Abstract

genes da longevidade Inúmeros foram descobertos em organismos-modelo e alterando os seus resultados de função na vida útil prolongada. Em mamíferos, alguns têm especulado que os benefícios de saúde derivados de manipulação desses mesmos percursos pode ser compensado pelo aumento do risco do cancro devido à sua propensão para aumentar a sobrevivência celular. A família Sir2 /SIRT1 de NAD

+ – desacetilases dependentes é proposto para subjacentes os benefícios de saúde da restrição calórica (CR), uma dieta que, grosso modo suprime o cancro em mamíferos. Aqui mostramos que CR induz uma expressão dupla SIRT1 aumento no intestino dos roedores e que a indução ectópica de SIRT1 num modelo de ratinho β-driven-catenina de cancro do cólon reduz significativamente a formação do tumor, proliferação e morbidade animal na ausência de CR. Mostramos que SIRT1 deacetylates β-catenina e suprime a sua capacidade para activar a transcrição e conduzir a proliferação celular. Além disso, promove SIRT1 localização citoplasmática da forma em contrário nuclear localizada oncogénica de β-catenina. Consistente com isto, uma correlação inversa significativa foi encontrada entre a presença de SIRT1 nuclear e a forma oncogénica de β-catenina em 81 amostras de tumor de cólon humanas analisadas. Em conjunto, estas observações mostram que SIRT1 suprime a formação de tumor intestinal

in vivo

e levantar a perspectiva de que terapias enfocadas SIRT1 podem ser de uso clínico em doenças malignas β-catenina-driven

Citation:. Firestein R, G Blander, Michan S, Oberdoerffer P, S Ogino, J Campbell, et ai. (2008) O SIRT1 Deacetylase Suprime Intestinal Tumorigênese e Crescimento cancro do cólon. PLoS ONE 3 (4): E2020. doi: 10.1371 /journal.pone.0002020

editor: Mikhail V. Blagosklonny, Instituto de Pesquisa Ordway, Estados Unidos da América

Recebido: 05 de março de 2008; Aceito: 11 de março de 2008; Publicação: 16 de abril de 2008

Direitos de autor: © 2008 Firestein et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. RF foi suportado pelo NIH Grant T32. GB por um pós-bolsa Estee Lauder. PO por um Space Institute Biomedical Research Grant Nacional. DAS, SO, CSF e LG por concessões do NIH; RD em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural do NIH /NIA. DS também é apoiado por um presente do Paul F. Glenn Fundação

Conflito de interesses:. Leonard Guarente e David Sinclair são consultores a Sirtris Pharmaceuticals. William Hahn é um consultor para Novartis Pharmaceuticals.

Introdução

O câncer é a segunda principal causa de mortalidade relacionada à idade em humanos. A restrição calórica prolonga a vida em todos os organismos testados e em mamíferos exerce efeito supressor de tumor fortes [1]. Em eucariotas inferiores, o

gene SIR2

é proposta para mediar os benefícios de saúde do CR [2], [3]. SIRT1, o ortólogo de mamífero do

SIR2

, é induzida por CR em vários tecidos de mamíferos, e foi mostrado para aliviar doenças degenerativas associadas com o envelhecimento, tais como a neurodegeneração e metabólica declínio [4]. Enquanto CR é conhecido por inibir a formação de tumores espontâneos e induzidos tanto, um papel para SIRT1 neste processo continua por demonstrar [5]. Existem dados conflitantes

in vitro

quanto ao facto de SIRT1 será encontrado para agir como um oncogene ou como um supressor de tumor, mas até agora não houve nenhum

In vivo

estudos que abordam esta questão. Por um lado, SIRT1 é regulada positivamente em tumores e células cancerosas sem o gene supressor de tumor, HIC1 [6], pode inibir a apoptose [7], [8], [9], [10] e regula negativamente a expressão de tumores genes supressores [11], levando muitos a concluir que SIRT1 irá provar ser um oncogene

in vivo

. Por outro lado, a SIRT1 pode ser pro-apoptótica [12] e anti-proliferativa [13], [14], e, consequentemente, tem sido proposta a comportar-se como um supressor tumoral

In vivo

. Além disso, alguns têm argumentado que genes da longevidade de mamíferos que atrasam doenças atróficas relacionadas com a idade pode inversamente predispor seres humanos a uma maior incidência de câncer devido à sua função anti-apoptótica [15]. Este estudo aborda esta questão controversa, testando os efeitos da SIRT1 na formação de tumores e crescimento.

