Abstract

Recentemente, relatou que dois dímeros derivados de artemisinina (dímero álcool primário 606 e dímero sulfona 4 -carbamato 832-4) são significativamente mais potente na inibição da replicação do citomegalovírus humano (CMV) de monómeros derivados de artemisinina. No nosso prosseguimento da avaliação das actividades de artemisinina em inibição de CMV, foram utilizados doze dímeros derivados de artemisinina e cinco monómeros derivados de artemisinina. Dímeros como um grupo foram encontrados como sendo inibidores potentes da replicação do CMV. Comparação da inibição de CMV e o parâmetro de declive de dímeros e monómeros sugerem que os dímeros são distintos nas suas actividades anti-CMV. Um dímero desoxi (574), a que falta o endoperóxido ponte, não teve nenhum efeito na replicação do CMV, sugerindo um papel para a ponte endoperóxido na inibição de CMV. As diferenças na actividade anti-CMV foram observadas entre os três análogos estruturais do dimero de sulfona 4-carbamato 832-4 indicando que a colocação e a oxidação exacto estado do átomo de enxofre pode contribuir para a sua actividade anti-CMV. De todos os dímeros testados, derivados de artemisinina fosfato de difenil dímero 838 provou ser o inibidor mais potente da replicação do CMV, com um índice de selectividade de cerca de 1500, em comparação com a sulfona dímero anteriormente relatado 4-carbamato de 832-4 com um índice de selectividade de cerca de 900. difenil fosfato dímero 838 era altamente activa contra uma estirpe de CMV resistentes ao ganciclovir e foi também o dímero mais activa na inibição do crescimento de células cancerosas. Assim, o fosfato de difenil dímero 838 pode representar uma vantagem para o desenvolvimento de um composto anti-CMV altamente potente e segura

Citation:. Ele R, Mott BT, Rosenthal AS, Genna DT, Posner GH, Arav-Boger R (2011) Um artemisinina-Derived Dimer Tem muito potente anti-citomegalovírus (CMV) e atividades anti-câncer. PLoS ONE 6 (8): e24334. doi: 10.1371 /journal.pone.0024334

editor: Kim D. Janda, The Scripps Research Institute, Estados Unidos da América

Recebidas: 1 de junho de 2011; Aceito: 06 de agosto de 2011; Publicado: August 31, 2011 |

Direitos de autor: © 2011 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Apoiado por NIH AI 34885 (GHP), NIH KO8 AI074907, NIH 1R01AI093701 e March of Dimes 6 FY11 268 (RAB). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a infecção com CMV, um membro da família do vírus do herpes, é comum nos seres humanos. A soroprevalência aumentar com a idade, atingindo 90% em indivíduos com idade superior a 80 anos [1]. O vírus estabelece infecção persistente ao longo da vida, que geralmente permanece assintomática. Em hospedeiros imunocomprometidos, tais como receptores de transplantes e pacientes com AIDS, a infecção por CMV está associada com morbidade e mortalidade significativas [2], [3]. CMV é também a mais comum infecção congênita-adquirida causando retardo mental e surdez em crianças congenitamente infectadas [4]. Recentemente, a detecção de CMV em indivíduos imunocompetentes tem sido associada com os resultados de vários síndromes incluindo septicemia, complicações pulmonares em doentes nos cuidados intensivos-unidades, e em um tumor cerebral, glioblastoma multiforme [5] – [7]. Embora o papel direto do CMV nestes síndromes não é clara, a replicação do vírus podem contribuir para a sua história natural, e o papel da terapia anti-CMV nestas condições está sendo investigado.

O disponível sistêmica anti-CMV drogas ato alvejando a polimerase de ADN viral. Estes compostos efetivamente suprimir a replicação do CMV, mas a sua utilização está associada a toxicidade consideráveis ​​para a medula óssea (Ganciclovir-GCV) e rins (foscarnet e cidofovir) [8], [9] e o aparecimento de mutantes resistentes aos medicamentos durante cursos prolongados de terapia [9], [10]. Assim, os novos compostos com baixa toxicidade e, idealmente, com um mecanismo distinto da inibição CMV são necessários para a terapia CMV.

