Abstract

A resistência à quimioterapia à base de cisplatina é uma das principais causas de falha do tratamento no cancro avançado da bexiga (BC) pacientes. Há evidências crescentes de que os microRNAs estão envolvidos no desenvolvimento e progressão do BC. No entanto, pouco se conhece sobre a função de microARNs na previsão do efeito da quimioterapia adjuvante na sobrevivência aC e regulação da resposta à cisplatina. Para abordar esta questão, foram empregados RT-qPCR para avaliar o significado clínico de miR-203 expressão em 108 tecidos de pacientes BC recebendo baseada em cisplatina quimioterapia adjuvante, e realizou estudos in vitro para explorar a sensibilidade quimioterápicos cisplatina no miR-203 superexpressão BC células. Encontramos miR-203 níveis foram significativamente menores no grupo progressão BC do que o grupo não-progressão (

P Art 0,001). ROC análise da curva ilustrada miR-203 podia distinguir significativamente pacientes evoluíram daqueles sem progressão (

P Art 0,001), produzindo uma área sob a curva ROC de 0,839 (IC 95%, 0,756-0,903). Além disso, a baixa expressão de miR-203 correlacionada com a sobrevivência progressão encurtado livre (PFS) e sobrevida global (OS) de pacientes BC, e foi um fator prognóstico independente. A sobre-expressão de miR-203 em 5637 e células T24 BC poderia diminuir a viabilidade celular, aumentar a citotoxicidade de cisplatina, e promover a apoptose. Western blotting e ensaio de repórter de luciferase mostrou Bcl-w e Survivina eram alvos a jusante directos de miR-203. Houve também uma associação inversa significativa entre miR-203 e Bcl-w ou Survivin expressão em tecidos BC (r = -0,781, -0,740, tanto

P Art 0,001). Em conclusão, diminuição do miR-203 prevê progressão e mau prognóstico para pacientes BC tratados com quimioterapia à base de cisplatina, enquanto miR-203 superexpressão pode melhorar cisplatina sensibilização, promovendo a apoptose via visam directamente Bcl-w e Survivin

Citation.: Zhang X, Zhang Y, Liu X, fang A, Li P, Li Z, et al. (2015) MicroRNA-203 é um indicador de prognóstico no cancro da bexiga e aumenta Chemosensitivity a Cisplatina via apoptose por Segmentação Bcl-w e Survivin. PLoS ONE 10 (11): e0143441. doi: 10.1371 /journal.pone.0143441

editor: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, França |

Recebido: 30 de julho de 2015; Aceito: 04 de novembro de 2015; Publicação: 23 de novembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (https://www.nsfc.gov.cn/) para CW (No. 81.271.916) ; National Natural Science Foundation da China (https://www.nsfc.gov.cn/) para XZ (No. 81301506); Natural Science Foundation da província de Shandong (https://www.sdnsf.gov.cn/portal/) para XZ (ZR2013HQ063); . E Doutorado de Educação Superior da China (https://www.cutech.edu.cn/cn/kyjj/gdxxbsdkyjj/A010301index_1.htm) para XZ (nº 20130131120067)

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes.

Introdução

em todo o mundo, o cancro da bexiga (BC) é a segunda malignidade mais comum do sistema urinário, com cerca de 386.300 novos casos e 150,200 mortes por ano [1 ]. Porque a maioria dos pacientes BC localmente avançados experimentam recaída após cistectomia radical [2], quimioterapia adjuvante é geralmente pré-formada em um esforço para retardar a recorrência e prolongar a sobrevivência. Presentemente, a cisplatina é um dos mais importantes drogas de quimioterapia, em combinação regime BC, como MVAC (metotrexato, vinblastina, doxorrubicina, cisplatina e) e GC (gemcitabina e cisplatina). No entanto, apenas 50% dos pacientes BC invasivos musculares têm respondido à quimioterapia baseada em cisplatina [3]. Pior ainda, alguns pacientes só sofrem toxicidade sem alcançar benefício quimioterápico. Por conseguinte, existe uma necessidade urgente para prever o efeito de quimioterapia adjuvante na sobrevivência aC e compreender os mecanismos que impedem a resposta à quimioterapia.

