Abstract

inibidores da histona deacetilase (HDACIs) têm atividade anti-câncer potente em uma variedade de modelos de cancro. A compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos na resposta terapêutica da HDACi é necessária antes de sua aplicação clínica. Este estudo teve como objetivo determinar se um potente HDACi, LBH589 (panobinostat), tinha a capacidade de resposta terapêutica diferencial para as células PC-3 câncer de próstata (PCA) LNCaP e. O primeiro mostrou prisão prometáfase com apoptose subsequente após tratamento LBH589, enquanto o último foi menos sensível e teve prisão G2 tarde. O tratamento LBH589 regulada HDAC6 e sustentada ativação ERK, e contribuiu para a prisão prometáfase. Mecanicamente, LBH589 inibiu a atividade HDAC6, causado sua dissociação da proteína fosfatase PP1α, e aumento da acetilação 14-3-3ζ. Acetilado 14-3-3ζ lançou seu efeito máscara na serina 259 de c-Raf e serina 216 da Cdc25C subsequente de-fosforilação por PP1α, o que contribuiu para a ativação ERK. actividade ERK reforçada por LBH589 ainda mais para baixo-regulado níveis de proteína HDAC6 e ativação ERK sustentado por regulamento livre de frente. O Cdc25C sustentada e a activação de ERK resultou no início de fase M prisão (prometáfase) e subsequente apoptose nas células LNCaP mais sensíveis, mas não em células PC-3. Este estudo fornece provas pré-clínico que HDAC6 podem servir como um alvo terapêutico sensível no tratamento de cancro da próstata com HDACi LBH589 para tradução clínica. Este estudo também propõe um novo mecanismo de participação HDAC6 na regulação da via de sinalização de c-Raf-PP1-ERK e contribuindo para a transição M do ciclo celular fase

citação:. Chuang MJ, Wu ST, Tang SH, Lai XM, Lai HC, Hsu KH, et al. Detenção Prometáfase (2013) O HDAC Inibidor LBH589 Induz ERK-dependente no cancro da próstata através HDAC6 Inactivação e Down-regulamento. PLoS ONE 8 (9): e73401. doi: 10.1371 /journal.pone.0073401

editor: Zoran Culig, Innsbruck Medical University, Áustria

Recebido: 20 de fevereiro de 2013; Aceito: 19 de julho de 2013; Publicação: 04 de setembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chuang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas do Conselho Nacional de Ciência (97-2314-B-016-023-MY3 e 99-2628-B-016-012-MY3) e da Fundação Hospital Research Tri-Serviços Gerais (TSGH-C101-009 -S02, TSGH-C100-128 e TSGH-C99-012-13-S03), Taiwan, ROC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O rápido desenvolvimento de inibidores de HDAC (HDACi) como terapêutica do câncer tem sido fervorosamente aplicado em mais de 80 ensaios clínicos [1]. A compreensão dos mecanismos moleculares detalhados de como HDACi medeia a actividade anti-cancro é necessário, a fim de facilitar a sua tradução com êxito clínico. Ele suprime a sobrevivência de células cancerosas através de vários mecanismos, incluindo o bloqueio da angiogénese, inibindo vias de resposta ao estresse intracelulares, aumentando a geração de espécies reativas de oxigênio, e influenciar a resposta retículo endoplasmático estresse devido ao manuseio prejudicada de proteínas mal-dobradas [2-4]. Entre estas actividades anti-cancro, G1 paragem do ciclo celular mediada por HDACi provoca um aumento da expressão da p21 do gene supressor de tumor de um modo dependente da transcrição [5]. Também tem sido demonstrado que induz HDACi /M paragem do ciclo celular G2 através de uma via independente de transcrição através de sub-regulação de Aurora quinases A e B [6-8]. Além disso, HDACi desencadeia uma resposta da barreira da fase G2 em células humanas normais e que esta resposta do ponto de verificação é defeituoso em uma gama de células tumorais [9]. Por conseguinte, visando a inibição da G2 /M progressão do ciclo celular é uma estratégia mais benéfica para suprimir especificamente o crescimento de células cancerosas sem inibir as células normais.