Nós escolhemos para testar o efeito da SIRT1 no APC

min /modelo + de cancro do cólon para uma variedade de razões : é fisiologicamente recapitula os eventos precoces de cancro do cólon em seres humanos, o mecanismo de tumorigénese é bem caracterizado, e CR foi anteriormente mostrado para reduzir a taxa de desenvolvimento de neoplasias neste modelo [16]. A APC

min /rato + contém uma mutação da linha germinativa no gene de polipose adenomatosa coli (APC) supressor de tumores [17]. perda somática do segundo alelo leva a localização nuclear constitutiva de β-catenina e a formação de adenoma [18], [19].

β-catenina é o efector central da via canonical sinalização de Wnt que controla a manutenção de células estaminais , desenvolvimento e carcinogênese [20]. A activação constitutiva da via β-catenina foi encontrado em 90% dos cancros colorrectais [21], [22]. Além disso, esta via é activado de forma aberrante em muitos outros cancros, incluindo o da próstata, mama, ovário e melanoma. Curiosamente, dois estudos recentes têm demonstrado que o aumento da sinalização de Wnt está associada com o envelhecimento acelerado, o que sugere que uma atenuação de sinalização Wnt pode subjacentes CR e ser benéfico não só para o tratamento de cancro, mas de um modo mais geral atenuando doenças do envelhecimento [23], [24] .

Nós relatamos aqui que SIRT1 suprime tumorigênese intestinal na APC

min modelo /+ mouse e inibe o crescimento do câncer de cólon. Nós fornecer evidência substancial de que os efeitos anti-tumorigénica de SIRT1 dependerá da sua actividade de desacetilase e são mediadas através da inibição da β-catenina. Estes resultados identificam uma função supressora de tumor de SIRT1, fornecer uma visão mecanicista, e sugerem um papel terapêutico para ativadores SIRT1 deacetilase no câncer de cólon.

Resultados

Estudos anteriores mostraram um efeito supressor tumoral dramática CR mas o mecanismo (s) molecular são presentemente desconhecidos. Observou-se que os ratos com uma dieta CR tem ~ 2 vezes maiores níveis de SIRT1 no intestino epitélio em relação ao

ad lib

controles -fed (Fig. 1A). Para testar o efeito de aumentar a expressão SIRT1 em células epiteliais do intestino, que gerou um ratinho transgénico SIRT1 floxed (Fig. 1B). camundongos transgênicos SIRT1 foram cruzados com APC

mínimo de ratos /+ seguidos de reprodução com a estirpe Villin-Cre [25]. Assim, geramos triple ratinhos transgénicos (SIRT1

ΔSTOP; Vil-Cre; APC

min /+) que superexpressam SIRT1 especificamente nas vilosidades do intestino (referido como SIRT1

ΔSTOP). Os níveis SIRT1 no intestino de SIRT1

ΔSTOP ratinhos foram de aproximadamente 7 vezes (Fig. 1E) e a morfologia das vilosidades pareceu de outra maneira normal (Fig. 1F).

(A) análise de transferência de Western que mostra os níveis de expressão no epitélio intestinal de SIRT1 em ratos alimentados ad libitum (AL) ou restrição calórica (CR). β-actina serviu como o controlo de carga em todas as pistas. (B) Representação esquemática da estratégia utilizada para a geração do rato floxed SIRT1 estaminais embrionárias (MES) células. SIRT1 foi clonado a jusante de um promotor constitutivo CAGGS seguido por uma cassete de loxP-Stop-loxP transcricional. Esta construção foi especificamente alvejado na UTR 3 ‘do locus de colagénio A1 (ColA1) de células estaminais embrionárias de ratinho (MES) células por recombinação FLP. As células-alvo MES foram injectados em blastocistos. As setas vermelhas indicam localização dos primers de genotipagem SIRT1-Tg. (C) Southern blot mostrando a confirmação da SIRT1

Parar de integração único dentro do locus Col1A de células MES. (D) PCR confirmando a transmissão germinal da SIRT1

PARAR transgene para a prole das quimeras. (E) Western blot mostrando os níveis de SIRT1 nos ratinhos transgénicos triplos com superexpressão SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) e controles (SIRT1

STOP). β-actina serviu como o controlo de carga em todas as pistas. stain (F) mucina e imuno-histoquímica da SIRT1 no intestino delgado do experimental (SIRT1

ΔSTOP) e controles (SIRT1

STOP) animais.