Estudos recentes descobriram resistência ao tratamento com cisplatina pode ser mediada por microARNs (miARNs) [ ,,,0],4, 5]. miARNs são uma classe de RNAs reguladores não-codificantes Composto por cerca de 22 nucleótidos que funcionam principalmente para regular negativamente mRNAs alvo por se ligar especificamente a sua região 3 ‘não traduzida (3’-UTR) e, subsequentemente, promovendo a degradação e /ou inibindo a tradução [6, 7]. Várias publicações têm documentado miRNAs pode atuar como supressores tumorais ou oncogenes envolvidos na formação de tumores, manutenção e metástase, e são potenciais biomarcadores para o diagnóstico de câncer, resultado terapêutico e prognóstico [8-10]. Entre estes, o miR-203 geralmente actua como um supressor de tumor, e é regulada negativamente em vários tipos de malignidades humanas, incluindo aC [11]. Recentemente, o miR-203 de expressão tem sido associada ao desenvolvimento de resistência contra a quimioterapia em muitos cancros. Por exemplo, miR-203 níveis foram reduzidos em células adquiridas quimioterapia resistentes aos medicamentos do cancro da mama [12]. A sobre-expressão de miR-203 aumentou o efeito anti-cancro de paclitaxel em células de cancro de cólon por meio de inibição da proliferação de células, promovendo a apoptose e morte celular [13]. Em contraste, Zhou et al [14] encontrou expressão exógena de miR-203 resistência induzida a oxaliplatina em células de cancro colorrectal. Até agora, há pouco sabe sobre o papel potencial do miR-203 em quimioterapia BC baseada em cisplatina e é necessária mais investigação.

Neste estudo, miR-203 foi examinada em tecidos clinicamente ressecados de BC tratados com cistectomia radical e quimioterapia adjuvante baseada em cisplatina, ea associação entre miR-203 e prognóstico foi analisada. Além disso, os mecanismos subjacentes à função do miR-203 na quimiorresistência de BC foram investigados. Encontramos baixa expressão de miR-203 foi correlacionada com a progressão e pobres sobrevida dos pacientes que receberam BC baseada em cisplatina quimioterapia adjuvante. Além disso, a restauração de expressão de miR-203 poderia aumentar a sensibilidade da cisplatina em células BC através da promoção de apoptose de células por segmentação Bcl-w (também conhecido como BCL2L2) e Survivina (também conhecido como BIRC5), o que indicou o miR-203 pode ter algum valor potencial na previsão do prognóstico e aplicação terapêutica.

Materiais e Métodos

pacientes e amostras de tecido

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Qilu Hospital da Universidade de Shandong Ética e informado por escrito o consentimento de cada paciente foi também obtido. O estudo inicial incluiu um total de 149 pacientes com CM tratados com cistectomia radical e quimioterapia adjuvante baseada em cisplatina em Qilu Hospital, Universidade de Shandong entre abril de 2007 e março de 2010. Todos os pacientes tinham confirmado histologicamente localizada carcinoma de células transicionais, encenado como pT3a-4a /N + M0 e de acordo com a classificação da AJCC 2010 /TNM. O regime quimioterapêutico padrão (MVAC ou GC) foi administrada entre 3 a 10 semanas após a ressecção completa, com um máximo de 6 ciclos, a menos que a progressão ou toxicidade inaceitável apareceu. Destes, 25 receberam radioterapia, tratamento com BCG ou quimioterapia neoadjuvante, e 16 foram excluídos devido à ressecção incompleta. Os 108 pacientes remanding foram acompanhados com trimestral cistoscopia para os primeiros 2 anos, então semestralmente a 5 anos, e depois anualmente até janeiro de 2015. A progressão foi definida como recidiva loco-regional, metástases à distância, ou morte devido a BC. sobrevida livre de progressão (PFS) foi calculado a partir do momento da cirurgia para a data da primeira progressão e sobrevida global (OS) foi calculado a partir do momento da cirurgia até a data da morte. Pacientes sem eventos acima foram censurados ao final do estudo. Todos os tecidos foram rapidamente congelados e confirmada por análise patológica, e, em seguida, armazenada a -80 ° C até à extracção do ARN.