Indução da mitose do ciclo celular é fortemente regulada por activação coordenada e inactivação de múltiplas proteínas cinases e as fosfatases. No início da mitose, Cdc25C (uma fosfatase dupla) a activação é um passo crítico para a activação do complexo Cdc2 /ciclina B. O resíduo inibidora de Ser216 em Cdc25C deve ser desfosforilado por PP1, a fim de activar Cdc25C [10,11]. A actividade completa de Cdc25C é regulada por ERK mitogénio após estimulação durante transição G2 /M, em células de mamíferos [12]. ERK pertence à cascata de MAPK e a sua actividade é controlada pela sinalização Raf /MEK a montante. Em células quiescentes, 14-3-3 liga-se a c-Raf através S259 e S621 fosforilação e mantém c-Raf inactivação [13,14]. Quando as células entram em mitose, a desfosforilação PP1 ou PP2A mediada da S259 é um pré-requisito para a fosforilação de S338 em c-Raf e outros gatilhos c-Raf e ativação ERK [15,16].

Notavelmente, PP1 e actividades de ERK são essenciais para a activação Cdc25C no início da mitose, seguido de uma diminuição da actividade de ERK durante a transição de fase M [12,17]. A PP1 pode ligar-se directamente para a subunidade catalítica do C-terminal da HDAC6. A interacção de HDAC6 e PP1 pode ser interrompida através da inibição da actividade de qualquer HDAC6 ou PP1 [18]. HDAC6 é o principal desacetilase que é responsável pela desacetilação da α-tubulina e a proteína de choque térmico 90 (Hsp90) [19]. No entanto, se HDAC6 contribui para a regulação da transição G2 /M do ciclo celular permanece obscuro.

LBH589 (panobinostat), um HDACi, exposições, pelo menos, dez vezes atividade inibitória mais potente contra toda a classe I, II, e IV HDAC em comparação com SAHA (vorinostat) [20]. LBH589 possui efeitos de inibição de crescimento potentes em vários tipos de células cancerosas, mas com diferentes eficácia terapêutica, que pode representar potencial resistência de certos tipos de cancro e impedem a tradução clínica LBH589. Embora LBH589 induz /M paragem do ciclo celular G2 através da degradação de ambos Aurora A e B cinases [6,7], os mecanismos moleculares detalhados envolvidos, bem como os potenciais HDACs alvo de LBH589 permanece indeterminada.

A presente Foram caracterizados dois tipos distintos de G2 /M do ciclo celular mediada por prisão por LBH589 em células de cancro da próstata. LBH589 não só inibiu HDAC6 e reforçada acetilação 14-3-3ζ, mas também empobrecido HDAC6 para provocar a dissociação do PP1α de HDAC6. LBH589 posteriormente interferiu na regulação da via de sinalização de c-Raf-ERK, contribuindo para a transição do ciclo celular fase M. Em conclusão, este estudo sugere que HDAC6 pode ser um alvo terapêutico sensível no tratamento de câncer de próstata utilizando LBH589 para a tradução clínica no futuro.

Resultados

LBH589 induzida G2 /M detenção do ciclo celular e inibição do crescimento em células de cancro da próstata através de mecanismos distintos

Como uma primeira tentativa para investigar o efeito citotóxico de LBH589, quatro linhas celulares de cancro da próstata, LNCaP, PC-3, DU-145 e 22Rv1, foram tratados com várias concentrações de LBH589 e a viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT. Em geral, mostrou LBH589 efeito potente de inibição do crescimento em cada linha celular de cancro de um modo dose e dependente do tempo. Entre as linhas celulares, LNCaP e PC-3 foram os mais sensíveis e resistentes ao tratamento LBH589, respectivamente (Figura 1A). Investigar os perfis do ciclo celular subsequente à exposição LBH589, LBH589 tratamento não causou G2-M, mas não G1, na paragem do crescimento das linhas celulares de cancro da próstata de quatro para 24 horas (Figura 1B). parada do crescimento induzido por LBH589 G2-M foi mais proeminente no PC-3 e LNCaP. Embora LBH589 induziu um grau comparável de paragem em G2-M em LNCaP e PC-3 de células, a diferença significativa de apoptose entre estas duas linhas de células sob exposição prolongada LBH589 (Figura 1C) sugeriu que os mecanismos subjacentes envolvidas podem ser diferentes.

