Abstract
Background
Lung tumores são a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo e o paclitaxel provou ser útil para pacientes com cancro do pulmão, no entanto, resistência adquirida é um grande problema. Para ultrapassar este problema, uma alternativa promissora é a utilização de Androstano constitutiva do receptor (CAR) ligandos em combinação com agentes quimioterapêuticos contra células cancerosas. Portanto, queremos elucidar os efeitos de ligantes carro na eficácia antineoplásica de paclitaxel em células de câncer de pulmão.
Metodologia /Principais Achados
Os resultados de ensaios de viabilidade celular expondo agonista carro ou inverse- agonista de células de cancro do pulmão de ratinho e humanas modulado o efeito antineoplásico de paclitaxel. Os agonistas CAR aumentado o efeito de paclitaxel em 6 de linhas celulares de cancro do pulmão 7, enquanto que o agonista inverso não teve efeito na citotoxicidade do paclitaxel. Curiosamente, o agonista MCAR TCPOBOP aumentou a expressão de dois genes supressores de tumores, ou seja, WT1 e MGMT, que foram melhoradas de forma aditiva em células tratadas com agonista CARRO em combinação com paclitaxel. Além disso,
in silico
análise mostrou que tanto TCPOBOP paclitaxel e agonista CAR encaixado na estrutura MCAR mas não o androstenol agonista inverso. O paclitaxel, por si só aumenta a expressão de CAR em células cancerosas. Por fim, analisamos a expressão de CAR em dois estudos independentes público do Cancer Genome Atlas (TCGA) de não pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC). CAR é expresso em níveis variáveis em amostras de NSCLC e nenhuma associação com a sobrevida global foi anotada.
Conclusões /Significado
Em conjunto, nossos resultados demonstraram que os agonistas CAR modular a eficácia antineoplásica de paclitaxel em rato e linhas celulares de cancro humano. Este efeito foi provavelmente relacionado com a expressão aumentada de dois genes supressores de tumor, viz. WT1 e MGMT. A maioria dos casos de NSCLC presente expressão do gene CAR transformando-o possível especular o uso de modulação CAR por ligantes juntamente com Paclitaxel em terapia NSCLC
Citation:. Fukumasu H, Rochetti AL, Pires PRL, Silva ER, Mesquita LG, Strefezzi RF, et ai. (2014) Constitutivo Androstano ligandos do receptor modular a eficácia antitumoral de paclitaxel em não-pequenas células do cancro do pulmão de células. PLoS ONE 9 (6): e99484. doi: 10.1371 /journal.pone.0099484
editor: Rubi John Anto, Rajiv Gandhi Centro de Biotecnologia, Índia |
Recebido: 06 de agosto de 2013; Aceito: 15 de maio de 2014; Publicação: 24 de junho de 2014
Direitos de autor: © 2014 Fukumasu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores graças Fundação de apoio à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) pelo apoio financeiro (processo número:. 2008 /56584-2; 2009 /11081-6; 2010 /00535-3; 2010 /05650-5; 2011 /05690- 0. os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
competir interesses:.. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
tumores Introdução
pulmonares são a principal causa de mortes por câncer em todo o mundo, e eles são responsáveis por cerca de 1,2 milhões de mortes por ano [1]. nos últimos 30 anos, vários avanços na terapia do cancro do pulmão têm surgido com o melhoria da imunoterapia, radioterapia e quimioterapia, no entanto, o ganho no tempo de sobrevivência de pacientes com cancro do pulmão continuam a ser modesta [2]. O tratamento para o cancro do pulmão depende do tipo histológico, a presença de metástases e estado geral do paciente. As abordagens de tratamento mais comuns incluem uma combinação de cirurgia (quando os tumores são resectable), radioterapia e quimioterapia. Relativamente a este último, a utilização de uma ou mais drogas citotóxicas, ao mesmo tempo, tais como taxanos, compostos de platina, e /ou análogos de nucleósidos é o mais comum. Geralmente, a quimioterapia de primeira linha para o cancro avançado do pulmão de células não pequenas (NSCLC) emprega um protocolo com um taxano (paclitaxel ou docetaxel) associado com a cisplatina ou gemcitabina [3].