linhas de células e cultura

As linhas celulares humanas (BC 5637 e T24) e a linha celular HEK 293T foram adquiridos da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA), e mantidas em meio RPMI 1640 (Thermo Fisher Scientific) enriquecido com 10% de soro fetal bovino (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e cultivou-se a 37 ° C com um ambiente humidificado de 5% de CO

2 no ar.

a transfecção

Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) foi utilizado para miR- 203 imita /imita miARN transfecções de controlo negativo de acordo com as instruções do fabricante. miR-203 imita (Dharmacon, Lafayette, CO, EUA) foram oligonucleotídeos double-stranded RNA projetados para imitar endógena, maduro miR-203. imita miARN controlo negativo (Dharmacon) foi baseado em cel-miR-67, sequência madura: UCACAACCUCCUAGAAAGAGUAGA, e tinha desenho idêntico e modificações como o miR-203 imita

extracção de ARN e RT-qPCR

o ARN total foi extraído a partir de tecidos utilizando o método padrão de TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) seguindo o protocolo do fabricante, e medida pelo espectrofotómetro NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA). RT-qPCR foi realizado em ABI PRISM 7500 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Detecção de miR-203 foi realizada tal como descrito previamente [15]. Para a Bcl-w e survivina mRNAs quantificação, o ARN foi sujeitos a transcrição reversa usando High Capacity cDNA Transcrição Reversa Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA), em seguida a 10 vezes diluído ADNc foi amplificado com Power SYBR Green PCR Master Mix ( Applied Biosystems). O nível de expressão relativa de miR-203 e Bcl-w e Survivin mRNAs foram calculados usando 2

-ΔΔCT método através do normalizados para referenciar genes U6 snRNA e mRNA GAPDH, respectivamente.

A viabilidade celular ensaio

a viabilidade celular foi quantificada utilizando a contagem celular Kit-8 (CCK-8; Diojindo Laboratories, Kumamoto, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. As células (5 × 10

3 células /poço) foram semeadas em placas de 96 poços em 24 horas triplicado após a transfecção, e incubadas com 0, 5, 10, 15, 20, 25 e 30 uM cisplatina em meio de cultura 100 ul para outra 24h. Em seguida, WST-8 de substrato foi adicionado a 37 ° C durante 2 h, e a absorvância foi lida por espectrofotometria a 450 nm.

citometria de fluxo para ensaio de apoptose

análise de citometria de fluxo da apoptose foi analisada utilizando um Anexina V-FITC kit /PI coloração (BestBio, Xangai, China) de acordo com as instruções do fabricante. Vinte e quatro horas após a transfecção, as células (1 x 10

4 células /cavidade) foram estimuladas com 5 uM de cisplatina durante 48 h e, em seguida, recolhidos. Depois de lavar 3 vezes com com PBS frio, as células foram ressuspensas em tampão seguido de coloração com anexina V-FITC durante 15 min e PI durante 5 min no escuro ligação. 1 × 10

4 células foram avaliadas em um fluxo FACS Calibur citômetro (BD, Bedford, MA, EUA). Todas as experiências foram realizadas em triplicado.

