Abstract

O conhecimento sobre o papel da caveolina-1 (Cav-1) proteína na adesão endotélio das células cancerosas não é clara. O presente estudo revelou que Cav-1 desempenha um papel regulador negativo na interação do cancro do endotélio. Endógena Cav-1 foi mostrado para regular negativamente durante a separação celular e ao nível de uma tal proteína foi inversamente associados com a adesão do tumor-endotelial. Além disso, a sobre-expressão ectópica de Cav-1 atenuou a capacidade das células cancerosas a aderir ao endotélio enquanto shRNA mediada Cav-1 knock-down exibiu o efeito oposto. Descobrimos que desprendimento de células aumentou de peróxido de hidrogênio celular e hidroxilo geração de radicais e tais espécies reactivas de oxigénio (ROS) foram responsáveis ​​pelo aumento da interação entre células cancerosas e células endoteliais através vascular molécula-1 de adesão da célula endotelial (VCAM-1). Importante, Cav-1 foi mostrado para suprimir o peróxido de hidrogénio e a formação de radicais hidroxilo, por sustentar o nível de Akt activado que era crítico para a função de Cav-1 em atenuar a adesão celular. Juntos, o presente estudo revelou o novo papel de Cav-1 e mecanismo subjacente na adesão tumor que explicar e destacar o importante papel de Cav-1 sobre a metástase de células de câncer de pulmão

Citation:. Chanvorachote P, Chunhacha P ( 2013) Caveolina-1 regula endotelial adesão de células do cancro do pulmão através de oxigênio reativo Mecanismo dependente da espécie. PLoS ONE 8 (2): e57466. doi: 10.1371 /journal.pone.0057466

editor: Chih-Hsin Tang, China Medical University, Taiwan

Recebido: 18 Outubro, 2012; Aceito: 21 de janeiro de 2013; Publicação: 27 de fevereiro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chanvorachote, Chunhacha. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é apoiada por doações do Fundo Tailândia Research (P. Chanvorachote) e pós-doutorado (Fundo de doações Ratchadaphiseksompot, Universidade Chulalongkorn). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, papéis de caveolin-1 (Cav-1) na regulação da progressão e metástase em vários tipos de câncer de câncer foram revelados [1] – [4] e tal proteína talvez recebido mais atenção na cancer-related pesquisa. Embora alguns estudos sugeriram que Cav-1 pode desempenhar um papel na inibição da progressão do cancro em certos cancros [5], no cancro do pulmão, o CAV-1 potencializa a agressividade do cancro, bem como metástase [6]. Juntamente com o facto de Cav-1 expressão no câncer de pulmão foi mostrado para se relacionar com mau prognóstico [2], e na maioria das mortes relacionadas ao câncer em esse tipo de câncer foi mostrado para conectar-se com metástase, é de grande interesse para investigar a toda papel regulatório desta proteína nas metástases do cancro [7]. A metástase é um processo multi-passo das células cancerosas que espalham de seus locais originais para os sites secundários distantes. Começando com o destacamento de células de cancro do seu tumor primário, as células de invadir parede vascular, de deslocamento no sistema circulatório, e aderem ao endotélio para formar os tumores secundários. Embora papéis de Cav-1 sobre os comportamentos de células de cancro do pulmão têm sido intensamente explorada, o papel de uma tal proteína de adesão celular do cancro do pulmão de superfície endotélio é em grande parte desconhecida. Nós e outros sugeriram o papel importante do Cav-1 na prestação de células cancerosas resistentes a anoikis após o desprendimento de células [6], [8], [9], [10], o reforço invasão e migração [11] e facilitar o crescimento na independente de ancoragem forma [12]. Endógena Cav-1 nível foi mostrado em estudos anteriores ser controlada pelas espécies reactivas de oxigénio (ROS). Na condição célula individual, com peróxido de hidrogénio foi demonstrado que o aumento do nível celular de Cav-1 por inibição da sua degradação [6]. Enquanto nas células aderentes, radical hidroxila mostrou ser um jogador chave no up-regulação Cav-1 expressão e aumento da migração de células [11]. Estes achados destacou o papel regulador do ROS em Cav-1 expressão e seus acompanham papéis na metástase do câncer.