cancros normalmente presente como uma população heterogénea de células malignas, com alguns que são sensíveis à droga e alguns que são resistentes aos medicamentos. A quimioterapia citotóxica mata as células sensíveis a fármacos, mas não afecta as células resistentes a fármacos que são, em geral, um estado dormente [4]. Como o tumor começa a crescer novamente, a quimioterapia, muitas vezes falha porque as células tumorais remanescentes são principalmente fármaco-resistentes [5]. O paclitaxel, uma droga antineoplásica amplamente utilizado para o cancro do pulmão, é um agente de ligação à tubulina que bloqueia a progressão da mitose, em última análise conduzindo à morte celular por apoptose [3]. Este taxano tem provado ser um medicamento útil para os pacientes com cancro do pulmão; No entanto, como acontece com outros medicamentos quimioterápicos, a resistência adquirida por células cancerosas é comumente observada.
Portanto, aumentar a eficácia do paclitaxel é altamente desejável. Chen
et al
. [6] considerada uma alternativa promissora envolve a utilização de CARRO (Constitutiva Androstano receptor, NR1I3) e PXR (receptor pregnano-X, NR1I2) ligandos em combinação com agentes quimioterapêuticos que activam PXR e CARRO para superar, ou pelo menos atenuar a resistência multi-droga (MDR) em células cancerosas. Curiosamente, o paclitaxel é um activador potente de PXR e indutor de eliminação da droga P-gp-mediada [7]. Além disso, vários medicamentos quimioterápicos são modulados ou metabolizada pela enzima citocromo P450 CYP3A4 [8], um alvo transcricional conhecida de PXR ativado e CAR [9], [10].
CAR e PXR são receptores nucleares esteróides conhecido como xenosensors mestre [11], que são capazes de reconhecer a compostos estruturalmente diversos, [12]. Ambos os receptores, quando activados por ligandos, translocar para o núcleo e induzir a transcrição de vários genes envolvidos no metabolismo de drogas e excreção, metabolismo da glicose e lípidos e regulação hormonal [13], [14]. Recentemente, a importância de PXR na patogênese do câncer e MDR de tumores tem sido um assunto de debate, mas não há consenso sobre o seu papel específico foi alcançado até agora [15], [16]. Semelhante a PXR, o papel do CAR no cancro também é controversa. Em no um lado, CAR foi determinada como sendo essencial para a promoção de tumores do fígado pelo fenobarbital [17], [18], e no outro carro lado mostrou-se um novo alvo terapêutico para o cérebro e tumores hematopoiéticos [19], [20 ]. Portanto, nosso objetivo foi elucidar a importância da modulação CAR por seletivamente ligantes e determinar os efeitos a jusante sobre a eficácia antineoplásica de um dos medicamentos quimioterápicos usados mais comuns para o câncer de pulmão.
Material e Métodos
Reagentes e linhas celulares
O paclitaxel, CITCO, TCPOBOP, androstenol e MTT foram obtidos a partir de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA). Meios e reagentes para a cultura celular foram adquiridos a partir de Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA). Trizol, iniciadores oligodT, enzima Superscript II e o mastermix Poder SYBR Green eram da Life Technologies (Grand Island, NY, EUA). Outros reagentes eram de grau analítico. As linhas de células utilizadas nesta experiência foram a linha de células de rato E9 [21] e a linhas de células de humano A549, H2023, H460, H2030, H1792 e H23 [22]. Todas estas linhas celulares foram um presente do Dr. Lucy M. Anderson do Laboratório de Comparativo Carcinogênese no Laboratório Frederick Nacional para Pesquisa do Câncer (Estados Unidos da América).
experimentos celulares com rato e de células de câncer de pulmão humano linhas
linha de células de câncer de pulmão do rato E9 foi originado a partir da transformação espontânea de células epiteliais do pulmão não neoplásicas imortalizadas isolados de ratinho BALB /c [23]. Estas células foram cultivadas em CMRL 1066 médio (Invitrogen, Nova Iorque, NY), suplementado com 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen), 200 mM de L-glutamina (Invitrogen) e um cocktail de antibióticos (100 unidades /ml de penicilina e 100 mg /ml de estreptomicina; Invitrogen) numa incubadora humidificada a 37 ° C e 7% de CO
2. linhas celulares de cancro do pulmão humano foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Nova Iorque, NY), com 10% de soro fetal de bovino (Invitrogen) mais 2% de L-glutamina (Invitrogen) e 1% de Pen-Strep (Invitrogen) numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO
2.