APC

min /+, SIRT1

camundongos comando de paragem que não superexpressam SIRT1 (referido como SIRT1

STOP) mostrou os sinais típicos de morbidade tumor com 16 semanas de idade, como evidenciado pela anemia aberta e caquexia, enquanto APC

min /+ camundongos com superexpressão SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) exibido há sinais evidentes de morbidade associado a tumor (Fig. S1A, B). O exame do intestino forro aos quatro meses de idade mostrou que os ratos SIRT1

ΔSTOP transgênicos tinham tumores significativamente menores e menos ao longo do trato intestinal (Fig. 2A). Quantificação da carga de tumor revelou um 3 a 4 vezes na redução do número e tamanho dos adenomas dentro do intestino delgado e cólon dos SIRT1

ΔSTOP ratinhos (Fig. 2B). Ki-67 é uma componente granular da nucléolo que é expresso exclusivamente em células em proliferação e é utilizado como um marcador de prognóstico em neoplasias humanas. Adenomas dos SIRT1

ΔSTOP ratos tiveram uma redução significativa do número de mitoses (por campo de alta potência) e Ki-67 coloração, demonstrando que houve uma diminuição na proliferação adenoma (Fig. 2C). Estes dados demonstram que a sobre-expressão de SIRT1 no intestino em níveis semelhantes aos induzidos por CR é suficiente para imitar o efeito supressor de tumor de CR na APC

min /rato +.

(A) Imagens de duodenal todo e seções ileal mostrar tumores bruta intestinal em camundongos com superexpressão SIRT1 (SIRT1

ΔSTOP) e controles (SIRT1

Parar). linha sólida indica junção gastro-duodenal. As setas indicam os adenomas. barra branca indica a escala de 1 mm. (B) Número médio de tumores de acordo com a localização intestinal em SIRT1

Parar o controle (n = 8) e SIRT1

camundongos experimental ΔSTOP (n = 11). (C) Ki-67 de coloração de adenomas e as taxas de proliferação. Imagens mostram Ki-67 coloração imuno-histoquímica de adenomas da SIRT1

STOP e SIRT1

ΔSTOP. índice de proliferação é expressa como a percentagem de Ki-67 células de adenoma manchados (uma média de pelo menos 10 adenomas por coorte). índice mitótico é calculado como o número de figuras mitóticas histologicamente identificáveis ​​por 10 campos de alta potência (400 ×). Valores em B e C são médias ± D.P..

Para obter insights sobre os mecanismos pelos quais SIRT1 reduz a proliferação celular, que analisou o efeito da SIRT1 na taxa de crescimento de várias linhas celulares de cancro bem caracterizados. A proliferação de células de cancro da próstata LNCaP foi grandemente reduzida por sobre-expressão de SIRT1 e o efeito foi semelhante ao suprimir-se β-catenina (Fig. 3A). Esta observação sugeriu que SIRT1 e função β-catenina no mesmo contexto celular. Para explorar mais esta possibilidade, que sobre-expresso SIRT1 e um mutante SIRT1 cataliticamente inactivo (SIRT1

ΔHY) em diferentes linhas celulares de cancro de cólon humano, cujo crescimento é impulsionado por β-catenina constitutivamente activa (HCT116 e DLD1). Uma linha celular de cancro do cólon humano em que β-catenina é inactiva (RKO) serviu como um controlo negativo. O aumento da expressão SIRT1 reduziu grandemente a proliferação em ambas as linhas de células de cancro do cólon com β-catenina constitutivamente activo, mas não na linha celular-β-catenina inactiva (Fig. 3A-D). O SIRT1

ΔHY mutante catalítico não teve nenhum efeito significativo na proliferação celular em nenhuma das linhas celulares (Fig. 3B-D). Assim, suprime a proliferação de SIRT1-driven-catenina β e a sua actividade catalítica é aparentemente necessária para este efeito.

(A-D) Estável LN-PAC, linhas celulares DLD1, HCT116 e RKO que expressam o produto indicado foram semeadas e o número de células foi monitorizada em diferentes pontos de tempo. Western blot foram realizadas com anticorpos SIRT1, actina ou β-catenina. As linhas celulares estáveis ​​(E) DLD1 expressam Topflash-LuciferasePEST foram infectadas com as construções indicadas. As células foram analisadas por Western blot com anticorpos contra SIRT1 e β-catenina. A actividade de luciferase foi normalizada para a proteína total da amostra e representa três experiências independentes efectuadas em quadruplicado.