(a) LBH589 teve um efeito dependente da dose sobre a inibição do crescimento em linhas de células de cancro da próstata. As linhas celulares foram tratados com 50, 75, 100, e 150 nM de LBH589. A sobrevivência das células foi medida utilizando o ensaio de MTT, tal como descrito na secção Materiais e Métodos. Gráficos comparação da percentagem de inibição do crescimento ao veículo de controlo em 24 horas (48) inferior (superior) e. G2 induzida (B) LBH589 /M parada do ciclo celular. Todas as linhas celulares foram tratadas com LBH589 ou veículo de controlo durante 24 h. Os ciclos celulares foram analisados ​​por coloração de PI-e citometria de fluxo de acordo com conteúdo de DNA. O aumento das percentagens de células G2 /M foram comparados com o do controlo do veículo. (C) LBH589 induzida apoptose em células LNCaP de PC-3 e. Ambas as linhas celulares foram tratadas com LBH589 75nM ou controlo de veículo de 24 (superior) e 48 (inferior) h. As percentagens de células apoptóticas foram analisadas por contagem da população de fragmentação de ADN por citometria de fluxo. (D-E) HDACIs induzida Aurora quinase degradação encontrada no PC-3, mas não em LNCaP. As células PC-3 e LNCaP foram tratadas com diferentes concentrações indicadas no HDACIs de LBH589, SAHA e SBHA durante 24 h e os lisados ​​celulares foram analisados ​​por transferência de Western utilizando os anticorpos indicados. (F) Perfil de proteínas sobre a progressão do ciclo celular G2 /M. As células foram tratadas com diferentes doses de LBH589 durante 24 h. O lisato foi analisada por Western blotting.

Um estudo anterior demonstrou G2 /M paragem do ciclo celular mediada por LBH589 via sub-regulação de Aurora cinase A e B em carcinoma de células renais [6]. LBH589 tratamento aumentou os mesmos níveis de acetilação da histona H3 em ambos LNCaP e PC-3 de células, indicando que era funcional LBH589 em ambas as linhas de células de cancro da próstata. No entanto, a regulação negativa de Aurora A e B cinases por LBH589 só foi observado em células PC-3, mas não em células LNCaP (Figura 1D). A fim de investigar se outros derivados de ácido hidroxâmico tiveram efeitos semelhantes na LNCaP e células PC-3, dois outros HDACIs, SAHA e SBHA, foram testados e mostraram que a sub-regulação de quinases Aurora A e B ocorreu apenas em células PC-3 mas não em células LNCaP (Figura 1E). Para aprofundar a discrepância entre LNCaP e as células em tratamento LBH589 PC-3, duas moléculas de transição G2-M Cdc2 e Cdc25C foram comparados. LBH589 diminuiu Cdc25C e níveis Cdc2 fosforilados em células PC-3, mas não em células LNCaP. LBH589 também induziu um padrão de deslocamento da banda de Cdc25C em células LNCaP em uma dose e tempo-dependente maneira (Figura 1F).

LBH589 induzida ativação ERK e Cdc25C hiper-fosforilação

Os mecanismos moleculares envolvidos nos efeitos mediados-LBH589 distintas entre as duas células PCA foi investigada. As vias de sinalização envolvidos na proliferação e sobrevivência celular, incluindo Akt e p38, não mostrou nenhuma diferença significativa entre LNCaP e PC-3 CaP células (Figura 2A). Curiosamente, o tratamento LBH589 resultou no aumento da fosforilação de ERK apenas em células LNCaP, não em células PC-3. A sub-regulação da fosforilação da histona H3 serina 10 (como um marcador de fase M) ocorreu em células PC-3, mas não em células LNCaP (figura 2A).

(A) LBH589 actividade ERK induzida é selectivamente activado em células LNCaP. As células PC-3 e LNCaP foram tratados com 75nM LBH589 ou controlo de veículo durante 24 h. Os níveis de proteínas indicadas foram imuno-blotted contra anticorpos individuais. GAPDH foi um controlo de carga interna. (B) correlações dependentes do tempo de ativação de ERK mediada por LBH589 e Cdc25C hiper-fosforilação dose e. LNCaP foi exposto a várias concentrações de LBH589 durante 24 h (esquerda) ou 25 nM LBH589 em momentos diferentes (direita). (C) Dose-dependente correlação de G2 M prisão induzida por LBH589 /. LNCaP foi tratada com várias concentrações de LBH589 durante 24 h. ciclos celulares foram analisadas por citometria de fluxo. (D) Cdc25C hiper-fosforilação foi confirmada por ensaio de desfosforilação. LNCaP foi tratada com 50 nM LBH589 durante 24 horas. Os lisados ​​foram incubados com fosfatase (CIP) ou em combinação com inibidor de fosfatase. O Cdc25C hiper-fosforilada e desfosforilado foram analisados ​​por immunoblotting com anticorpo Cdc25C. (E) Cdc25C hiper-fosforilação foi suprimida por inibidores de MEK. LNCaP foram tratados com inibidores de MEK, PD (100 uM PD98059) ou UO (20 uM UO126) durante 30 minutos. LBH589, em seguida, foi adicionado à cultura após 24 h. atividade de ERK e Cdc25C hiper-fosforilação foram analisados ​​por anticorpos Pi-ERK e Cdc25C em western blot.