TUNEL ensaio

As células (1 x 10

4 células /cavidade) foram semeadas em placas de 96 cavidades, em triplicado, após a transfecção, e incubadas com 5 uM cisplatina em 100 ul de meio de cultura durante 24 h. As células foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 30 min, em seguida, neutralizou-se com 2 mg /ml de glicina, durante 5 min, permeabilizadas em 0,1% de Triton X-100 durante 10 min, e finalmente marcado com fluoresceína-12-dUTP utilizando desoxinucleotidil-transferase terminal. A fluorescência verde localizada de células apoptóticas (fluoresceína-12-dUTP) foi detectada por microscopia de fluorescência.

Western blotting

Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram lisadas em gelo frio ensaio de radio imunoprecipi tacão (RIPA) de tampão durante 30 min, e a concentração de proteína foi quantificado utilizando Bio-Rad reagente de ensaio de proteína (Bio-Rad, CA, EUA). Trinta amostras ug de proteína foram carregadas e separadas em géis de 10% SDS-poliacrilamida e transferidos para membranas de fluoreto de polivinilideno (Millipore, Bedford, MA, EUA). As membranas foram bloqueadas em primeiro lugar com 5% de leite desnatado sem gordura durante 2 h, em seguida, incubadas com anti-Bcl-w (1: 1000; Cell Signaling Technology, Beverly, MA, EUA), anti-Survivina (1: 1000; Abcam, de Cambridge, Massachusetts, EUA) ou anticorpo monoclonal de coelho anti-β actina (1: 1000; Cell Signaling Technology) durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com um anticorpo secundário marcado com HRP (1: 5000; Cell Signaling Technology) durante 1h à temperatura ambiente. Finalmente, as bandas foram visualizadas usando o kit de detecção por quimioluminescência (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ, EUA) em FluorChem E quimioluminescente Western Blot Imaging System (celular Biosciences, Santa Clara, CA, EUA).

ensaio de repórter de luciferase

O PMIR-REPORT

TM vetores (RiboBio, Guangzhou, China) foram construídas com tipo selvagem (WT) ou mutante (MUT) 3′-UTR de Bcl-w e Survivin, e todas as sequências eram inseridos entre o hRluc e o gene hLuc. células HEK293T (1 × 10

4 células /cavidade) foram semeadas em placas de 96 poços e co-transfectadas com o miR-203 /controlo negativo miARN e WT-Survivina 3′-UTR vector /MUT- Survivina 3′-UTR vector ou WT-Bcl-w 3′-UTR vector /MUT- Bcl-w 3′-UTR vector utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Quarenta e oito horas após a transfecção, as células foram recolhidos e analisados ​​utilizando o Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA). Cada ensaio foi realizado em triplicado.

Análise estatística

A expressão de miR-203 em amostras de tecido foi determinado como a distribuição não-normal por meio do teste de Kolmogorov-Smirnov. Assim, foi utilizado de Mann-Whitney U ou teste de Kruskal-Wallis para avaliar a significância do miR-203 diferenças entre os grupos. characteristic (ROC) receiver operating foi realizado para avaliar o poder de discriminação de miR-203 para discriminar progrediu pacientes daqueles sem progressão, eo valor de corte ótimo foi definida com base no índice de Youden (sensibilidade + especificidade-1) [16]. As curvas de sobrevida foram construídas pelo método de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank. modelo de Cox foi utilizado para identificação dos fatores independentes de PFS e OS. teste t de Student foi realizado para determinar a significância de dados no ensaio de viabilidade, ensaio de apoptose e ensaio de repórter de luciferase. A relação entre o miR-203 e expressão do gene alvo foi explorada por correlação de Spearman. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando SPSS Statistics 17.0 para Windows (IBM Corporation, Armonk, NY, EUA).

Resultados

As características dos pacientes

A idade média do 108 aC pacientes que receberam quimioterapia adjuvante baseada em cisplatina foi de 62 (intervalo 42-81) anos, eo período médio de acompanhamento foi de 51,5 (6-65 alcance) meses. Durante o acompanhamento, 45 pacientes apresentaram progressão, dos quais 32 casos tiveram recorrência loco-regional, 11 casos apresentaram metástases à distância, e 39 finalmente morreu com BC. As características de linha de base de pacientes detalhe foram apresentados na Tabela 1.