Em biologia, existem regulamentos de feedback negativo para evitar que os estímulos excessivos. Da mesma forma, foi mostrado Cav-1 proteína para suprimir o estresse oxidativo causado por exposições de peróxido de hidrogênio [13]. No entanto, não se sabe se Cav-1 regula o nível de ROS em células isoladas e essa regulamentação é fundamental para a propriedade adesiva câncer. Usando abordagens farmacológicas e genéticas, o presente estudo revelou que Cav-1 desempenha um papel fundamental na inibição da adesão de câncer do endotélio atenuando peróxido de hidrogênio e radicais hidroxila gerações após o desprendimento de células. O presente estudo também descobriu que Cav-1 suprimida tal formação de ROS através de um mecanismo dependente de Akt. Juntamente com a observação de que Cav-1 diminuiu de uma forma dependente do tempo depois da separação de células, observou-se que mais tarde no tempo de pontos, cancro do endotélio aumentou significativamente a adesão concomitante de que a depleção de Cav-1. Assim, nosso estudo revelou a existência de um romance mecanismo de adesão célula cancerosa sobre Cav-1, que pode ser explorada em metástase e drogas design.

Materiais e Métodos

Células e Reagentes

de não-pequenas células do cancro do pulmão (NSCLC) -H460 e células vasculares do endotélio humano (HUV-EC-C) foram obtidos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). As células H460 foram cultivadas em meio RPMI 1640, enquanto as células HUV-EC-C foram cultivadas em meio M199. RPMI 1640 foi suplementado com 5% de soro fetal de bovino (FBS), 2 mM de L-glutamina, e 100 unidades /mL de penicilina /estreptomicina. M199, suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 10 mM de L-glutamina, e 100 unidades /mL de penicilina /estreptomicina, 0,1 mg /ml de heparina, 0,05 mg /ml de suplemento de crescimento de células endoteliais (ECGS). Toda a cultura foi incubada numa CO 5%

2 ambiente a 37 ° C. 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (DCFH

2-DA), dimetilsulf óxido (DMSO), Kit de isolamento caveolae, calceína AM, heparina de sódio foram obtidos da Sigma Chemical, Inc. (St. Louis, MO); caveolin-1 de anticorpo de coelho e o anticorpo secundário conjugado com peroxidase de Abcam (Cambridge, MA); Hydrophenyl fluoresceína (HPF), LY294002, Amplex Red, Lipofectamine 2000 foram de Invitrogen (Carlsbad, CA); Anticorpo para β-actina a partir de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA); Anticorpo para o pan-Akt, P473-Akt, PTEN, EGFR, Phospho-PTEN (Ser380 /Thr382 /383) foram de Cell Signaling Technology, Inc. (Danvers, MA); suplemento de crescimento de células endoteliais foi da Millipore Corporation (Billerica, MA):

plasmídeo e transfecção

O plasmídeo de expressão Cav-1 pEX_Cav-1 e seu vetor de controle.; pDS_XB-YFP foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e Cav-1 knockdown plasmídeo shRNA-Cav-1 e seu vetor de controle; Um plasmídeo de controlo shRNA foram obtidos de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). transfecções estáveis ​​de Cav-1 plasmídeo de expressão ou plasmídeo Cav-1 knockdown foram gerados através da cultura de células H460 em uma placa de 6 cavidades até atingirem 60% de confluência. 15 ul de reagente de lipofectamina e 2 ug de Cav-1, e shRNA-VAG-1 de plasmídeo foram usadas para transfectar as células na ausência de soro. Após 12 h, o meio foi substituído com meio de cultura contendo soro fetal bovino a 5%. Aproximadamente 36 h após o início da transfecção, as células foram digeridos com 0,03% de tripsina, e as suspensões de células foram plaqueadas em frascos de cultura de 75 mL e cultivadas durante 24 a 28 dias com G418 ou puromicina para selecção de Hcav-1 e shCav- 1, respectivamente. Os transfectantes estáveis ​​foram reunidas e a expressão de uma proteína de Cav-nos transfectantes foi confirmada por transferência Western. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 isento de antibiótico para, pelo menos, duas passagens antes utilizados em cada experiência.