Determinação da MCAR ligandos efeitos sobre a viabilidade celular.
E9 células foram semeadas a 2000 /poço em placas de 96 poços (Corning, EUA ), contendo 100 ul de meio suplementado, tal como descrito. Após 24 h, o meio foi mudado e descarregada com novos meios de comunicação com adição de diferentes concentrações de agonista CARRO (TCPOBOP) ou agonista inverso CARRO (androstenol) a partir de 10
-4 uM a 10 uM. Quarenta e oito horas mais tarde, 11 ul de ácido 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil tetrazólio (MTT – 5 mg /mL) foi adicionado a cada poço e foram produzidos cristais de formazano ao longo de um 2 h O período de incubação. O meio foi removido de cada poço e 100 ul de HCI 0,4 N em álcool isopropílico foram adicionados para dissolver os cristais. A densidade óptica a 540 nm foi medida num Fluorstar Optima (BMG Labtech, Alemanha).
Determinação da meia concentração inibitória máxima de paclitaxel (IC50).
E9 células foram usadas com o mesmo protocolo descrito acima, com concentrações desde 1 nM até 1600 nM de paclitaxel.
Avaliação dos efeitos dos ligandos na citotoxicidade MCAR paclitaxel.
E9 células foram usadas com o mesmo protocolo descrito acima, em que os ligandos foram adicionado em simultâneo com o IC50 de paclitaxel e a viabilidade celular foi avaliada como descrito.
Determinação dos efeitos ligandos HCAR sobre a viabilidade celular, o cálculo da IC50 de paclitaxel e experiências de co-exposição.
Todos estes experimentos utilizando linhas de células cancerosas humanas foram realizadas como descrito para as células cancerosas do mouse E9 com condições específicas para a cultura de células como descrito.
análise da MCAR
a expressão gênica
células E9 foram semeadas a 3.10
5 células /placa em placas de T25 (Corning, EUA), sob as mesmas condições descritas acima, com a adição de TCPOBOP (10 uM), Androstenol (10 uM), TCPOBOP (10 uM) mais paclitaxel (IC50), Androstenol (10 uM) mais paclitaxel (IC50) ou DMSO-apenas para controlo. O ARN total foi extraído a partir de cinco repetições de cada tratamento e os controlos com Trizol seguindo as instruções do fabricante. As amostras de ARN foram então quantificadas (BioPhotometer, Eppendorf, Alemanha) e foi observada a proporção 260/280. Apenas foram utilizadas as amostras que apresentaram 1,7-2,0 e demonstrou boa qualidade (não degradado) após análise por electroforese em gel de agarose (1,5%, solução salina tamponada com Tris). Assim, 1 ug de RNA total foi transcrito de forma inversa com iniciadores oligodT e Superscript II em ADNc. Todos os iniciadores foram desenhados com o software Primer-3 [24] e foram corridos em BLAST [25] para verificar a ausência de alinhamentos locais com ADN e outras sequências de transcrito de ARN de rato. Poder SYBR Green foi utilizado para PCR em tempo real com iniciadores para MCAR (NM_009803.5; F: 5′-GGGCCTCTTTGCTACAAGAT-3 ‘; R: 5′-AGGTTTTTATGGAAGTGGAGGA-3′). O gene de manutenção utilizado foi o 18 s RNA ribossomal (NR_003278.3; F: 5’-CCTGCGGCTTAATTTGACTC-3 ‘; R: 5′-CTGTCAATCCTGTCCGTGTC-3’). As reacções foram realizadas num ABI Prism 7500 termociclador (Life technologies, Grand Island, NY, EUA) com o reagente de Master Mix de energia verde SYBR e a análise de dados de expressão genética relativa foi realizada de acordo com o método delta-delta-CT [26 ].