Redução da expressão de miR-203 foi associada com a progressão da doença

Os níveis de miR-203 foram significativamente diminuída em comparação com grupo de progressão grupo sem progressão (

P Art 0,001; Fig 1A e Arquivo S1). Curvas ROC analisa ilustrado miR-203 produziu uma área sob a curva ROC valor (AUC) de 0,839 (IC 95%, 0,756-0,903) em distinguir pacientes com progressão do que aqueles sem progressão, o que era mais preciso do que adivinhar (

P

0,001; Fig 1B). No entanto, não foram encontradas associações significativas entre o miR-203 níveis e idade, sexo, grau, estágio T, estado nodal, e regimes de quimioterapia (todos em

P Art 0,05; Tabela 2).

os níveis de (a) o miR-203 foram detectadas pelo método de RT-qPCR e normalizados contra U6 ARN em 108 casos de tecidos de cancro da bexiga. Níveis de miR-203 no grupo de progressão foram significativamente menores do que aqueles no grupo não-progressão (

P Art 0,001, Mann-Whitney U). pacientes distintos (B) da curva ROC com progressão daquelas sem progressão usando miR-203, com uma área sob a curva ROC valor de 0,839 (IC 95%, 0,756-0,903). (C, D) de Kaplan-Meier PFS e curvas OS com base na expressão de miR-203 de pacientes com câncer de bexiga. O ideal cortado valor (0,345), calculado pela análise ROC foi utilizada para classificar os pacientes como miR-203 grupos de expressões altas e baixas. Baixa expressão de miR-203 foi significativamente correlacionada com PFS encurtado ou OS. (Ambos

P Art 0,001, teste log-rank)

miR-203 previsto prognóstico em pacientes BC após a quimioterapia

com base no ideal cortado valor (0,345), calculado pela análise ROC para a progressão BC após a quimioterapia, 79 pacientes cujos miR-203 níveis estavam acima de 0,345 foram classificados como de alta grupo expressão de miR-203 , os restantes 29 casos foram classificados como baixo grupo expressão de miR-203. Kaplan-Meier curva de sobrevida apresentou baixa expressão de miR-203 foi significativamente correlacionada com PFS encurtado e OS (tanto no

P Restaurant 0,001; Fig 1C e 1D).

análises de regressão univariada de Cox revelaram associações significativas entre miR-203, estágio T, estado nodal e PFS (todo em

P Art 0,05; Tabela 3), bem como miR-203, palco e OS T (todo em

P

0,05; Tabela 3). Ao colocar acima fatores significativos em multivariada modelo de Cox, miR-203, estágio T e status nodal demonstrado valor prognóstico independente para PFS (todos em

P Art 0,05; Tabela 3), e miR-203, T estágio demonstrado valor prognóstico independente para OS (todos em

P Art 0,05; Tabela 3).

a superexpressão de miR-203 reforçada sensibilização cisplatina em células BC

para explorar o efeito de miR-203 na quimio-sensibilidade a cisplatina em células BC, curvas dependente da concentração para 5637 e linhas de células T24 BC transfectadas com miR-203 imita e controle negativo foram plotados. Como mostrado na Fig 2A, 24 horas após a transfecção, as miR-203 em níveis de expressão e células T24 5637 transfectadas com miR-203 imita foram 5297 e 8089 vezes mais elevados do que as transfectadas com o controlo negativo (

P

0,001). As viabilidades celulares de miR-203 que sobre-expressam 5637 e células T24 foram drasticamente reduzidos quando comparado com as células transfectadas com o controlo negativo a um gradiente de concentração de 5, 10, 15, 20, 25 e 30 uM durante 24 horas (toda a

P

0,05; Figura 2B e 2C). Os valores máximos meio concentração inibitória (IC50) de cisplatina, para 5637 e T24 células foram de 11,1 (95% CI 9,7-12,5) iM e 14.3 (95% IC 12,7-16,1) uM, respectivamente. A sobre-expressão de miR-203 diminuiu de forma significativa os valores de IC50 de 8,3 (IC 95% 6,9-9,6) e 9,0 | iM (95% CI 7,6-10,4) ^ M, respectivamente. Além disso, os efeitos de miR-203 em combinação gemcitabina e cisplatina foram mostrados no ficheiro S2.