ROS Detecção

intracelular de ROS foi determinada por citometria de fluxo utilizando DCFH

2-DA como uma sonda fluorescente. Resumidamente, as células foram incubadas com 10 uM DCFH-DA, HPF durante 30 min a 37 ° C, após o que foram lavadas, tratadas com tripsina, ressuspendidas em solução salina tamponada com fosfato, e imediatamente analisados ​​para a intensidade de fluorescência por FACScan citómetro de fluxo (Beckton Dickinson, Rutherford, NJ), utilizando um feixe de excitação de 488 nm e um filtro passa-banda de 538 nm. intensidade de fluorescência média foi quantificada por software CellQuest (Becton Dickinson) a análise dos histogramas gravados.

H

2O

2 foi determinada por reagente Vermelho Amplex (Invitrogen). Resumidamente, a mistura de reacção contendo 50 ^ M de reagente Vermelho Amplex e 0,1 U /ml de HRP em fosfato Krebs-Ringer (KRPG) foi adicionado em cada poço da microplaca. Subsequentemente, 20 uL de 1,5 × 10

4 H460 células suspensas em KRPG foi adicionado à mistura de reacção. Após 30 min de incubação, o sinal de fluorescência obtido a partir do leitor de microplacas de fluorescência equipado para a excitação na gama de 530-560 nm e detecção de emissão a 590 nm foi monitorizada e medida ao longo de 3 h pós-descolamento.

monocamada Adesão celular Ensaio

HUV-EC-C foram estimuladas com 10 ng /ml de IL-1

β Compra de 0-4 h. As células H460 (2,5 × 10

4 células /ml) foram coradas com 15? M de AM calceina (Sigma) durante 45 min a 37 ° C e 5% de CO

2, em seguida, adicionado em uma cultura monocamada semi- confluente de HUV-EC-C, incubou-se durante 20 min a 37 ° C com rotação a 120 rpm, e lavou-se extensivamente a excluir a ligação de células não específicas. O número de células ligadas foi contada directamente sob um microscópio de fluorescência como relatado anteriormente [14]. Para mediada por anticorpo de bloqueio de adesão celular, o IL-1β estimulada por HUV-EC-C foram incubadas com anticorpo para VCAM-1, ICAM-1 e E-selectina (a uma diluição final de 1:400 para cada anticorpos) durante 3 h a 37 ° C em CO2 humidificado incubadora, e, em seguida, foram adicionadas células H460.

cavéola isolamento

cavéola foram isolados a partir shCav-1, H460 e Hcav-1 células, utilizando um isolamento caveolae kit (Sigma). ShCav-1, H460 e células Hcav-1 foram recolhidas e lisadas com tampão de lise contendo 1% de Triton X-100. Os lisados ​​foram centrifugados a 10.000

g

durante 15 min. fracções de membranas resistentes a detergente foram isoladas em gradiente de densidade OptiPrep médio (0, 20, 25, 30, e 35%). Cavéolas foram coletados a partir de fracções enriquecidas caveolina-1-, que tem sido usado para a investigação de Cav-1 e PTEN expressão.