Além disso, o tratamento LBH589 resultou no aumento da fosforilação ERK e deslocamento da banda de Cdc25C em uma dose e tempo- modo dependente em células LNCaP (Fig. 2B), que se correlacionou com o aumento da população de células da fase G2 /M (Fig. 2C). Para investigar se o deslocamento da banda de Cdc25C representado hiper-fosforilação sob tratamento LBH589, o lisado de LNCaP tratadas LBH589 foi tratado com CIP (fosfatase) sozinho, ou combinado tratado com um inibidor de fosfatase. O deslocamento da banda de Cdc25C induzida por LBH589 foi removido por CIP, mas foi restaurado pelo inibidor de fosfatase (Figura 2D), indicando Cdc25C hiper-fosforilação.

Além disso investigar a correlação entre a activação de ERK e Cdc25C hiper-fosforilação de células em tratamento LBH589, o Cdc25C hiper-fosforilação induzida por LBH589 foi bloqueada por MEK inibidores U0126 e PD98059 em células LNCaP. Isto indicou que Cdc25C hiper-fosforilação foi um evento a jusante da ativação ERK induzida por LBH589 (Figura 2E).

LBH589 G2 induzido ou prisão fase M e ERK ativação e contribuiu para a paragem do ciclo celular prometáfase

por imuno-fluorescência, os padrões de distribuição de Cdc2 e Cdc25C entre LNCaP e PC-3 foram investigados. LBH589 tratamento resultou numa perda de intensidade de imuno-fluorescência de Cdc25C em células PC-3, mas não em células LNCaP. A morfologia celular e coloração nuclear DAPI representando células PC-3 e LNCaP tratados com LBH589 foram presos em G2 tardia e fase inicial M, respectivamente (Figura 3A, verde, setas). Para determinar se a célula induzida LBH589 preso na fase G2 ou M, o efeito de separação do centrossoma em LBH589, as características morfológicas da mitose cedo, foram investigados por imuno-coloração com anticorpos y-tubulina. Observou-se a separação dos dois centrossomas apenas em células LNCaP tratadas-LBH589 (Figura 3B), sugerindo que, após tratamento LBH589, células PC-3 foram presos na fase G2 tarde e as células LNCaP foram presos na fase inicial M (mais provável prometáfase ).

(A-B) Imuno-coloração de LNCaP e PC-3. Ambas as células foram tratadas 75 nM LBH589 durante 24 h. Imuno-coloração (A) com Cdc2 e anticorpos Cdc25C e (B) de γ-tubulina (verde) e DAPI (azul) no veículo controlo (esquerda) e tratamento LBH589 (à direita) em células LNCaP. (C-D) MEK inibidor atenuada prisão prometáfase induzida por LBH589 em LNCaP. As células foram pré-tratadas com 30 UO126 durante 30 minutos e tratou-se sequencialmente com LBH589 durante 24 h. (C) Os ciclos celulares foram analisados ​​por coloração de PI-e citometria de fluxo. (D) As células em metafase foram contadas por coloração com DAPI apresentado como cromatina condensado.

Para investigar o envolvimento da activação de ERK, as células LNCaP foram tratadas com o inibidor de MEK, U0126, para inibir a actividade de ERK na presença de LBH589. O G2 /M detenção mediada por LBH589 foi atenuada pela inibição de ERK em células tratadas com UO126 (Figura 3C). Além disso, a inibição de ERK mediada reduzida células prometáfase-LBH589 de 24% para 13% (Figura 3D), sugerindo que a activação de ERK desempenhou um papel importante na paragem prometáfase-LBH589 mediada em células LNCaP.