Para uma melhor compreensão do mecanismo pelo qual a SIRT1 suprime a proliferação β-driven-catenina, que a linha celular manipulada para conter DLD1 um repórter integrado de forma estável com β-catenina elementos de resposta (Super8XTopflash-luciferase

PEST). Knockdown de β-catenina reduziu dramaticamente a actividade repórter, o que demonstra a dependência da actividade endógena repórter em β-catenina (Fig. 3E). A sobre-expressão de actividade repórter reduzida SIRT1 por ~ 2 vezes, ao passo que o SIRT1

ΔHY mutante catalítico não teve nenhum efeito (Fig. 3E), sugerindo que os efeitos anti-proliferativos de SIRT1 são mediados através da sua capacidade para suprimir a actividade de transcrição de endógena β-catenina e que isso requer atividade SIRT1 deacetilase.

a acetilação da β-catenina por p300 /CBP potencializa sua oncogenicity aumentando β-catenina /TCF avidez em promotores de genes-alvo [26]. Para testar se modifica SIRT1 β-catenina, células HEK293T foram transfectadas com uma forma mutante de β-catenina que constitutivamente localiza no núcleo (S33Y-β-catenina) [27]. Nestas células SIRT1 co-imunoprecipitada com β-catenina (Fig. 4A) e vice-versa (Fig. 4B). Uma interacção entre SIRT1 endógena e β-catenina também foi evidente (Fig. 4C).

células 293T (a) humana foram transientemente transfectadas com HA-S33Y-β-catenina em combinação quer com SIRT1 marcado com FLAG ou controle de vetores. Alíquotas de proteína total foram sujeitas a imunoprecipi tacão com anticorpo anti-FLAG (FLAG IP). As proteínas imunoprecipitadas foram coradas imunologicamente com anti-HA (painel superior) e anti-FLAG (painel inferior). faixas da esquerda, extratos não processados ​​(de entrada). (B) culas 293T humanas foram transfectadas como no painel A. As proteínas imunoprecipitadas com anticorpo anti-HA e imunomarcados com anti-FLAG (painel superior), e anti-HA (painel inferior). faixas da esquerda, extratos não processados ​​(de entrada). (C) A imunoprecipitação de extractos de células de SIRT1 LN-CAP usando anticorpo anti-IgG de coelho ou SIRT1 normal, tal como um controlo (IgG). 10% da proteína imunoprecipitada foi, em seguida, colocados a hibridar com anti-SIRT1 (painel superior), enquanto que os restantes 90% foram colocados a hibridar com anticorpos anti-β-catenina. (D) As células 293T foram transfectadas como indicado, e lisadas 48 h mais tarde. Níveis comparáveis ​​de β-catenina foram imunoprecipitados e transferido para os resíduos de lisina acetilada-(IP: HA IB: Ac-K; painel superior). O blot foi sondado para HA para demonstrar a níveis aproximadamente iguais de AH-β-catenina (IP: HA IB: HA; painel inferior). As células 293T (E-F) foram transfectadas, como indicado em conjunto com a luciferase TOP-FLASH e constructo de luciferase de Renilla PRL-TK. A nicotinamida (NAM) ou retroviral SIRT1 shRNA (RNAi) foi adicionada como indicado. Os dados estão normalizados relativamente à actividade de luciferase de Renilla. Os dados são médias ± D.P.. a partir de amostras realizadas em triplicado. (G) imunofluorescência indireta das células DLD-1 do cancro do cólon infectados com retrovírus vazio ou contendo vírus SIRT1 shRNA (RNAi) ou cDNA SIRT1 (superexpressão, O /E). Percentagem de células com elevado, médio ou baixo nível de coloração β-catenina nuclear para não tratado: 6,5, 80,6, 12,9; SIRT1 O /E: 0, 29,4, 70,5; SIRT1 RNAi: 60,0, 32,0, 0,8. As imagens foram tomadas em 100 vezes.