O artesunato monômero derivados de artemisinina foi originalmente relatado para inibir a replicação do CMV

in vitro Comprar e

in vivo

[11], [12]. Recentemente, foi relatado em dois dímeros derivados de artemisinina com actividade significativamente mais potente contra a replicação do CMV,

In vitro

em comparação com monómeros derivados de artemisinina [13]. monômeros artemisinina Atualmente as drogas de escolha para o tratamento da malária [14]. Além disso, ambos os monómeros e dímeros de artemisinina foram mostrados como possuindo actividades anti-cancro [15] – [17]. A actividade anti-CMV potente de dois dímeros derivados de artemisinina [13] levou-nos a avaliar uma série de dímeros derivados de artemisinina recém-sintetizadas. Nós relatório sobre as actividades anti-CMV e anti-cancro dos compostos mais potentes nesta investigação.

Resultados

Uma comparação da atividade anti-CMV de 17 derivados de artemisinina

que anteriormente relatada a actividade anti-CMV de quatro monómeros de artemisinina (artemisinina, artesunato, artemeter e artefanlide) e dois dímeros derivados de artemisinina (dímero de álcool primário 606 e dímero de sulfona 4-carbamato 832-4) [13]. Temos agora testado um novo monômero derivados de artemisinina e 10 novos dímeros adicionais derivados de artemisinina e comparou suas atividades anti-CMV aos dos compostos anteriormente testados. Os nomes abreviados dos 17 compostos e os seus pesos moleculares são apresentados na Tabela 1. Neste relatório, cada composto é referido pelo seu peso molecular. Por exemplo, o composto 606 refere-se ao álcool primário dímero, e 832-4 refere-se a dímeros de sulfona 4-carbamato de metilo (quadro 1). Sulfone carbamato 551 é a versão monomérica de dímero sulfona carbamato 832-4. A estrutura química do dímero de sulfona 4-carbamato 832-4 impede de ser catabolisados ​​em monómero de sulfona 4-carbamato de 551. Composto 574, que é a versão desoxi de 606, foi escolhida para testes porque as actividades anti-malária e anti-cancro de artemisinina são pelo menos parcialmente endoper�ido ponte-dependente [18], [19].

Os dois dímeros derivados de artemisinina previamente testados apresentaram atividade anti-CMV potente em concentrações de 1 mM ou inferior, enquanto os monómeros derivados de artemisinina alcançado um grau semelhante de inibição de CMV apenas em concentrações mais elevadas do que 10 ^ M [13]. Com base nestes dados, todos os novos compostos foram inicialmente testados para actividade anti-CMV. Os compostos mais activos foram, em seguida, testado em detalhe para as suas actividades anti-CMV. Todos os dímeros foram inicialmente avaliados a concentrações de 1 uM, 0,3 uM e 0,1 uM. O dímero desoxi 574 e sulfona monómero de carbamato de 551 foram rastreados em 1 uM e 10 uM. A 1 uM, os dímeros exibido potente inibição da expressão do gene tardio PP28 (que estão altamente correlacionados com a redução de placas) [20] medida pela actividade de luciferase, mas o dímero desoxi 574 e sulfona monómero de carbamato 551 não (Fig. 1A). Vários dímeros foram também eficazes a 0,3 uM, mas apenas dois dímeros, sulfona 4-carbamato 832-4 e fosfato de difenil 838, eram altamente inibidora a 0,1 uM. Três análogos estruturais de sulfona 832-4 foram sintetizados (832-3, 800-3 e 800-4) variando o estado de oxidação e a posição do átomo de enxofre no anel aromático (Fig. 1B). Embora a meta-sulfureto (800-3), meta-sulfona (832-3), e para-sulfureto (800-4) eram activos contra a replicação do CMV em 0,3 mM, ao contrário de para-sulfona 832-4 eles não estavam ativos na 0,1 uM (Fig. 1A). Portanto, a colocação e a oxidação exacto estado do átomo de enxofre contribui para a sua actividade anti-CMV

A:. A actividade de luciferase relativa de dímeros derivados de artemsinin (esquerda), dímero desoxi 574, e monómeros de artemisinina (direita) . Infectados e tratados HFFS foram recolhidos 72 hpi e lavadas uma vez com PBS. Os lisados ​​foram ensaiados quanto à actividade da luciferase utilizando o Kit de Ensaio de Luciferase (Promega, Madison, WI). B. estrutura química dos análogos de dímero de sulfona 4-carbamato 832-4. Descrito são dois análogos de sulfureto de carbamato (800-3 e 800-4) e uma sulfona análogo 3-carbamato de (832-3) de sulfona 4-carbamato 832-4. C: A citotoxicidade de dez artemisinina-dímeros e cinco de artemisinina de monômeros em HFF. HFFS tratadas com dimeros /monómeros, nas concentrações indicadas foram colhidas às 72 e lavadas uma vez com PBS. Os lisados ​​foram ensaiados quanto à viabilidade celular utilizando CellTiter-Glo Luminescent Kit de Ensaio de viabilidade celular em GloMax® multi-+ Detection System (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.