LBH589 regulada negativamente HDAC6 e sustentada ativação ERK

foram verificados os efeitos da LBH589 sobre HDAC1, HDAC3 e HDAC6. LBH589 regulada negativamente HDAC6 em LNCaP, mas não em células PC-3 (Figura 4A). Além disso, o LBH589 mediada por sub-regulação de HDAC6 correlacionada com a activação de ERK de um modo dependente da dose, mas apenas encontrado em células LNCaP (Figura 4B). A fim de identificar qual de HDAC foi responsável pela activação de ERK, as três proteínas foram derrubados com siRNA para examinar o status de ERK fosforilação em células 293T, uma vez que as células 293T teve alta eficiência de transfecção e tratamento LBH589 também resultou em paragem prometáfase e activação de ERK de 293T células (Figuras S1, S2, S3). Knock-down de HDAC6, mas não HDAC1 ou HDAC3, por siARN fosforilação de ERK induzida significativamente em células 293T (Figura 4C).

(A) Rastreio de HDAC envolvidos na activação de ERK. Os imuno-blottings de LBH589 tratada lisados ​​celulares foram realizadas com os anticorpos indicados. (B) LBH589 induzida a sub-regulação de HDAC6, o que se correlacionou com a activação de ERK em LNCaP, mas não em PC-3. (C) Queda de HDAC6 aumento da actividade de ERK. 293T transfectadas com siARN foi de HDAC1, 3, 6, ou não segmentação durante 72 horas. Os lisatos foram analisados ​​por imuno-blotting. (D) a actividade de ERK estava envolvido em HDAC6 sub-regulação mediada por LBH589. Os lisados ​​celulares a partir de células tratadas com LBH589 ou combinados com UO126 pré-tratamento foram imuno-blotted.

As células LNCaP foram então tratadas com LBH589 e o inibidor de MEK, U0126. A inibição da activação de ERK induzida por LBH589 restaurados os níveis de proteína HDAC6 (Figura 4D). Além disso, ERK foi sobre-expresso em células 293T, o que resultou na diminuição da regulação dos níveis de proteína em comparação com HDAC6 sozinho EGFP-vector (dados não mostrados). Estes demonstraram que a inibição da actividade HDAC6 por activação de ERK induzida LBH589, o que levou à diminuição da regulação dos níveis de proteína HDAC6. A regulação recíproca pode, portanto, existir entre HDAC6 e a via de sinalização ERK.

LBH589 induzida ativação ERK através da via PP1 /c-Raf

Um estudo anterior mostrou que HDACi pode aumentar os níveis de ROS intracelulares e activar a via de sinalização de Ras-Raf [21]. Os níveis de ROS de LNCaP e PC-3 células em tratamento LBH589 foram então investigadas. tratamento LBH589 induzida prisão prometáfase mas não aumentou significativamente os níveis de ROS intracelulares em LNCaP, mas induziu um certo nível em células PC-3 (Figura 5A). tratamento LBH589 também diminuiu a fosforilação em serina 259 (sinal inibidor) e aumentou o (sinal de activação) serina 338 da fosforilação de c-Raf, que se correlacionava com a activação de ERK em LNCaP, mas não em células PC-3 (Figura 5B). Estes sugerido que a activação de ERK induzida por LBH589 pode ser mediada através da activação de c-Raf.

(A) Análise da produção de ROS. As células indicadas foram tratadas com 75 nM LBH589 durante 24 h. ROS foi medida tal como descrito na secção Materiais e Métodos. (B) O padrão de c-Raf via de sinalização no tratamento LBH589. As células foram tratadas com LBH589 durante 24 h e os lisados ​​foram com os anticorpos indicados blotted-imuno. α-catenin era um controle de carga.

LBH589 ligado interação PP1 com 14-3-3ζ e HDAC6

Sobre-expressão de PP1α, mas não PP2A, aumentou a desfosforilação de c -Raf Ser259 e Ser338 da fosforilação e, em seguida ainda mais activado fosforilação de ERK jusante sob tratamento LBH589 em células 293T (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que pode desencadear LBH589 PP1α para activar c-Raf por desfosforilação Ser259 e subsequentemente activação da ERK. Porque ambos os fosfatos de Cdc25C-Ser216 e c-Raf-Ser259 foram substratos para a PP1, foi ainda examinado o efeito de LBH589 em Ser216 fosforilação de Cdc25C. LBH589 tratamento reduziu a fosforilação de Cdc25C Ser216 em uma dose e forma dependente do tempo nas células LNCaP (Figura 6A).