Western Blotting

Depois de tratamentos específicos, as células foram incubadas em tampão de lise contendo Tris-HCl 20 (pH 7,5), 1% de Triton X-100, cloreto de sódio 150 mM, glicerol a 10%, ortovanadato de sódio 1 mM, fluoreto de sódio 50 mM, fluoreto de fenilmetilsulfonilo 100 mM, e um cocktail de inibidor de protease comercial (Roche molecular Biochemicals) durante 30 min em gelo. Os lisados ​​celulares foram recolhidos e determinado para o conteúdo de proteína utilizando o método de Bradford (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Uma quantidade igual de proteínas de cada uma das amostras (40 ug) foram desnaturadas por aquecimento a 95 ° C durante 5 min com tampão de carga Laemmli, e subsequentemente carregado em electroforese em gel de 10% SDS-poliacrilamida. Após separação, as proteínas foram transferidas para membranas de nitrocelulose de 0,45 um (Bio-Rad). As membranas transferidas foram bloqueadas durante 1 hora em 5% de leite em pó magro em TBST (Tris-HCl 25 (pH 7,5), NaCl 125 mM, 0,05% de Tween 20) e incubadas com os anticorpos primários apropriados a 4 ° C durante a noite. As membranas foram lavadas duas vezes com TBST, durante 10 min e incubaram-se com anticorpos secundários específicos do isotipo acoplado a peroxidase de rábano silvestre durante 1 hora à temperatura ambiente. Os complexos imunes foram detectados por reforçada com substrato quimiluminescência. (Supersignal West Pico; Pierce) e quantificadas utilizando o software analista /PC densitometria (Bio-Rad)

Análise Estatística

Os dados médios de experimentos independentes foram normalizados para resultar a partir de células no controlo. Todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes. A análise estatística entre os dois grupos foi verificada pelo teste t de Student, em comparação a vários grupos, foi realizada uma análise de variação (ANOVA) com o teste post hoc. A força dos relacionamentos, o coeficiente de correlação (

r

), entre cada nível de proteína após o desprendimento foi determinada com SPSS versão 16 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). A P-valor inferior a 0,05 seria considerado como estatisticamente significativo.

Resultados

Caveolina-1 Esgotamento após celular Destacamento Melhora celular Tumor-endotelial Adesão

Cav-1 foi mostrado para associar-se com potenciais metastáticos de células de câncer de pulmão [6], [12], ao passo que o seu papel na adesão de células de câncer ainda é incerto. Para estudar o papel da proteína Cav-1 sobre a adesão de células de cancro, que em primeiro lugar as células cancerosas individual para imitar o passo precoce de metástases, e avaliado o perfil de expressão de Cav-1 após separação celular ao longo do tempo. células de pulmão H460 do cancro cultivadas em pratos de fixação ultrabaixo foram analisados ​​de CAV-1 expressão de proteínas por transferência de Western em pontos de tempo indicados. A Figura 1A mostra que depois da separação de células, o CAV-1 diminuiu gradualmente de uma forma dependente do tempo e da diminuição significativa foi detectado tão cedo como 6 h depois da separação de células. Em seguida, as células em suspensão em pontos de tempo em simultâneo foram submetidos a ensaio de adesão de células em monocamada, tal como descrito em

Materiais e Métodos

. As Figuras 1A e B mostram que depois da separação de células, o CAV-1 expressão diminuiu gradualmente ao longo do tempo concomitante com o aumento da adesão de células de cancro em superfícies endoteliais, o que sugere o papel potencial de Cav-1 na regulação adesiva cancro. Nós ainda apoiada tal correlação, gerando uma curva de correlação entre Cav-1 expressão e adesão de células de câncer (Fig. 1 C). Não só a redução destas proteínas correlaciona bem com a capacidade aumentada de células cancerosas a aderir em superfícies endotélio, mas o enredo também revelou um perfil altamente correlacionado com o coeficiente de correlação de 0,922

A.:

células H460 foram suspensas em placas de HEMA-poli-revestido para várias vezes (0-12 h) e 1-Cav expressão foi analisada por western blotting. As colunas são médias ± DP (

n =

5). *

P

0,05 vs

tempo 0. B:

células destacadas H460 foram submetidos a uma cultura em monocamada de HUV-EC-C. A interacção de H460 e células HUV-EC-C foi examinada na presença de IL-1

β

(10 ng /ml). De contraste de fase imagens microscópicas de experiências representativas são mostrados.

C: A análise de correlação

de Cav-1 nível celular contra H460-HUV-EC-C aderência (

n

= 5).

D: células shCav-1