(A) o miR-203 em níveis de expressão e células T24 5637 transfectadas com miR-203 imita /controlo negativo. miR-203 foram níveis significativamente aumentados em células transfectadas com o miR-203 imita comparação com células transfectadas com o controlo negativo (*

P

0,001, teste t, n = 6). (B, C) curvas concentração-dependente para linhas 5637 e de célula T24 transfectadas com miR-203 imita e controle negativo, às 24h. As viabilidades celulares de células de miR-203 que sobre-expressam foram drasticamente reduzidos quando comparados com as células de controlo negativo aos 5, 10, 15, 20, 25 e 30 uM cisplatina (todas a

P

0,05, teste t). (D) A análise de citometria de fluxo de apoptose através de coloração dupla de células com Anexina V FITC e iodeto de propídio (PI). (E) Análise de quantificação da apoptose mostrado na Figura 2B. A sobre-expressão de miR-203 aumentou significativamente a apoptose em células T24 e 5637 linhas (*

P

0,01, teste t, n = 6). ensaio (F) de TUNEL indicado e 5637 linhas de células T24 transfectadas com miR-203 imita apresentaram níveis elevados de clivagem de ADN em comparação com o controlo normal (40 vezes). As células foram coradas com DAPI e submetido a ensaio de TUNEL para detectar DNA e células em apoptose.

Em seguida, foi realizada uma análise de citometria de fluxo para quantificar a apoptose via dupla marcação de células com anexina V FITC e iodeto de propídio ( PI). Os resultados demonstraram a sobre-expressão de miR-203 apoptose significativamente aumentada em ambas as linhas de células BC (tanto a

P

0,05; Figura 2D e 2E). Para verificar se o aumento da apoptose era devido à activação da via de apoptose acima mencionado, nós medimos a fragmentação do ADN pelo ensaio de TUNEL e confirmou que as células transfectadas com o miR-203 apresentaram níveis elevados de clivagem de ADN (Fig 2F).

Bcl-w e Survivin eram alvos a jusante diretos de miR-203

Bcl-w e Survivin foram previstos como potenciais alvos diretos de miR-203 por dois grandes programas de previsão de destino, TargetScan 5.1 (http: //www.targetscan.org/) e miranda (https://www.microrna.org/). Além disso, a Bcl-w e Survivina desempenhado papéis importantes no desenvolvimento aC, e a sua infra-regulação foram associados com o aumento da sensibilidade à apoptose induzida por cisplatina [17-20]. Os preditos miR-203 sítios de segmentação em regiões 3’UTR de Bcl-w (também conhecidos como BCL2L2) e Survivina (também conhecido como BIRC5) foram mostrado na Fig 3A. Um ensaio de luciferase de repórter duplo foi utilizado para confirmar se o 3 ‘UTR de Bcl-w e Survivina mRNAs tinha locais alvo para miR-203. Construiu-se um vector repórter da luciferase que codifica a sequência de tipo selvagem 3′-UTR do mRNA a Bcl-w ou ARNm de survivina, incluindo os locais alvo de miR-203 previstos, e um vector repórter mutante correspondente. Como mostrado na Fig 3B, o miR-203 inibiu significativamente a intensidade de luminescência de WT-Bcl-w vector de 3′-UTR e WT-Survivina 3’-UTR do vetor (ambos

P

0,01), enquanto que a mutação de o local de ligação bloqueada, a redução de actividade de luciferase, indicando que houve uma interacção directa entre o miR-203 e o 3 ‘UTR de Bcl-w ARNm ou ARNm de survivina.