(A) LBH589 induzida Cdc25C-S216 desfosforilação de uma maneira dose e dependente do tempo. LNCaP foi exposto a 75 nM LBH589 por várias vezes, ou em concentrações LBH589 indicados durante 24 h. A fosforilação de Cdc25C-S216 foi realizada por meio de imuno-blotting com anticorpo Pi-Cdc25C-S216. (B-C) tratamento LBH589 trocou o parceiro interagindo PP1α. Os imuno-precipitações foram realizadas com anti-HDAC6 ou anti-14-3-3ζ. As amostras precipitadas foram analisadas por immunoblotting usando anticorpos contra PP1α, 14-3-3ζ, Lis-Ac (lisina Pan-acetilado). IgG era um controle suspenso inespecífica.

14-3-3 era uma proteína acompanhante para manter o estado de fosforilação de S216 da Cdc25C e S259 de c-Raf, protegendo-os de desfosforilação pela PP1 [ ,,,0],10,22]. A interação entre 14-3-3, PP1α e HDAC6 foi verificada usando 14-3-3ζ, anticorpos PP1α e HDAC6 na análise co-imuno-precipitação. tratamento LBH589 aumentou acetilação 14-3-3ζ e sua interação com PP1α (Figura 6B). Em contraste, HDAC6 diminuiu a sua interacção com PP1α LBH589 após o tratamento (Figura 6C). Estes indicaram que HDAC6 pode ser responsável por 14-3-3ζ desacetilação para proteger suas proteínas clientes c-Raf e Cdc25C de desfosforilação pela PP1α.

Discussão

Um estudo anterior revela que o tratamento LBH589 causas G2 /M paragem do ciclo celular através de degradação de Aurora cinases em carcinoma de células renais (RCC) [6]. Da mesma forma, o presente estudo esclarece ainda que LBH589 induz uma paragem fase G2 tardia através da regulação negativa das Aurora cinases em células de cancro da próstata PC-3 com resistência em relação ao tratamento LBH589. HDACIs desencadear uma barreira G2 em células normais, que é geralmente deficiente em células cancerosas, que fornece uma explicação para as células normais são geralmente mais resistentes ao tratamento HDACi [9]. Os mecanismos subjacentes envolvidos na captura de fase G2 mediada LBH589 entre células normais e células de cancro da próstata pode ser diferente. No entanto, os resultados aqui implica que a paragem G2 induzida por LBH589 pode ser um fenótipo de células cancerosas que são mais tolerantes ao tratamento LBH589.

Em contraste com prisão fase G2 mediada por LBH589 de PC-3 células, induz LBH589 prisão prometáfase após a profunda apoptose de células LNCaP. Embora as origens genéticas de linhagens de células de câncer de próstata são diferentes, o tratamento LBH589 induz a ativação ERK e HDAC6 sub-regulação 22Rv1 e DU 145 outros do que as células LNCaP (Figura S4) linhas de células CaP. No entanto, a prisão prometáfase proeminente ocorre apenas em células APC com baixos níveis de base da fosforilação de ERK, que podem ser induzidos por forma sustentável LBH589. LBH589 transiente induz a activação de ERK depois de uma hora de tratamento, que é rapidamente eliminado dentro de 6 horas após o tratamento LBH589 em PC-3 (dados não mostrados).

A inibição da actividade HDAC6 por LBH589 só induz a activação de ERK e não transiente alteração do nível de proteína HDAC6 é observado em células PC-3. Este fenómeno é similar à activação de ERK transitória induzida por mitogénios, tais como EGF em células PC-3. Este estudo mostra que a inibição da HDAC6 por LBH589 directamente-regula a activação de ERK através da via c-Raf /PP1, que é semelhante ao mitogénio estimulação mas com um resultado biológico totalmente oposto da paragem do ciclo celular em vez da proliferação celular.