array PCR RT
análise 2 profiler
O RT
2 Profiler mouse oncogenes e genes supressores de tumor matriz PCR (PAMM-502Z, SABiosciences, EUA), contendo 84 genes que promovem oncogenesis, mais genes de limpeza e controlos, foi utilizado para analisar os efeitos de TCPOBOP mais a expressão do gene relacionados com o paclitaxel em células E9. As células foram semeadas e tratadas como descrito acima, o ARN total foi extraído com o RNeasy Mini Kit (Qiagen, EUA) e três repetições por tratamento onde agrupadas para análise (experiência realizada em duplicado). Pool de RNA foi transcritos de modo inverso com o kit First Strand (SABiosciences), combinado com o SYBR Green /ROX PCR master mix (SABiosciences), e adicionada a cada poço da placa de RT2 Profiler PCR, que contém o iniciador de pré-dispensado específico do gene conjuntos. A reacção foi realizada em um termociclador ABI Prism 7500. A análise dos dados foi baseada no método Ct, com normalização para quatro diferentes genes housekeeping. Dobre mudanças de 2X (para cima ou para baixo-regulação) foram considerados para análise.
In silico
análise para a ancoragem de ligantes MCAR e paclitaxel na estrutura MCAR
A análise computacional foi realizada utilizando a estrutura de cristal do receptor CARRO co-cristalizado com androstenol (1XNX APO) [27] e TCPOBOP (1XLS APO) [28]. ligandos-alvo do receptor de encaixe e foram preparados utilizando quimera [29]. A superfície molecular do alvo foi gerado com base no algoritmo de desenvolvimento [30]. geração Sphere foi realizada utilizando o algoritmo sphgen; as esferas foram distribuídos com dock6 e selecionados usando “spheres_selector”. geração grade foi realizada com grade, que é distribuído como um acessório para atracar [31]. Doca flexível foi usada para verificar a interacções entre o receptor alvo e produtos químicos CARRO [32]. Resultados obtidos por acoplamento foram visualizados e analisados em Chimera versão 1.4.1 (build 30365).
análise cBioPortal dos conjuntos de dados Cancer Genome Atlas
cBioPortal, uma ferramenta desenvolvida pelo Centro de Biologia Computations no Sloan Kettering, foi acessado no https://www.cbioportal.org/public-portal/[33], [34]. Dois conjuntos de dados foram utilizados neste trabalho: “adenocarcinoma pulmonar (TCGA, no prelo)” com 230 casos e o “Pulmão Carcinoma de células escamosas (TCGA, Provisória)” com 489 casos no momento da análise, Março de 2014. Ambos os estudos eram utilizado para avaliar a presença de mutações genéticas e alterações no número de cópias (CNA) ilustrados por “oncoprints”, expressão alterada mRNA e /ou metilação de DNA e curvas de sobrevida global dentro dessas alterações. Para determinar qual a amostra apresentou expressão do gene alterado o Z-score foi ajustado para 1,96.
A análise estatística
Os dados são apresentados como média ± desvio padrão salvo indicação em contrário. Graphpad Prism 5, para o Windows (GraphPad Software, EUA) foi utilizado para todas as análises estatísticas realizadas com testes não paramétricos como de Mann-Whitney e de Spearman. Two-way ANOVA foi utilizado para comparações entre os diferentes efeitos ligantes na viabilidade celular. A sobrevida global a partir de dados TCGA foram estimados com curvas de Kaplan-Meier e valores p Logrank pelo cBioPortal para o cancro Genomics [33], [34]. Diferenças significativas foram considerados quando p . 0,05
Resultados
Os ligantes de carro não são citotóxicos para as células de câncer de pulmão humanos mouse ou
Inicialmente, foram avaliados os efeitos citotóxicos de MCAR ligandos, incluindo o agonista e o TCPOBOP androstenol agonista inverso, em células de cancro de pulmão de rato E9. A exposição a TCPOBOP durante 48 h teve nenhum efeito sobre a viabilidade das células E9, mesmo numa concentração elevada (Figura 1). Por outro lado, o agonista inverso androstenol induziu um aumento dependente da dose na proliferação celular, com células de mais de 60% do que a do grupo de controlo na concentração elevada (P 0,0001; Fig. 1). Estes resultados sugerem que a utilização de agonistas MCAR em células de cancro do rato pode resultar em diferentes efeitos sobre a viabilidade celular, mesmo aumentando a proliferação celular como observado para androstenol.