(a) Ilustração do miR-203 previsto alvejando sites em regiões 3’UTR de Bcl-w e Survivin. (B) ensaio da actividade da luciferase dupla foi realizada em células HEK293T co-transfectadas com vectores de PMIR-relatório de controlo /miR-203 e com o tipo selvagem /mutante 3′-UTR de Bcl-W (acima) e Survivina (abaixo). *

P

0,01, teste t, n = 6. (C) transferências de Western mostrando a regulação negativa das proteínas Bcl-w e survivina após transfecção de miR-203 imita em 5637 e linhas de células T24. β-actina foi utilizado como um controlo. (D) RT-qPCR mostrando a regulação negativa da Bcl-w e Survivina ARNm após transfecção de miR-203 imita em 5637 e linhas de células T24. *

P

0,01, teste t, n = 6. A análise de correlação (E) de Spearman mostrando uma relação inversa significativa entre o miR-203 e mRNA a Bcl-W ou a expressão de ARNm de survivina em tecidos de cancro da bexiga (R = -0,781, -0,740, tanto no

P

. 0,001)

Para confirmar ainda mais a sua relação no BC, nós transfectadas 5637 e T24 linhas celulares com miR-203 imita ou controlo negativo, e analisada a expressão de ARNm e proteína de Bcl-w ou Survivina por ensaios de western-blotting RT-qPCR e. Os resultados mostraram que as expressões endógenos da Bcl-w e Survivina diminuíram significativamente em ambos os níveis de proteína para miR-203 BC células transfectadas (Fig 3C e 3D) e ARNm. Coerente com isso, houve também uma associação inversa significativa entre miR-203 e Bcl-w ou mRNA Survivin expressão em tecidos BC (r = -0,781, -0,740, tanto no

P Art 0,001; Fig 3E ). Tomados em conjunto, miR-203 pode exercer a sua função diretamente pela segmentação Bcl-w e gene Survivina em BC.

Discussão

pós-operatório quimioterapia à base de cisplatina tem sido amplamente utilizada para o músculo BC invasivo ou metastático , resultando uma resposta em até 70% dos pacientes [21]. Infelizmente, devido à quimiorresistência de células de cancro, a resposta é não sustentada em mais de 50% dos casos, resultando numa taxa de sobrevivência de 5 anos de 15% [22, 23]. Assim, é importante para entender melhor os fatores que determinam a resposta à quimioterapia e prognóstico. Nordentoft et al [24] encontraram 15 miRNAs em resposta ao tratamento com cisplatina e 5 miRNAs associados com o tempo de sobrevivência, dos quais 3 miRNAs (miR-886-3p, miR-923, miR-944) foram considerados como preditores de ambos cisplatina resposta e prognóstico. Estudos anteriores documentaram diminuição da expressão de miR-203 foi associada com a progressão do tumor e mau prognóstico em alguns tipos de câncer, como cabeça humana e carcinoma de células escamosas do pescoço [25], gliomas [26], e adenocarcinoma esofágico [27]. Consistente com os resultados acima descritos, este estudo quantificou miR-203 níveis em uma coorte de pacientes com CM tratados com cistectomia radical e quimioterapia adjuvante baseada em cisplatina, e encontrou miR-203 foi significativamente reduzida em doentes com doença progressiva, enquanto não associadas com o outro características clínico-patológicas. Além disso, a análise de ROC mostrou miR-203 tinha algum poder diagnóstico em discriminar os pacientes com ou sem progressão. Com base no valor de corte ideal de miR-203, que todos os pacientes classificados em grupos de alta e baixa expressão de miR-203. Kaplan-Meier análise demonstrou grupo de baixa expressão de miR-203 teve PFS pobres e OS. A análise de regressão multivariada de Cox demonstrou que miR-203 foi um fator prognóstico independente para pacientes BC. Assim, MI-203 pode ser utilizado para a previsão do prognóstico de pacientes com CM tratados com quimioterapia adjuvante com cisplatina.

