUC1 (Fig. 2C), também ligado à albumina até certo ponto (Fig. 2D). Os dados indicaram que, em comparação com S2.2, MA3 tinha uma reactividade cruzada inferior a albumina.

grânulos MUC1-péptido (A) tratadas com MA3. grânulos (B) de BSA tratadas com MA3. (C) os grânulos de MUC1-péptido tratado com S2.2. grânulos (D) de BSA tratadas com S2.2. Os histogramas a cheio representam os sinais fluorescentes de controlo gerados pelo ADN aleatório marcado com FITC a partir do conjunto da biblioteca.

Para avaliar quantitativamente a afinidade de ligação do aptâmero ao MUC-1, os grânulos revestidos com os péptidos de MUC1 foram incubadas com FITC marcado com MA3 de várias concentrações (Fig. 3A). Utilizando a análise de regressão não-linear, o aptâmero verificou-se ter uma

K

d de 38,3 nM. Para avaliar ainda mais se o aptâmero MA3 se ligaria a estrutura MUC1, também examinámos a sua ligação a uma péptidos 29-AA (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP) contendo toda a sequência de repetição em tandem (TAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGS) que fez-se o núcleo da proteína MUC1 extracelular. Os péptidos 29-AA foram conjugados de forma covalente a esferas magnéticas, as quais foram incubadas com MA3 marcado com FITC e analisadas por citometria de fluxo. ADN aleatório marcado com FITC a partir do conjunto da biblioteca foi utilizado como controlo. Como mostrado na Fig. 3B, MA3 gerado um sinal de fluorescência que foi significativamente mais potente do que o ADN aleatório, o que indica que o aptâmero também podia ligar-se a uma estrutura que contém toda a sequência de repetição em tandem de MUC1. Uma vez que o domínio extracelular da proteína MUC1 núcleo é feito principalmente das repetições em tandem, é possível que o aptâmero MA3 pode reconhecer a estrutura de MUC1 expostos na superfície de células tumorais que expressam MUC1.

(A) Ensaio Quantitativo da afinidade entre marcado com FITC MA3 e o epitopo MUC1 (APDTRPAPG). (B) A análise de citometria de fluxo da ligação entre marcado com FITC MA3 e o péptido MUC-1 26-AA (GSTAPPAGHGVTSAPDTRPAPGPGSTAPP). O histograma preenchido é o fundo de controle de fluorescência gerada por FITC DNA casual da piscina biblioteca.

MA3 aptâmero liga selectivamente a células tumorais que expressam MUC1

Para avaliar se o aptâmero MA3 se ligar a células cancerosas que expressam MUC1, marcado com FITC MA3 foi incubada com um dos enantiómeros (A549 ou MCF7) MUC1-positivos [21], [22] ou o MUC1-negativas de linhas celulares (HepG2 ou L02) [21], [23]. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo, utilizando as células incubadas com o ADN aleatório marcado com FITC como controlo. Os perfis de citometria de fluxo estão apresentados na Figura 4. Para as linhas de células positivas de MUC1-A549 e MCF7 tratamento, MA3 sinais de fluorescência geradas que eram significativamente mais potente do que a de tratamento de ADN aleatório (Fig. 4A e B). No entanto, para as linhas de células de MUC1-negativa HepG2 e L02, MA3 tratamento resultou em sinais de fluoresccia que eram semelhantes à do tratamento ADN aleatório (Fig. 4C e D). Os resultados indicaram que o aptâmero MA3 poderia se ligam preferencialmente a células de cancro de MUC1-positiva, e que o aptâmero pode reconhecer a estrutura de MUC1 nestas células.

Os histogramas foram gerados após incubação MA3 marcado com FITC com A549 (A ), D), as células MCF-7 (B), HepG2 (C), e (L02, respectivamente. Os histogramas a cheio representam os sinais de controlo gerados por fluorescência de ADN aleatório marcado com FITC a partir do conjunto da biblioteca.

expressão MUC-1 influencia a ligação do aptâmero para células tumorais

Para investigar ainda mais a ligação do aptâmero para as células do tumor de MUC1-positiva, a expressão da proteína MUC1 em A549 e células HepG2 foram avaliadas por western blot com o anticorpo anti-MUC1. Conforme apresentado na figura 5A, enquanto que as células A549 expressa proteína MUC1 em quantidade suficiente, as células HepG2 não o fez, sugerindo que, de facto A549 foi uma linha de células de MUC1-positiva e que HepG2 foi uma linha de células de MUC1-negativo. Os resultados estão de acordo com vários estudos publicados, que analisou exaustivamente a expressão da MUC1 em várias linhas celulares e claramente identificados A549 como MUC1-positivas e HepG2 como linha de MUC1-negativas células [18], [24].