(A) a viabilidade celular após 48 horas de diferentes concentrações do MCAR agonista TCPOBOP ou o androstenol agonista inverso MCAR. TCPOBOP não tem nenhum efeito sobre a viabilidade celular, mesmo na concentração mais elevada. Por outro lado, androstenol aumenta o número de células cancerosas E9 dose-dependente (* p 0,05 – two-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey para efeito do tratamento). (B) Efeitos de MCAR ligantes na eficácia anti-tumoral de paclitaxel (IC50). TCPOBOP aumenta a eficácia anti-tumor do Paclitaxel de viabilidade celular por diminuição significativa na 1-10 uM em comparação com apenas células tratadas com paclitaxel (p 0,05 – two-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey para efeito do tratamento). O androstenol elimina parcialmente a eficácia anti-tumoral de paclitaxel (p 0,05 – two-way ANOVA seguido pelo teste de comparação múltipla de Tukey para efeito do tratamento). (C) A expressão de genes de MCAR em células tratadas com ligandos sozinho, o paclitaxel por si só, ou em combinação. Ligantes não alterou a expressão do gene MCAR. Note-se que todos os paclitaxel tratados com grupos apresentaram aumento na expressão gênica MCAR comparado ao grupo controle (* p 0,05 – One way ANOVA).
Em seguida, realizamos experimentos semelhantes em seis linhas celulares de cancro do pulmão humano. Testou-se o agonista específico humano CARRO, CITCO, e o androstenol agonista inverso, apresentados quaisquer efeitos citotóxicos nestas linhas celulares. Nenhum efeito foi observado para CITCO ou Androstenol mesmo na maior concentração testada (p . 0,05 para todas as linhas celulares, a Fig S1).
Os agonistas CAR TCPOBOP e CITCO melhorar a eficácia antineoplásica de paclitaxel em ratinho e no homem células de câncer de pulmão
Nossa hipótese era que a modulação CAR por seus ligantes podem alterar a eficácia anti-tumoral de paclitaxel, um agente antineoplásico comumente utilizado para quimioterapia do câncer de pulmão em seres humanos. Em primeiro lugar, determinou-se a concentração de paclitaxel que inibiu 50% da viabilidade das células para cada linha celular (IC 50, Tabela 1). Usando esta concentração, o próximo avaliou os efeitos de agonistas de carro no efeito anti-tumor de Paclitaxel, expondo células cancerosas para paclitaxel mais diferentes concentrações de um agonista do carro ou agonista inverso.
Quando co células de cancro de pulmão de rato -exposed a diferentes concentrações de paclitaxel a TCPOBOP além da concentração inibitória (IC50), o agonista CARRO paclitaxel melhorada eficácia anti-tumor dependente da dose, reduzindo a viabilidade celular em quase 40%, quando comparada com a de células tratadas com paclitaxel sozinho (p 0,05; Fig. 1). Por outro lado, o agonista inverso androstenol reduziu os efeitos citotóxicos de paclitaxel em células E9 (p 0,05; Fig. 1). Estes resultados indicam que a modulação específica da CAR pela TCPOBOP agonista melhora a eficácia anti-tumoral de paclitaxel em células cancerosas E9.
Realizamos este experimento em seis linhas celulares de cancro de pulmão humano, onde o co-exposição do CAR humana ligandos foi avaliada quanto ao seu efeito sobre a citotoxicidade do paclitaxel. O agonista CARRO CITCO aumentou significativamente a eficácia de paclitaxel em cinco das seis células de cancro do pulmão humano testadas (p 0,05; Fig. 2). Por outro lado, o carro androstenol agonista inverso resultou em nenhuma diferença significativa em todas as linhas de células (p 0,05; Fig. 2). Estes resultados demonstram que os agonistas CAR aumentar o efeito antineoplásico de paclitaxel na maioria das linhas celulares de cancro de pulmão (de ratinho e humanos), tornando-os um foco interessante para posterior caracterização.
A viabilidade celular após 48-agonista Androstenol em combinação com paclitaxel. CITCO paclitaxel aumenta significativamente a citotoxicidade em cinco de seis linhas celulares (* P 0,05 – two-way ANOVA seguido por teste de comparação múltipla de Tukey para efeito do tratamento). Por outro lado, androstenol em combinação com paclitaxel não tem nenhum efeito em comparação com as células tratadas com paclitaxel.
paclitaxel aumenta a expressão MCAR
próxima avaliada wheter paclitaxel alterada MCAR a expressão do gene. Para este fim, as células expostas E9 para os seguintes tratamentos diferentes: 10 uM de TCPOBOP, 10 uM de androstenol, o IC50 do paclitaxel, ou uma combinação destes. Os nossos resultados mostraram que o tratamento com uma única TCPOBOP ou androstenol não teve efeito sobre a expressão do mRNA MCAR (Fig. 1). No entanto, quando as células foram tratadas com sozinho ou em combinação com TCPOBOP ou androstenol paclitaxel, um aumento na expressão MCAR foi observado independente do ligando (p = 0,0102; Fig. 1).