resistência celular a cisplatina exibe frequentemente uma natureza multifactorial, incluindo a absorção de droga intracelular enfraquecido, o aumento da reparação de danos no ADN, e diminuiu a execução do programa apoptótico [28]. Drayton et al [29] encontraram miR-27a contribuído para a resistência a cisplatina através da regulação da glutationa intracelular. Vinall et al [30] mostraram co-tratamento com miR-34a e cisplatina resultou numa inibição dramática na proliferação de células cancerosas em comparação com o tratamento apenas com cisplatina. Por outro lado, a cisplatina induz a desmetilação do promotor de miR-34a e aumenta a expressão de miR-34a, sensibilizar células BC mais à cisplatina [31]. Neste estudo, verificou-se que a transfecção de células BC com miR-203 imita células sensibilizadas para a actividade citotóxica de cisplatina. Enquanto isso, os dados a partir de ensaios de apoptose mostraram que a adição de 5 uM de cisplatina, mais apoptose foi encontrada em miR-203 que sobre-expressam as células de cancro da bexiga, o que sugere que a inibição da AC a viabilidade das células pode ser relacionada, pelo menos em parte, à susceptibilidade aumentada para induzida cisplatina- apoptose. Assim, o regime de combinação de miR-203 e cisplatina imita pode melhorar os resultados do tratamento BC paciente.

Para obter uma melhor compreensão do papel de miR-203 em desenvolvimento aC, foram analisados ​​os seus potenciais alvos a jusante. Como um membro da família Bcl-2, Bcl-W podem promover a sobrevivência celular através da inibição da via intrínseca de apoptose [32]. Chen et al [33] verificaram Bcl-w foi sobre-expresso em amostras de BC em comparação com tecidos normais adjacentes, sugerindo que desempenhou um papel importante na carcinogénese de BC. Survivin, que era um membro chave do inibidor de proteína apoptose família (IAP) [34], executou a sua função anti-apoptótica, bloqueando a atividade caspases em um complexo com o inibidor ligado ao X da proteína apoptose (XIAP) [35]. Um estudo multicêntrico encontrou expressão Survivin foi associado com um risco elevado de BC recorrência e mortalidade específica por câncer [36]. Os nossos dados demonstraram que o miR-203 poderia ligar-se directamente o 3′-UTR de ambos Bcl-w e Survivina, resultando em expressão regulada por baixo da Bcl-w e Survivina ao nível pós-transcricional. Estes foram apoiados por dados clínicos onde encontramos miR-203 expressão era e negativamente correlacionada com a Bcl-w e expressão Survivin mRNAs em amostras de tecidos BC. Assim, o miR-203 pode ser considerada como um potencial agente terapêutico por inibição simultânea de factores anti-apoptóticos Bcl-w e survivina.

Em conclusão, este estudo demonstra que a diminuição do miR-203 pode ser usado como um indicador para a progressão e prognóstico de pacientes com CM tratados com quimioterapia baseada em cisplatina. Além disso, a sobre-expressão de miR-203 pode melhorar a cisplatina sensibilização, promovendo a apoptose através de direccionamento directamente Bcl-w e Survivina. Estudos adicionais multicêntricos são necessários para confirmar se miR-203 poderia ser útil como um indicador de quimio-sensibilidade para regimes de quimioterapia à base de cisplatina, bem como um alvo terapêutico para BC na clínica.

Informações de Apoio

S1 Arquivo . Os miR-203 níveis de expressão de pacientes NMIBC, grupo Progressão com 45 casos e grupo não-progressão com 67 casos

doi: 10.1371. /Journal.pone.0143441.s001

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S2 Arquivo. Os efeitos de miR-203 em combinação gemcitabina e cisplatina

doi: 10.1371. /Journal.pone.0143441.s002

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