Para testar se SIRT1 inibe β-catenina, modulando o seu acetilação, nós transfectadas células 293T com S33Y-β-catenina, o p300 acetiltransferase, e quantidades crescentes de SIRT1 . Descobrimos que p300 acetilado β-catenina (Fig. 4D) e potenciou a sua actividade de transcrição, tal como foi previamente relatada [27] (Fig. 4E). A adição de SIRT1, no entanto, aboliu a forma acetilada de β-catenina e diminuiu significativamente a actividade β-catenina, quando foi co-transfectado com p300 (Fig. 4D, E). Por outro lado, o tratamento de células com a nicotinamida inibidor SIRT1 (NAM) [28] ou supressão de SIRT1 com um aumento da atividade repórter luciferase retroviral vector shRNA (Fig. 4F). Estes dados mostram que a SIRT1 promove a desacetilação de β-catenina, reduzindo assim a sua capacidade para actuar como um trans-activador.

A presença constitutiva de β-catenina no núcleo está associado com a sua função oncogénica e clinicamente com um mau prognóstico do paciente [29]. Para testar se a SIRT1 pode reprimir β-catenina, alterando a sua localização, a imunofluorescência foi realizada sobre as células transfectadas com construções de shRNA ou sobre-expressão de SIRT1. Supressão de SIRT1 nas células cancerígenas do cólon DLD1 aumentou a quantidade de β-catenina nuclear enquanto que a sobre-expressão de SIRT1 na mesma linha de células levou a uma redução drástica na piscina nuclear β-catenina (Fig. 4G).

para analisar a relevância clínica das nossas descobertas, analisamos SIRT1 e β-catenina expressão subcelular em um tissue microarray contendo 81 amostras de cancro do cólon humano. Descobrimos que um subconjunto de cancros do cólon expressam SIRT1 no núcleo (47/81 casos; 58%). Quando a expressão β-catenina foi marcado nestas mesmas cancros do cólon, uma correlação inversa significativa entre o nível de expressão SIRT1 e nuclear localização de β-catenina se tornou aparente (p≤0.003, odds ratio 0,24 com 95% de intervalo de confiança ,093-,63) ( A Fig. 5A, B). Colectivamente, estas observações sugerem que a modulação da β-catenina localização subcelular é um componente importante dos efeitos anti-tumorigénica de SIRT1 com relevância clínica potencial diagnóstico e terapêutico.

(A) Imagens representativas que ilustram SIRT1 e β-catenina subcelular expressão em tumores do cólon humanos. Para cada caso de câncer de cólon mostrado uma inserção de caixa de texto indica a proteína detectada (ampliação Imagem 200 ×). Correlação de SIRT1 e β-catenina expressão (B) em tumores do cólon humanos. O gráfico de barras mostra os dados de positividade cumulativo de um tissue microarray de 81 casos de câncer de cólon. expressão nuclear foi marcado como quer nenhuma expressão, expressão fraca, ou a expressão moderada /forte. Positividade no núcleo foi definido como expressão moderada /forte. Todas as lâminas foram interpretados por dois patologista placa certificada cego de quaisquer outros dados clínicos e laboratoriais.

Discussão

Aqui nós descrevemos um papel supressor de tumor fisiologicamente relevante para SIRT1 na formação de câncer de cólon e crescimento. Observou-se que a expressão SIRT1 no intestino normal ocorre especificamente nos enterócitos, as células precursoras que se submetem a transformação neoplásica em cancros do cólon e que SIRT1 é regulada positivamente em intestinos de roedores, em resposta a CR. Mostramos que a superexpressão de SIRT1 reduz a proliferação em linhas celulares de cancro do cólon e que superexpressão de SIRT1 nos enterócitos dos APC

min /+ animais imita os efeitos supressores tumorais de CR sobre este modelo câncer de cólon. Estas observações são consistentes com um

in vitro

estudo recente que implica SIRT1 como um supressor do crescimento sensível de nutrientes [30]. Enquanto SIRT1 é expressa no nosso ratinhos transgénicos em níveis mais elevados do que o observado nos intestinos de roedores tratados CR (7 vezes (SIRT1) versus duas vezes (RC)), este nível de sobre-expressão é, no entanto, consistentes com os resultados que SIRT1 pode ser fisiologicamente regulada 5-10 vezes

in vivo

[31]. Uma vez que os tumores efeitos supressores mediadas por SIRT1 eclipse aos observados por CR (redução de 70% (SIRT1) versus redução de 40% (CR)) [16] que pode não exclui a possibilidade de que SIRT1 também inibe o crescimento do tumor por um mecanismo de CR-independente. No entanto, nossos dados fornecem

in vivo

evidência de que a superexpressão de SIRT1 em níveis fisiologicamente relevantes, pode suprimir a formação de tumores e crescimento.