TCPOBOP e paclitaxel alterar supressor tumoral e os níveis de expressão de oncogenes
Outros experimentos foram realizados apenas com a linha celular de cancro de pulmão de rato E9. Foram avaliados os efeitos do paclitaxel sobre TCPOBOP e o perfil de 84 oncogenes e genes supressores de tumor a expressão do gene. Inicialmente, cinco genes foram cut-off de análise por apresentarem valores de CT superior a 35 e /ou foi detectada a presença de mais de um produto de PCR. A partir dos 79 restantes genes, o tratamento com paclitaxel alterou a expressão de genes de 10, com mudanças de dobragem de mais de 2 (Tabela 2). De acordo com os agrupamentos de genes funcionais a partir da matriz Rt2 Profiler PCR, paclitaxel a maioria dos genes regulados positivamente foram genes supressores de tumor, genes relacionados com apoptose, oncogenes ou genes que apresentam propriedades de oncogenes e genes supressores de tumor (Tabela 2).
a exposição de células E9 ao ligando de ratinho CARRO TCPOBOP aumentou a expressão de genes supressores tumorais dois: MGMT e WT1 (Tabela 2). Curiosamente, quando foi avaliada a expressão de genes de células tratadas com TCPOBOP mais paclitaxel (com a mesma concentração que aumenta o paclitaxel citotoxicidade), a expressão destes dois genes foi aumentada mais do que quando foram administrados apenas paclitaxel ou TCPOBOP, sugerindo um efeito aditivo sobre a expressão de genes destes genes. Além disso, a combinação de TCPOBOP com paclitaxel resultou na regulação negativa de dois oncogenes, ZHX2 e ESR1 (Tabela 2). Além disso, parece que a exposição combinada de células E9 para TCPOBOP e paclitaxel melhorada a assinatura de expressão do gene induzida por paclitaxel (Tabela 2). Tomados em conjunto, estes resultados estão em acordo com os acima descritos e explicar as propriedades moduladoras da TCPOBOP MCAR agonista sobre o efeito anti-tumoral de paclitaxel em células de cancro de pulmão de rato.
in silico análise mostra que o paclitaxel e TCPOBOP encaixar na estrutura MCAR
Alinhamento de estrutura e 1XLS 1XNX mostrou que o posicionamento do TCPOBOP agonista e o androstenol agonista inverso na estrutura MCAR são distintos (Fig. 3). O acoplamento de TCPOBOP foi realizada como controlo, e mostrou-se uma boa sobreposição dos TCPOBOP na estrutura de cristal de 1XLS (Fig. 3). O acoplamento utilizando a estrutura 1XLS revelou que o androstenol agonista inverso não pode ligar-se na posição do TCPOBOP agonista; androstenol mostrou uma grade de energia positiva (51,82), que é desfavorável para ligar dentro do receptor. A rede de energia de TCPOBOP e paclitaxel são, respectivamente, -49,34 e -125,53. Por outro lado, a estrutura de ancoragem utilizando 1XNX para orientar melhor a energia para a interacção receptor-ligando apontou para um possível segundo local no receptor CAR para TCPOBOP de ligação (Fig. 3) com uma grade de energia favorável (-32,01), semelhante à obtida para o androstenol (-40,44). O paclitaxel também mostrou a energia mais favorável e fechada valores de ligação de ligação em ambas as estruturas onde TCPOBOP androstenol ou foram usadas como um ligando guia de encaixe (Tabela 3), o que indica que o paclitaxel pode também ser um ligando MCAR.