próxima rastreados para a toxicidade celular dos dímeros e monómeros utilizando o ensaio de viabilidade celular CellTiter-Glo Luminescent em concentrações de 10 uM, 50 uM e 100 uM. Para a maioria dos dímeros (excepto 644 e 760), 50% de citotoxicidade celular (CC

50) variou entre 50 e 100 uM (Fig. 1C). Monómeros geral apresentado padrão de citotoxicidade semelhante, mas eram significativamente mais tóxica do que os dímeros em 100 ^ M (p = 0,03 por teste t de duas caudas). Dímeros 832-4 e 838 tiveram o melhor índice de selectividade (SI), que é a relação de CC

50 a CE

50, e, por conseguinte, foram seleccionados para análise mais pormenorizada de actividade anti-CMV.

relação estrutura-actividade e toxicidade celular de dímeros 832-4 e 838 e seus dímeros-mãe 760 e 606

Uma comparação detalhada da actividade anti-CMV e toxicidade em células HFF primárias não-câncer foi próxima realizados com os dimeros mais potentes, 832-4 e 838 (Fig. 2A). Um aumento dependente da dose na actividade anti-CMV foi observado a partir de 0,01 uM a 1 uM, tanto para dímeros 832-4 e 838 (Fig. 2B, Quadro 2). toxicidades celulares, medido a 1 uM a 100 uM (Tabela 2), não foram observados a concentrações de inibição de CMV completa. A CE

50, CC

50 e SI são mostradas na Fig. 2B e Tabela 2. D�eros 832-4 e 838 tinham um alto SI, mas 838 foi o melhor composto. Os álcoois-mãe a partir da qual foram sintetizados 832-4 e 838, 760 e 606, respectivamente, foram menos eficazes do que os seus derivados na inibição de CMV. Para o par de 606-838 a diferença de SI foi de 5 vezes, e para a 760-832-4 par, de 30 vezes (Fig. 2A, 2B). Embora a sulfona dímero de 4-carbamato 832-4 e a sulfona monómero 4-carbamato 551 tem sulfona idêntica grupos funcionais carbamato-4 (Fig. 2A), dímero 832-4 foi pelo menos 150 vezes mais eficazes na inibição de CMV do que o monómero 551.

a: estruturas químicas dos dois dímeros derivados de artemisinina mais potentes 838 e 832-4 e seus álcoois pai correspondente 606 e 760. monómero 551 está representada do lado esquerdo do dímero 832-4. A unidade de dimetil carbamato de sulfona benzílico é a mesma no monómero 551 como no dímero 832-4. Por conseguinte, a actividade melhorada anti-CMV do dímero 832-4 sobre o monómero 551 não é devido a qualquer diferença na porção sulfona carbamato da molécula. B: actividade anti-CMV detalhada de dímeros 832-4 e 838, e o seu respectivo pai HFF compostos 760 e 606. CMV-infectadas foram tratadas com dimeros 832-4 e 838, nas concentrações indicadas. 72 hpi a actividade da luciferase foi determinada nos lisados ​​de células infectadas. Os valores da luciferase representam a média e desvio padrão dos dados derivados a partir de pelo menos quatro experiências independentes realizadas em triplicado. A caixa de ferramentas de ajuste de curva, software Matlab (v7.5), Mathworks (Natick, MA) foi utilizado para determinar CE

50 valores usando uma regressão logística de quatro parâmetros.

Inibição de uma estirpe de CMV GCV resistente por dímeros 832-4 e 838

Foram avaliadas a inibição de uma estirpe GCV-resistente (CE

50 de GCV = 7,6 mM) por dímeros 832-4 e 838 usando um ensaio de redução de placas. Dímeros 832-4 e 838 foram aplicados a células infectadas a uma concentração de 0,1 uM; GCV foi aplicado a 5 uM e 30 uM. Vinte e um dias após a infecção, as células foram coradas com violeta de cristal e as placas foram contadas em cada condição (Fig. 3). 832-4 dímeros e a formação de placa 838 inibiu completamente a 0,1 uM, enquanto que esta estirpe mostrou uma resistência óbvia para GCV a 5 uM.