activação de ERK, que responde a uma variedade de estímulos extracelulares, tais como mitogénios ou tensões, resulta em dramaticamente diferentes consequências biológicas, incluindo a proliferação, diferenciação e morte celular [23-25]. activação de ERK constante pode induzir a morte celular quando as células estavam sob o stress [26]. LBH589 induz a ativação ERK sustentada através de um regulamento para a frente livre entre HDAC6 e ERK em células cancerosas, que não só induz a paragem prometáfase mas também desencadeia a apoptose. Não há nenhuma alteração detectável expressão de ARNm em células LNCaP HDAC6 após o tratamento LBH589 (dados não mostrados). O inibidor de proteassoma restaura os níveis de proteína HDAC6 LBH589 após o tratamento, sugerindo que a depleção de proteínas HDAC6 pode depender de uma via de degradação mediada por proteassoma (dados não mostrados). No entanto, porque LBH589 selectivamente regulação negativa proteínas HDAC6 e Aurora quinases A e B em certas linhas celulares de cancro específicos permanece obscura.

HDAC6 pertence ao subtipo de classe IIa de famílias de HDAC. Ele transporta entre o núcleo e citoplasma para atingir as suas funções biológicas. HDAC6 é o principal deacetilase que é responsável pela desacetilação da α-tubulina e HSP90 para modular proteínas de transporte dependente de microtubulin, recrutar mis-dobrado, e transporte para aggresomes para a degradação [27-29]. Além de participar em muitas funções celulares normais, HDAC6 podem ser necessários para transformação oncogénica eficiente e pode estar envolvido na cascata do factor de crescimento transformante β1 (TGF-β1) epitelial-mesenquimal transição induzida [30,31]. Estes dados indicam o importante papel dos processos HDAC6 em oncogénicos.

tem sido relatado que células de leucemia mielóide aguda, em que faltam HDAC6 são altamente resistentes ao grupo hidroxamato HDACIs [32]. Assim, HDAC6 podem servir como um alvo terapêutico fundamental para HDACIs no tratamento do cancro. Desde LBH589 é um grupo hidroxamato potente HDACi com forte efeito inibidor sobre HDAC6, LBH589 tem a vantagem de aplicação clínica no tratamento de cancros com expressão HDAC6. Embora a actividade da enzima de HDAC6 pode ser inibida por ambos LBH589 em células PC-3 e LNCaP de CaP, LBH589 depleta selectivamente quer HDAC6 quinases Aurora ou em LNCaP e PC-3 de células APC com resultados biológicos distintos, respectivamente. Este estudo levanta a importante questão de por que LBH589 esgota selectivamente quer HDAC6 ou Aurora cinases através de uma via de degradação do proteassoma em células CaP diferentes. Compreender os mecanismos moleculares por trás dessa discrepância na resposta terapêutica dos LBH589 em diferentes células CaP pode fornecer mais insights para a aplicação clínica de LBH589.

Os resultados aqui provam que LBH589 induz a ativação ERK pela inibição da atividade HDAC6 em certas células . activação de ERK é controlado pela via de Ras /Raf /MEK a montante [33]. A desfosforilação de S259 de c-Raf por dois fosfatases PP1, PP2A, ou resulta na libertação de c-Raf de 14-3-3 e permite a reactivação de c-Raf, que por sua vez desencadeia a actividade de ERK [34]. HDAC1, 6, e 10 têm sido relatados para formar um complexo com a PP1, respectivamente. HDACIs interromper selectivamente o complexo HDAC-PP1 e aumentar a associação de PP1 e Akt, o que contribui para a actividade anti-neoplásicas de HDACi [35]. O presente estudo mostra que LBH589 perturba o HDAC6 /PP1α complexo e promove a interação entre PP1α e 14-3-3ζ acetilada. Quando PP1α está associada com 14-3-3ζ, PP1α ainda mantém a sua actividade de fosfatase [36]. Com LBH589 mudar seu parceiro interagindo, PP1α pode alterar a sua afinidade ou especificidade para substratos. Mais uma vez, uma questão importante é levantada sobre se HDACs estão envolvidos na regulação do ciclo celular, alterando afinidade ou especificidade do PP1α dos substratos.

Além de ativação ERK, a inibição da HDAC6 por LBH589 também induz Cdc25C hiper- fosforilação pela remoção de fosforilação inibidora de serina 216 da Cdc25C. desfosforilação induzida por LBH589 de S216 da Cdc25C também é regulada por PP1α e 14-3-3ζ com os mesmos mecanismos responsáveis ​​pela S259 desfosforilação de c-Raf. Assim, HDAC6 não só participa na regulação do c-Raf /via de sinalização PP1 /ERK, mas também coordena a ERK cascata de sinalização para M transição do ciclo celular fase.