Neste estudo, nós também apresentam evidências de que SIRT1 interage com e suprime β-catenina, o factor de transcrição que impulsiona tumores no APC

min /+ modelo e uma variedade de tumores humanos. Nós descobrimos que a sobre-expressão SIRT1 inibe o crescimento de células de cancro do cólon dependente da actividade da β-catenina, suprime a localização de β-catenina para o núcleo, e atenua significativamente a sua capacidade para activar a transcrição. Estes efeitos não foram observados no mutante SIRT1-HY demonstrando que a actividade de desacetilase SIRT1 é necessário, e levantando a possibilidade de que SIRT1 alvo directamente β-catenina para desacetilação.

Estudos anteriores demonstraram que β-catenina é acetilado por p300 /CBP e a forma acetilada da proteína aumentou a atividade transcricional. Esta constatação sugere que a desacetilase putativa que neutralizar p300 /CBP seria útil como um alvo terapêutico do cancro [32]. Neste estudo, identificamos SIRT1 como um deacetilase que antagoniza p300 /CBP e deacetylates β-catenina, retardando assim a proliferação celular e crescimento tumoral

in vivo

.

Em conjunto, os nossos galpões de dados luz sobre a capacidade de SIRT1 para inibir a actividade β-catenina e fornece uma visão mecanicista para os efeitos anti-tumorigénica de SIRT1 em um modelo de cancro do cólon bem caracterizado. Dado que SIRT1 foi descoberto como um homólogo de um gene da longevidade, é interessante notar a crescente evidência de uma ligação entre Wnt /sinalização β-catenina e doenças associadas com a idade. β-catenina tem sido associada a outras doenças malignas associadas com a idade, tais como o melanoma, o mieloma múltiplo, e cancro da próstata. Há também a recente descoberta de que a regulação positiva de sinalização de Wnt /β-catenina acelera o envelhecimento nos ratos [23], [24]. Assim, vai valer a pena investigar se SIRT1 pode fornecer proteção contra outras doenças associadas à idade em virtude da sua capacidade para suprimir a sinalização Wnt /β-catenina.

Em resumo, usando bioquímica, genética do rato, e tumor clínica amostras verificou-se que SIRT1, um gene dieta-responsivo, é um regulador de β-catenina e tem uma função supressora de tumor. Conclui-se que genes da longevidade de mamíferos com funções anti-apoptóticos, surpreendentemente não conduz necessariamente a um aumento da tumorigênese. De fato, encontramos o oposto é provavelmente o caso para SIRT1. Estes estudos começam a responder a uma pergunta biológica importantes sobre a função de um gene da longevidade chave no desenvolvimento e crescimento do câncer e sugerem um potencial terapêutico não identificado anteriormente pelos ativadores SIRT1 em câncer.

Materiais e Métodos

roedores

-inducible Cre construção de expressão SIRT1 foi gerado um em que um

loxP

elemento de paragem da transcrição ladeado foi inserido entre um promotor CAGGS eo cDNA SIRT1. Esta construção foi alvejado no ratinho O colagénio locus de A1 utilizando integração genómica mediada por FLP recombinase, como descrito anteriormente (1). MES células que transportam uma cópia única do SIRT1

construto PARAR foram identificadas por resistência à higromicina marcador antibiótico e Southern blotting. iniciadores de PCR e construir mapas estão disponíveis mediante solicitação. Dois clones foram injectados em blastocistos e ambos os filhotes gerados, ~ 90% das quais indicadas a transmissão da linha germinal. ratinhos com tumor que foram analisados ​​tinham sido retrocruzado pelo menos quatro gerações em C57 /BL6. APC

min /+ e Vilina-Cre estirpes de ratinhos transgénicos que foram obtidos no fundo C57 /BL6 de Jackson Labs (Bar Harbor, ME). SirT1

PARAR animais foram retrocruzado duas gerações em camundongos C57BL /6 antes de cruzar a APC

min /+ para gerar SirT1

PARAR; APC

min /+ transgênicos duplos. Estes animais foram criados para ratinhos transgénicos Vilina-Cre para gerar uma coorte de SirT1

ΔSTOP; Vil-Cre; APC

min /+ animais. Os animais foram mantidos em Harvard Medical School e experimentos foram aprovados pelo Comitê de Cuidados Animais da Harvard Medical School.