A , D-Androstenol; B, E-Paclitaxel; C, F-TCPOBOP; G e H * androstenol e TCPOBOP superposição: Vista de superfície G- e vista para o fio H- de ligantes. Note-se que paclitaxel ancorado em ambas as estruturas MCAR.
caracterização CAR humana em células não pequenas amostras de câncer de pulmão a partir de dois estudos independentes
Nós caracterizado o estado de HCAR em NLSLC a partir de dois estudos com dados publicamente disponíveis através TCGA. No estudo adenocarcinoma, de 230 amostras, 17,8% dos casos (41/230) apresentaram alterações genéticas de HCAR, incluindo Copy Number Alterações (CNA), mutações ou a expressão do gene alterado (Fig. 4). Estas alterações não foram associados com a sobrevida global (OS, p = 0,40, Fig. S2). A maioria das amostras deste estudo apresentado com o aumento da metilação HCAR de acordo com a análise HM450 (Fig. 4). Corroborando estes dados, apenas 8% dos casos (19/230) apresentaram positiva do mRNA HCAR.
alterações e frequência de HCAR no estudo Lung Adenocarcinoma disponível a partir TCGA Genéticos (A). (B) Os mesmos dados do pulmão de células escamosas Carcinoma estudo disponível a partir TCGA. (C) a metilação do DNA vs expressão gênica de HCAR a partir de amostras Adenocarcinoma pulmonar de TCGA. (D) a metilação do DNA vs expressão gênica de HCAR de amostras de células de carcinoma de pulmão escamosas de TCGA. Ambos os conjuntos de dados apresentados altamente metilação do DNA e níveis variáveis de expressão de mRNA de NR1I3
Em seguida, foram utilizadas informações de outro estudo de TCGA em carcinoma de células escamosas do pulmão (LSCC, TCGA, dados provisórios -. 26/04 /2014). A frequência de alterações HCAR incluindo mutações, CNAs ou expressão do gene alterado (Fig. 4), foi de 8,2% (40/489), que não foi associada a OS (p = 0,81, Fig. S1). Semelhante ao estudo adenocarcinoma, a maioria das amostras apresentou com o aumento da metilação do DNA de HCAR (Fig. 4). Isto pode explicar porque apenas 7,4% de todos os casos apresentados, com a regulação positiva de ARNm de HCAR (36/489).
Com base nos resultados de ambos os estudos, é possível que a maioria das amostras de adenocarcinoma do pulmão e LSCC pacientes não apresentam alterações na expressão HCAR em relação ao emparelhado tecidos, não-cancerosas, o que poderia ser explicado pelos altos níveis de metilação encontrado em ambos os estudos.
Discussão
o cancro do pulmão continua a ser um grande problema para os sistemas de cuidados de saúde em todo o mundo, como a maioria dos casos envolvem pacientes com função composta pulmão, metástase, resistência a múltiplas drogas e os resultados pobres. A sobrevivência de pacientes com câncer de pulmão após a detecção do tumor é normalmente inferior a 5% em cinco anos [35]. Recentemente, a prova começou a mostrar que o carro pode ter um papel na terapia do cancro [19], [20]. Aqui demonstramos que a modulação carro específico por agonistas, mas não pelos agonistas inversos-, aumentou a eficácia anti-tumoral de paclitaxel em ambas as células de cancro de pulmão de murino e humanas. Este efeito foi acompanhado por a potenciação de uma assinatura a expressão do gene induzida por paclitaxel, quando se utiliza uma combinação de paclitaxel e TCPOBOP. Além disso, uma única exposição de células cancerosas a TCPOBOP aumentou a expressão de dois genes supressores de tumor (WT1 e MGMT), o que poderia corroboram a eficácia melhorada de paclitaxel em linhas celulares de cancro. tratamento com paclitaxel aumentou a expressão do gene CAR e encaixado na estrutura molecular do CAR
in silico
. Por fim, analisamos o perfil dos HCAR em dois estudos TCGA e notou que o carro poderia ser um alvo interessante para pacientes com NSCLC que recebem tratamento paclitaxel desde HCAR é expressa em amostras de tumor e não tem nenhuma associação com OS.
Chen
et al.
ligantes CAR recentemente consideradas como uma opção promissora para a quimioterapia combinada, com o objetivo de superar a MDR em células cancerosas [6]. Os resultados suportam esta proposição desde os ligantes carro não causar efeitos citotóxicos per se em células cancerosas; No entanto, quando os agonistas do CAR foram usadas em combinação com paclitaxel, um efeito modulatório interessante emergiu. Este efeito citotóxico melhorada também foi observada em cinco de seis diferentes linhas de células de cancro humano desde CITCO, o agonista HCAR, mostrou um efeito semelhante sobre a eficácia de paclitaxel. Por isso, apoiamos a hipótese de Chen
et al.