Um ensaio de redução de placas foi utilizado para quantificar a inibição do CMV GCV-resistente. CMV-infectadas foram tratadas com HFF 832-4, 838 e GCV nas concentrações indicadas. As placas foram contados 21 dias após a infecção.

inclinações das curvas de resposta à dose anti-CMV dos compostos anti-CMV testados

A descrição clássica das relações dose-resposta é a mediana modelo de efeito, com base na acção de massa, indicando que [21]: Nesta função, é a proporção da fracção de vírus inibida, ou a percentagem de inibição,

D

é a concentração do fármaco,

CE

50

é a concentração de droga que atinge 50% do efeito inibitório máximo e

m

é um parâmetro de declive da curva matematicamente. O efeito do parâmetro de declive na actividade anti-HIV foi avaliada recentemente, e provou ser uma característica da classe de drogas e uma dimensão parâmetro crucial na análise da actividade antiviral [21].

aplicada a este modelo os derivados e calculado o parâmetro de declive dos dímeros mais potentes (832-4 e 838), com GCV, e artesunato monómero derivado de artemisinina (Tabela 2). Em comparação com GCV e artesunato, que teve um anti-CMV

m valor

de aproximadamente 1, o

valores m

de 832-4, 838, 760 e 606 foram cerca de 4, uma indicação de que estes compostos são uma classe altamente potente de compostos anti-CMV.

a inibição do crescimento de células cancerosas por dímeros 832-4 e 838

monómeros derivados de artemisinina e vários dímeros têm sido relatados para inibir a crescimento de linhagens de células de câncer [16], [17]. Quatro dímeros (832-4, 838, 760 e 606), dois monómeros (artesunato e artefanilide) e GCV foram aplicados a três linhas de células de cancro: HeLa (adenocarcinoma do colo do útero), HCT116 (carcinoma colo-rectal) e 1205Lu (melanoma) em concentrações que variam de 0,01 uM a 1 uM. ensaio de MTT foi realizada 72 horas após o tratamento e CC

50 de cada composto em cada linhagem de células do cancro foi calculada (tabela 3). O CC

50 de cada composto nas células cancerosas foi comparado com o CC

50 em células HFF primárias não-cancerosas. Todos os dímeros foram significativamente mais activos do que os monómeros na inibição do crescimento de linhas celulares de cancro. Por exemplo, o dímero de 838 era de pelo menos 200 vezes mais potentes na inibição do crescimento de células HCT116 e 1205Lu e 37 vezes mais potente na inibição do crescimento de células HeLa, em comparação com o artesunato, o monómero mais potente neste ensaio. Foi observada uma correlação qualitativa entre a actividade anti-CMV ea atividade anti-câncer entre os quatro dímeros (838, 832-4, 606 e 760); dímero 838, o mais potente de todos os dímeros testados contra a replicação do CMV, também teve o efeito mais forte na inibição do crescimento das células cancerosas.

Discussão

Nós relatamos aqui no anti-CMV actividade de dez novos derivados de artemisinina dímeros, um dímero de desoxi e um novo monómero de artemisinina, e a identificação do dímero anti-CMV mais potente. A actividade anti-CMV aumentada de dímeros em comparação com monómeros não era um resultado do aumento da cytotoxcity mas sim uma actividade anti-CMV específico. Os dois dímeros mais altamente potentes foram eficazes na inibição da estirpe Towne adaptada em laboratório, bem como uma estirpe resistente GCV. Eles também foram exibidas para ter o efeito inibitório forte no crescimento de linhas celulares de cancro.

Todos os dímeros exibiam uma inibição potente de CMV em 1 uM. No entanto, apenas dois compostos (832-4 e 838) pode ser seleccionado como agentes anti-CMV altamente potentes com base na sua inibição de CMV alta em 0.1 uM e a sua baixa citotoxicidade. A esta concentração, os outros dímeros não apresentaram qualquer inibição ou no máximo 40% de inibição da expressão de luciferase, enquanto com GCV não teve inibição de todo.

Os derivados da artemisinina foram inicialmente desenvolvidos como drogas anti-malária, mas mais tarde foram igualmente encontrado para ter actividades farmacológicas adicionais, tais como inibição do crescimento de células cancerosas e a inibição da replicação do CMV [12], [13], [22] – [25]. Seja ou não estas novas actividades estão relacionados uns com os outros e indicam um mecanismo comum, a ponte endoperóxido parece ser crítica em todas as actividades farmacológicas dos derivados de artemisinina.