Este estudo propõe um modelo para explicar como LBH589 induz prometáfase prender. Quando HDAC6 liga-se com uma HDACi, tais como LBH589 neste estudo, pode causar uma mudança conformacional na HDAC6, conduzindo à dissociação de PP1α e o reforço da acetilação 14-3-3ζ. 14-3-3ζ acetilado tem elevada afinidade para ligação com PP1α e modular a afinidade de ligação a PP1α seus substratos. Além disso, os fosfatos de c-Raf-Ser259 e Ser216-Cdc25C são desfosforilado por PP1α e estes induzem a activação de ERK constante. Sustentar a ativação ERK pode desestabilizar proteínas HDAC6 e Cdc25C hiper-fosforilam, levando à interrupção do ciclo celular prometáfase de células LNCaP (Figura 7).

ligação a HDAC6 LBH589 pode causar mudança conformacional na HDAC6, levando à dissociação do PP1α e valorização da acetilação 14-3-3ζ. Acetilado 14-3-3ζ aumentou sua afinidade interagindo com PP1α e interferiu na afinidade de ligação PP1α com substrato. PP1α depois desfosforilado S259 de c-Raf e S216 de Cdc25C, provocando a activação de ERK. ativação ERK constante devido à ativação de c-Raf pode desestabilizar proteínas HDAC6 e Cdc25C hiper-fosforilam, levando à interrupção do ciclo celular prometáfase de células LNCaP.

Em conclusão, LBH589 induz a ativação ERK sustentado através regulação para a frente livre que inibe a actividade da enzima HDAC6, seguido pela regulação negativa da expressão da proteína HDAC6. Estes achados responder à questão de como a ativação ERK pode ser responsável por ambos os proliferação celular e inibição do crescimento fenótipos. HDAC6 é um fator essencial crucial para a interação entre a via de sinalização Raf /ERK e de transição do ciclo celular fase M biológica, que o torna um alvo perfeito para HDACi LBH589. Este estudo esclarece ainda mais o G2 tardia mediada por LBH589 e parada do ciclo celular fase M prematura por mecanismos moleculares distintos em células PC-3 e LNCaP APC com diferentes resultados terapêuticos. Portanto, os mecanismos detalhados responsáveis ​​pela inibição do crescimento mediada por LBH589 de células de câncer de próstata são desvendados para fornecer novos insights que podem orientar a elaboração de estratégias mais eficazes que irá otimizar a terapia anti-câncer HDACi para a tradução clínica.

Materiais e Métodos

Reagentes

LBH589 foi fornecido pela Novartis Pharmaceuticals (East Hanover, NJ) dissolvidos em dimetilsulfóxido (DMSO). Suberoyl Ácido Bishydroxamic (SBHA) e ácido hidroxâmico suberoilanilida (SAHA) eram de ATON Pharma (Tarrytown, NY). iodeto de propídio (PI), 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), ARNase A e um cocktail de inibidores de protease foram adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . UO126 e PD98059 foram adquiridos de Calbiochem.

cultura celular

LNCaP, PC-3, e 22Rv1 foram gentilmente cedidas pelo Dr. Pei-Wen Hsiao (Agricultural Biotechnology Research Center, Academia Sinica, Taiwan ) [37]. DU 145 e 293T foram comprados da coleção Bioresource e Research Center (BCRC, Taiwan). linhas de PC-3 e células 293T foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco, enquanto LNCaP e 22Rv1 foram cultivadas em meio RPMI-1640. A DU 145 foram mantidas em meio de Eagle modificado. Todos os meios foram suplementados com 10% de soro inactivado por calor fetal bovino, glutamina 2 mM, piruvato de sódio 1 mM, 50 U /ml de penicilina, e 50 mg /ml de estreptomicina. As células foram cultivadas a 37 ° C num CO humidificada com 5%

2 /atmosfera de ar.

ensaios MTT

As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a uma densidade de 3000 -5000 células por cavidade, dependendo da linha de células, tratadas com veículo (DMSO) ou diferentes doses de LBH589, SAHA, e SBHA usando cinco poços por tratamento. Ao fim de 24, 48 e 72 h de tratamento, os meios foram movidos e 100 ul de 1 mg /mL de MTT foi adicionado antes da incubação a 37 ° C.