Homem Fischer-344 (F344) ratos foram reproduzidos e criados no biotério no Centro de Pesquisa de Gerontologia (GRC, Baltimore, MD). A partir do desmame (2 semanas), os ratos foram alojados individualmente em gaiolas de plástico com padrão de madeira chip de cama beta. Os animais de controlo foram alimentados com um padrão NIH-31 dieta ad libitum (AL). Em 1 mês de idade a restrição calórica (CR) Os animais foram desde uma versão de vitaminas e minerais enriquecidos da mesma dieta a um nível de 40% a menos de alimentos (em peso) do que os ratos consumiram AL, durante a semana anterior. Filtrada e água acidificada estava disponível ad libitum para ambos os grupos. O viveiro foi mantida a uma temperatura de 25 ° C com humidade relativa a 50% numa 12/12 horas de ciclo de luz /escuridão (luzes acesas às 6:00 am) Todos os animais tinham 6 meses de idade e sacrificados entre 9:00 e 11:00 O intestino foi rapidamente removido e exaustivamente lavada com PBS gelado e colocados em azoto líquido, em seguida, armazenada a -80 ° C até serem processadas por Western blotting utilizando procedimentos padrão.

Patologia animal, histopatologia e imuno-histoquímica análise

Para a análise do tumor bruto, todo o intestino foi retirado imediatamente após o sacrifício, abertas longitudinalmente e lavada com solução salina fria tamponada com fosfato (PBS), enquanto preso um suporte sólido. Adenomas maior do que 0,5 milímetros de proximal (10 cm distais do piloro), distai (10 cm proximal ao cego), e meio (~ 50% do comprimento intestinal total) intestino delgado, bem como o cólon foram marcados. Os intestinos foram preparados utilizando o método do rolo suíço fazendo-os girar em torno de uma ponta de pipeta de vidro. Os tecidos foram fixados e embebidas em parafina usando o protocolo padrão histologia. o tamanho do tumor precisa foi marcado microscopicamente em hematoxilina /eosina dos intestinos do mouse usando um microscópio com um micrómetro ocular. A análise imunohistoquímica do tecido roedor foi realizada com anticorpo de coelho anti-SIRT1 (Upstate Biotechnology, cat # 07-131), de coelho anti-β catenina (Abcam # 2982), rato anti-β-catenina (Clone 14, BD laboratórios de transdução) e rato anti-Ki-67 (Dako).

imuno-histoquímica e Análises estatísticas

Tissue microarrays (TMAs) foram construídos como descrito anteriormente [33] usando o Automated Arrayer (Beecher Instruments, Sun Prairie , WI EUA). Para β-catenina e imunohistoquímica SIRT1, recuperação antigênica foi realizada; secções de tecido foram desparafinadas tratada por um forno de microondas durante 15 min em tampão de citrato (BioGenex, San Ramon, CA) em uma panela de pressão. As secções de tecido foram incubadas com 3% H

2O

2 (15 min) para bloquear a peroxidase endógena e depois incubadas com soro de cabra normal a 10% (Vector Laboratories, Burlingame, CA) em PBS (10 min), seguido pela 10 min de incubação em bloco de proteína livre de soro (Dako, Carpinteria, CA). Aplicou-se (diluição 1:100) durante 1 hora à temperatura ambiente; o anticorpo primário contra β-catenina (clone 14, BD Transduction Laboratories, Franklin Lakes, NJ) (diluição 1:400) ou SIRT1 (Epitomics # 1104). Foram aplicados anticorpo secundário (BioGenex) (20 min), e em seguida de estreptavidina conjugada com peroxidase (BioGenex) (20 min). As secções foram visualizadas por diaminobenzidina (DAB) (2 min) e contracoloração metil-verde. expressão nuclear foi registrada como nenhuma expressão, expressão fraca, ou a expressão moderada /forte. Positividade no núcleo foi definido como expressão moderada /forte. Todas as lâminas TMA β-manchado-catenina foram interpretados por um patologista (S.O.) cegos de quaisquer outros dados clínicos e laboratoriais. Todas as lâminas TMA manchado de SIRT1 foram interpretados por um patologista (R. F.) cegos de quaisquer outros dados clínicos e laboratoriais. Para a análise estatística, o teste do qui-quadrado foi realizado para dados categóricos usando o programa de software SAS (Versão 9.1, SAS Institute, Cary, NC). O p-valor foi em frente e verso, e significância estatística foi fixado em p ≤ 0,05.