Como uma observação generalizada, os dímeros foram significativamente mais potente do que o os monómeros na inibição de CMV. Usando o CE

50 valores

, 838 dímero foi 165 vezes mais potente do que o artesunato na actividade anti-CMV e a sua SI foi de 134 vezes maior em comparação com o artesunato. Em apoio a esta conclusão, o modelo de parâmetro de declive de resposta à dose, que foi recentemente utilizada para caracterizar as actividades de compostos anti-HIV [21] revelou que dímeros tinha um declive muito maior do que os monómeros. Geralmente, uma inclinação maior correlaciona-se com uma actividade anti-viral mais vigorosa. Isto poderia resultar tanto de afinidade muito elevada de se ligarem a um único ligando ou de efeito cooperativo de múltiplas ligandos com uma afinidade semelhante da droga.

Vários agentes anti-cancro (tais como inibidores de quinase) foram mostrados para inibir a replicação do CMV , mas, em geral, as concentrações necessárias para alcançar inibição de CMV eram tóxicos para as células e proibida a sua utilização como candidatos anti-virais [26]. Curiosamente, sorafenib, um inibidor de multi-quinase, aparece para inibir a replicação do CMV, sem toxicidade celular associada [27]. Os dímeros aqui relatados impedido o crescimento de linhas celulares de cancro e eram inibidores potentes da replicação do CMV sem toxicidades celulares aparentes. Portanto, eles podem proporcionar uma nova classe de agentes anti-CMV, com um mecanismo de acção diferente. Semelhante à actividade anti-CMV, dímeros foram também mais eficazes do que os monómeros na inibição de células cancerosas. Estudos futuros poderão revelar se as duas actividades anti-CMV e anti-câncer de dímeros resultar de um mecanismo compartilhado de ação. Nós e outros autores demonstraram que a inibição da replicação do CMV, com derivados de artemisinina aparece cedo durante o ciclo de replicação e envolve um mecanismo que é diferente do dos inibidores de polimerases de ADN [28], [29]. As actividades anti-câncer de artemisinina foram postulados para envolver detenção do ciclo celular, apoptose e /ou angiogênese [30], processos que também são afetados por genes CMV específicos, genes precoces principalmente imediatos. . Estudos futuros irá abordar o mecanismo de inibição CMV por dímeros derivados de artemisinina e sua sobreposição potencial com eventos de sinalização oncogênicas

Em conclusão, mostramos que: 1). Os dímeros são altamente activos contra a replicação do CMV, e fosfato dímero difenil 838 é o mais potente na inibição de CMV. 2). O parâmetro de declive de resposta à dose de dímeros é significativamente maior do que a dos monómeros de artemisinina e GCV, uma possível indicação de que os dímeros são uma classe distinta de compostos anti-CMV. 3) Os dímeros são inibidores mais potentes do que os monómeros em ambas as linhas de células de cancro e em CMV.

Materiais e Métodos

Compostos

O ganciclovir (GCV) foi obtido a partir de Roche, EUA . Todos os derivados de artemisinina utilizados neste estudo foram sintetizados na Universidade Johns Hopkins [17], [31] – [33]. Recentemente sintetizadas sulfeto dímero 3-carbamato de (800-3) e sulfeto de dímero de 4-carbamato de (800-4), bem como sulfona dímero 3-carbamato de (832-3) foram sintetizados como descrito em Materiais S1. monómeros e dímeros derivados de artemisinina foram dissolvidos em sulfóxido de dimetilo (DMSO) e as reservas de 10 mM foram armazenados em -80 ° C. Os compostos sintéticos eram pelo menos 98% puro com base em espectroscopia de RMN de protões. O DMSO em si foi testada em células infectadas por CMV, e não têm qualquer actividade anti-viral [13].

Vírus

A estirpe Towne PP28-luciferase foi construído como descrito anteriormente [ ,,,0],20]. Resumidamente, o vírus recombinante, que expressa luciferase sob o controlo de UL99 (PP28) promotor tardio foi gerado por inserção do gene repórter entre o US9 e quadros de leitura aberta US10 (ORFs) no genoma de Towne. A expressão de -luciferase PP28 é fortemente activado 48-72 horas após a infecção (IHP) e é quase completamente inibida na presença de inibidores de polimerase de ADN, tais como GCV e foscarnet [20]. Recentemente, relatou que o sistema repórter de luciferase-PP28 é sensível, reprodutível e altamente correlacionada com a redução da placa [20]. A estirpe resistente à ganciclovir (GCV) foi obtido a partir de um paciente com a doença por CMV. Ele tem uma mutação UL97 (H520Q) e uma CE

50 de 7,6 M para GCV. Este isolado clínico foi fornecida pelo laboratório de virologia clínica sem identificadores que podem ligar a um assunto específico. A Johns Hopkins Escritório de Assunto Human Research Institutional Review Board determinou que esta pesquisa beneficiar de uma isenção.