(A) Western blots de extractos de proteína a partir de células A549, células HepG2, as células A549 tratadas com ARNsi de controlo, e as células A549 tratadas com ARNsi de MUC1, respectivamente. A actina também foi transferido para servir como controlo. (B e C) Citometria de fluxo avaliação da apatamer de ligação a células A549 tratadas com ARNsi de MUC1 (B) ou ARNsi de controlo (C). Os histogramas a cheio representam os sinais de controlo gerados por fluorescência de ADN aleatório marcado com FITC a partir do conjunto da biblioteca.

Para avaliar a influência da expressão MUC-1 sobre o aptâmero de ligação a células-MUC1 positivo, utilizou-se proteína MUC1 siRNA que tinha sido previamente mostrado capaz de derrubar a expressão MUC1 [18]. O siARN foi transfectado para as células A549-MUC1 positivo, e foi confirmada por Western blot com o que poderia regular negativamente a expressão de MUC-1 (Fig. 5A). As células A549 foram tratadas com ARNsi de MUC1 ou um ARNsi de controlo, incubada com aptâmero marcado com FITC, e avaliadas por citometria de fluxo. Como apresentado na Figura 5B e C, a ligação às células aptâmero foi significativamente reduzida após a infra-regulação da expressão de MUC-1 (Fig. 5B), ao passo que a ligação às células tratadas com ARNsi de controlo não foram afectados (Fig. 5C). Os resultados sugerem que a expressão de MUC-1 em células alvo influenciado afinidade do aptâmero a estas células, e que a perda de proteína MUC1 poderia reduzir a ligação significantl aptâmero

Y

.

carregando o aptâmero com Dox

a fim de entregar Dox para as células do tumor de MUC1-positivo, um aptâmero-doxorrubicina complexo (Apt-Dox) foi formado por intercalando doxorrubicina na estrutura do DNA do aptâmero MA3. Para avaliar se Dox foi de fato incorporado em MA3, fizemos uso do fenômeno que a fluorescência da Dox seria extinta após intercalando no DNA [25]. Especificamente, foram realizados estudos entre MA3 e Dox, e espectroscopia de fluorescência empregada de ligação para avaliar o sinal fluorescente gerada pela doxorrubicina. Como mostrado na Figura 6A, foi observada uma diminuição sequenciais no espectro de fluorescência nativa de Dox quando uma concentração fixa de Dox foi incubada com uma proporção molar de aumentar o aptâmero MA3. Quando o aptâmero /DOX razão molar atingiu 0,1, o espectro de fluorescência de DOX no nível mais baixo e não mudar mais, o que indica que mais DOX tinha incorporado na estrutura do ADN de MA3 a esta proporção de aptâmero /DOX.

(a) espectro de fluorescência da solução de doxorrubicina misturado com o aumento da razão molar do aptâmero MA3 (de cima para baixo: 0, 0,001, 0,003, 0,005, 0,01, 0,03, 0,1 e 1). células (B) A549 tratadas com FITC aptâmero MA3. células (C) A549 tratadas com FITC Apt-Dox. Os histogramas a cheio representam os sinais de controlo gerados por fluorescência de ADN aleatório marcado com FITC a partir do conjunto da biblioteca.

Para investigar se a intercalação de doxorrubicina em aptâmero iria interferir com a afinidade do aptâmero para as células do tumor de MUC1-positivos , a ligação de Apt-Dox complexo para células A549 foi avaliada com citometria de fluxo, e em comparação com a de MUC1 sozinho aptâmero. Como mostrado na Figura 6B e C, Apt-Dox complexo (Fig. 6C) tinha uma afinidade para as células A549 que era semelhante ao MUC-1 aptâmero sozinho (Fig. 6B). Os resultados sugeriram que a intercalação de doxorrubicina em MUC1 aptâmero não interferiu significativamente com a ligação do aptâmero para as células do tumor de MUC1-positiva.

aptâmeros como veículos para a entrega selectiva de doxorrubicina a células cancerosas positivas de MUC1