Que a modulação CAR pode ser realmente importante para quimioterapia do cancro [6].
O papel exato do CAR na carcinogênese e terapia do câncer ainda é um questão de debate. De um lado, um carro é essencial para a promoção do tumor no fígado pelo fenobarbital em ratos [18] e regula tumorigênese em resposta ao estresse xenobióticos [36]. Por outro lado, Wang et al. descrito CAR como um novo alvo terapêutico que facilita a ciclofosfamida (CPA) de tratamento baseado de malignidades hematopoiéticas [20], e onde eles concluíram que a ativação CAR facilita a quimioterapia à base de CPA, promovendo selectivamente a sua bioativação. Em outro estudo, foi demonstrado CITCO para direccionar células estaminais tumor cerebral, inibir o seu crescimento e expansão [19]. Ambos os documentos sugerem o uso de agonistas de carro para o tratamento de doenças malignas do sangue e cérebro cancros, respectivamente.
Como foi referido anteriormente, o paclitaxel induz a apoptose em células em proliferação. Aqui, o paclitaxel induziu morte celular em todas as linhas de rato e de células de cancro humano, com valores de IC50 único para cada um deles. Mesmo depois de considerar que as diferenças essas células presentes na sua resistência ao paclitaxel (≈3600x), os agonistas CAR melhorou a eficácia de paclitaxel em quase todas as linhas celulares de cancro (6/7). Por outro lado, o agonista inverso Androstenol não resultou em qualquer efeito sobre a citotoxicidade do paclitaxel na maioria das células, e atenuou a citotóxico do paclitaxel em uma linha de células. Estes resultados levam à conclusão de que apenas agonistas carro deve ser considerado para melhorar a terapia do cancro NSCLC.
Os efeitos dos agonistas carro na eficácia anti-tumoral de paclitaxel foram semelhantes em ambos mouse e células humanas. Assim, nós nos concentramos nossos experimentos no modelo do rato por duas razões: temos mais experiência com este modelo [37], [38] e de todas as técnicas utilizadas no modelo de ratinho eram de rotina em nosso laboratório. Além disso, a utilização de linhas de células de cancro epiteliais de pulmão de rato foi estabelecida há mais de 30 anos, e tem apresentado resultados semelhantes aos obtidos com linhagens de células humanas [23]. Assim, nós também demonstrado neste
in vitro
modelo de camundongo que a expressão do gene de paclitaxel aumenta carro no IC50, independentemente da sua associação com ligantes CAR. Pode-se esperar que ligantes MCAR deve modular a expressão do gene MCAR, mas nossos resultados não mostraram este efeito. activação CAR por ligantes específicos nem sempre alterar os níveis de expressão do gene de carro ou de proteína, mas ele ainda pode resultar em um aumento de sua atividade transcricional.
análise de expressão CAR em células de câncer de rato tratados com ligantes carro sozinho, paclitaxel sozinho , ou uma combinação de ambos, revelou que o paclitaxel aumentou a expressão do gene de CARRO independentemente da sua associação com TCPOBOP ou androstenol. Consequentemente Concordando com este resultado,
in silico
análise de ancoragem de TCPOBOP, Androstenol e Paclitaxel em estrutura de proteína CAR demonstrou que Paclitaxel se encaixa no bolso de ligação ao ligando do receptor MCAR, o que poderia aumentar a expressão CAR pelo feedback positivo. Nenhum efeito sobre a expressão gênica CAR foi notado após CAR ligantes exposição, fato que corrobora com a ausência de citotoxicidade por estes ligantes.
Outro resultado interessante apoiar o efeito modulador de agonistas carro na eficácia paclitaxel foi sua potenciação de paclitaxel de assinatura de expressão do gene, o aumento da expressão de alguns genes supressores de tumor e diminuindo a expressão dos dois oncogenes. Curiosamente, o tratamento com TCPOBOP sozinho também induziu a expressão de genes supressores tumorais dois MGMT e WT1. MGMT metilação do promotor é um fator prognóstico mais forte do que a idade, estágio e grau do tumor para gliomas [39].