Cultura celular, infecção por vírus e ensaios anti-virais

fibroblastos de prepúcio humano (HFF) passagem 12 -16 (ATCC, CRL-2088 ™) foram cultivadas em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) contendo soro fetal bovino a 10% (Gibco, Carlsbad, CA) numa co 5%

2 incubadora a 37 ° C e usado para infecções com PP28-luciferase Towne CMV ou a estirpe GCV-resistente. Um dia antes da infecção com o PP28-luciferase, 4 × 10

4 células HFF foram semeadas em cada poço de placas de 24 poços de cultura de tecidos. A infecção foi levada a cabo a multiplicidade de infecção de 1 PFU /célula (MOI = 1). Após 90 minutos de adsorção, meios contendo vírus foi removido e substituído por DMEM com soro bovino fetal a 4% (Gibco, Carlsbad, CA) contendo compostos anti-virais. A concentração de cada composto foi calculada e ajustada em volume de tal forma que se manteve constante durante todo o experimento.

Infected e células HFF tratadas foram recolhidos 72 hpi e lavadas uma vez com PBS. Os lisados ​​foram ensaiados quanto a luciferase e a viabilidade celular utilizando um Luciferase Assay Kit (Promega, Madison, WI) e CellTiter-Glo Luminescent Kit de Ensaio de viabilidade celular, respectivamente, em GloMax®-multi Detection System + (Promega) de acordo com as instruções do fabricante.

fibroblastos pulmonares humanos (HEL) passagem 8-12 (ATCC, CCL-137 ™) foram crescidas em DMEM contendo soro bovino fetal a 10%. Um dia antes da infecção, 3 × 10

5 as células foram semeadas em cada poço de placas de cultura de tecidos de 12 poços. CMV-resistente com GCV foi diluída em DMEM para uma concentração desejada, que deu cerca de 100 placas por cavidade e adicionada a cada poço em duplicado. As placas foram incubadas durante 90 minutos com agitação cada 10 minutos; depois as drogas foram adicionadas e uma sobreposição de metilcelulose aplicada a cada poço. Após incubação durante 21 dias, as células foram coradas com violeta de cristal e placas foram contadas sob o microscópio na ampliação de 40 ×.

As células anti-câncer Ensaio

HeLa (Human Cervical Adenocarcinoma), HCT116 (Human carcinoma colorectal) e células 1205Lu (melanoma humano) (todas da ATCC) foram mantidas em DMEM contendo soro bovino fetal a 10%. 12-16 horas antes do tratamento com drogas, 3 × 10

3 a 5 × 10

3 células foram semeadas em cada poço de placas de 96 poços de cultura de tecidos. As drogas foram diluídas em DMEM contendo 10% de soro fetal bovino e aplicado às células. 72 horas após o tratamento com droga, 20 ul de solução de MTT (5 mg /ml em PBS) foi adicionado a cada poço, seguido por agitação das placas a 150 rpm durante 5 minutos e um período de incubação de 4 horas (37 ° C, 5% de CO

2). O meio foi removido, as placas secas e cada poço foi ressuspenso em 100 ul de formazano de MTT /DMSO. A absorvância de cada poço foi gravado em 560 nm em GloMax® Multi-Sistema de Detecção + (Promega).

Informações de Apoio

Materiais S1.

1) Síntese de Dímero Sulfeto 3-carbamato 800-3. 2) Síntese de Dímero Sulfona 3-carbamato 832-3. 3) Síntese do dímero de sulfeto de 4-carbamato 800-4. 4) Síntese de desoxi-artemisinina álcool 574. 5) Síntese de monômero Sulfone benz�ica dimetilo 551.

doi: 10.1371 /journal.pone.0024334.s001

(DOC)

Agradecimentos

Agradecemos a Michael Forman, do Departamento de Patologia da Universidade Johns Hopkins Medical Institutions, Baltimore, Maryland, para fornecer o CMV GCV-resistente.