Os plasmídeos

pcDNA3-FLAG-SIRT1, pBABE-Puro-hSir2 (SIRT1), pBABE-Puro -SIRT1

ΔHY, pcDNA-HA-S33Y-β-catenina e pBABE-puro-S33Y- β-catenina foram descritos antes. plasmídeos SIRT1 de ARNi foram construídos através da clonagem das sequências no plasmídeo pSUPER.retro (oligoEngine, Seattle, WA). Um plasmídeo TOPFLASH foi comprado de Upstate Biotechnology (Lake Placid, Nova Iorque), enquanto o segundo foi gerado por clonagem do conjunto TCF sites e TA-promotor de SUPER8xTOPFLASH (tipo dom de Randall Lua) na luciferase-PEST plasmídeo pGL4.15 ligação (Promega , Madison, WI).

transfecções celulares, Infecções e Imunocitoqu�ica

293T, LN-CAP, células DLD1, HCT116 e RKO foram mantidas em meio de cultura de tecidos recomendado (American Type Culture Collection ( ATCC), Manassas, VA) e cultivados numa incubadora humidificada contendo CO

2 (5% v /v) a 37 ° C. Para a sobre-expressão experiências, os plasmídeos foram transfectados pelo método de Fugene 6 (Roche). Para a geração de linha de células estável, as células foram seleccionadas em DLD1 higromicina durante duas semanas e as colónias individuais foram seleccionadas e expandidas. Para a produção de retrovírus, células 293T foram transfectadas com a sobre-expressão ou plasmídeos de ARNi em simultâneo com embalagens plasmídeos de gag-pol e VSV-G ou PCL-anfo. Os meios contendo o vírus da progénie libertados para as células 293T foi recolhido e utilizado para infectar as células durante 3-6 horas na presença de 8 ug /ml de polibreno (Sigma Aldrich, St. Louis, MO). O meio foi mudado e as células foram incubadas durante mais 24-48 horas de incubação. Eles foram selecionados com puromicina (Sigma Aldrich) durante 24-48 horas e depois tripsinizadas e semeadas para experimentos.

Para imunocitoquímica, as células foram semeadas em oito milímetros seis lâminas bem Teflon impressos (Electron Microscopy Sciences). Vinte e quatro horas após o plaqueamento, as células foram fixadas por incubação com paraformaldeído a 4% durante 30 minutos. As células fixadas foram, então, incubadas com anticorpos primários para SIRT1 (# 1104; Epitomics (diluição 1:100) e β-catenina activo (05-665; Chemicon) (diluição 1:100) durante 2 horas, seguido por incubação com anticorpos secundários (Alexa Fluor 488 cabra anti-IgG de coelho e IgG Alexa Fluor 568 anticorpo de cabra anti-ratinho;. Molecular Probes) (diluição 1:400) As células foram incubadas com 10 ug /ml de Hoechst, lavadas e montadas com uma lamela Pelo menos 20 células foram contadas. por experiência e captura de imagem foi realizada utilizando um microscópio Olympus BX50.

Extracção de proteínas e imunoprecipi tacão

extractos celulares analisados ​​directamente por transferência de Western foram preparados por lise das células em 1 × tampão de carga SDS seguido por fervura e extractos de análise de Western. Cell para imunoprecipi tacão foram preparados por ressuspensão sedimentos celulares salinas lavada tamponada com fosfato em 1 ml de Nonidet tampão de extracção (Tris-HCl 50 [pH 8,0], NaCl mM, P-40 (NP-40) 150, e 1% de Nonidet P-40) suplementado com os comprimidos de cocktail inibidor de protease isento de EDTA (Roche) com 10 mM de nicotinamida (NAA) e 5? M-Tricostatina A (TSA). Após incubação em gelo durante 30 minutos, o material não extractável foi removido por centrifugação a 17.000

g

durante 10 min a 4 ° C, e os sobrenadantes foram compensados ​​empregue para imunoprecipitação. Os lisados ​​foram imunoprecipitados (2 h), lavou-se 4 vezes com tampão de NP-40 e foram processadas através de Western blotting.

Ensaios de Proliferação

linhas celulares DLD1, HCT116 e RKO infectadas com a construção apropriada eram semeadas em placas de 24 poços a uma densidade de 10.000 células.