A absorção não selectivo de Dox livre por ambas as células normais e de cancro é a principal causa para os seus efeitos adversos contra o tecido normal. Quando Dox está intercalado na estrutura do DNA do aptâmero MUC1 (Apt-Dox), o complexo pode ligar-se preferencialmente a células de cancro de MUC1-positiva. Para testar este postulado, as propriedades de fluorescência de doxorrubicina foram utilizadas para avaliar a absorção de drogas pelas células quer MUC1-positivas (A549) ou MUC1-negativa (HepG2). As células foram incubadas separadamente com Dox livre ou Apt-Dox e analisadas por microscopia confocal. Os resultados mostraram que a fluorescência vermelha do fármaco foi igualmente forte nas duas linhas de células tratados com Dox livre (Fig. 7A e B), indicando que a absorção de livre Dox por estas células foi não selectiva. Em contraste, quando as células foram tratadas com o APT-Dox, a fluorescência em células A549 MUC1-positivas foi significativamente mais elevado do que em células HepG2 MUC1-negativa (Fig. 7C e D), e que a absorção do fármaco por células HepG2 foi marcadamente diminuída. Os resultados sugeriram que a APT-Dox exibiram especificidade celular e pode ser feita selectivamente pelas células de MUC1-positivos. Interessantemente, a distribuição intracelular do fármaco em células A549 foi principalmente limitada aos núcleos com livre Dox, mas estendido para o citoplasma na definição de Apt-Dox, o que sugere que os mecanismos para a absorção de livre Dox e Apt-Dox pode ser diferente.

(a-D) a laser imagens de microscopia confocal de A549 e células HepG2 após incubação com doxorrubicina livre (a e B) ou Apt-Dox (C e D) durante 2 horas. (E e F) Citometria de fluxo perfis histograma de A549 (E) e células HepG2 (F) após incubação com qualquer livre doxorrubicina (curvas pretas) ou apt-Dox (curvas de cinza). Os histogramas preenchidos são os sinais de controlo gerados por células não tratadas.

Para estudar mais aprofundadamente se Apt-Dox poderiam ser tomadas selectivamente pelas células positivas MUC1, citometria de fluxo também foi empregado para monitorar a fluorescência gerada pela doxorrubicina após incubação das duas linhas celulares com acesso Dox ou Apt-Dox. Para as células A549-MUC1 positivo, os sinais fluorescentes gerados por Dox livre ou Apt-Dox foram semelhantes (Figura 7E.); ao passo que para as células HepG2 MUC1-negativa, o sinal fluorescente gerado pela APT-Dox era notavelmente mais baixo do que a gerada pela livre Dox (fig. 7F). Os resultados novamente sugeriu que Apt-Dox poderiam ser tomadas selectivamente pelas células cancerosas positiva MUC1. Tomados em conjunto, a citometria de fluxo e microscopia dados indicam que o aptâmero MA3 pode servir como um veículo para a entrega direccionada de células cancerosas para Dox-MUC1 positivo.

Apt-Dox reduzida selectivamente citotoxicidade para as células cancerosas de MUC1-negativas

Uma vez que a captação de doxorrubicina foi reduzida em células de MUC1-negativo tratados com Apt-Dox, é possível que a citotoxicidade para estas células também seria diminuído. Para testar o postulado,

in vitro

citotoxicidade causada por Apt-Dox ou livre Dox foi comparada em HepG2 e linhas de células A549. Como apresentado na Figura 8A, as células HepG2 para MUC1-negativo, a citotoxicidade gerado pela APT-Dox foi de facto diminuiu em comparação com a gerada pelo livre Dox (P 0,01). No entanto, para as células A549 MUC1-positivo, não foi detectada diferença entre a citotoxicidade gerado pelo Apt-Dox ou livre Dox (Fig. 8B). Os resultados sugerem que o APT-Dox tende a reduzir o dano a células de MUC1-negativa, mantendo a eficácia da doxorrubicina contra células-MUC1 positivo. Deve notar-se que só aptâmero era não tóxica no sentido de ambas as linhas de células, indicando que a própria aptâmero era relativamente seguro para as células e que a citotoxicidade foi causado principalmente por doxorrubicina.

O HepG2 (A) e A549 (B células) foram avaliados com um ensaio MTS padrão após 48 h de incubação adicional (média ± SD, n = 6).

Discussão

a eficácia da quimioterapia é muitas vezes limitada pela efeitos adversos dos agentes citotóxicos que danificam tanto as células normais câncer e. Uma estratégia para reduzir os efeitos adversos da quimioterapia está orientada de administração de fármaco para as células cancerosas. MUC-1 é considerada um alvo valioso para a quimioterapia anti-cancro guiada-ligando devido à sua sobre-expressão na maioria dos adenocarcinomas. Aqui neste estudo, utilizando a técnica SELEX e um epitopo de péptido de MUC1 como alvo, desenvolvemos um romance MUC1 aptâmero (MA3) com um

K

d de 38,3 nM. Descobrimos que MA3 poderia ligar-se especificamente a células de cancro de MUC1-positivo, com o mínimo de reactividade cruzada a albumina (Fig. 1,2,3,4). Além disso, um complexo de fármaco-aptâmero (Apt-Dox) foi formado por intercalantes doxorrubicina na estrutura de ADN da MA3 aptâmero (Fig. 6).