Abstract

Fundo

câncer de próstata hormônio-refratário permanece prejudicada pela progressão inevitável da resistência para tratamento de primeira linha com docetaxel. Estudos recentes sugerem que alterações fenotípicas associados ao câncer podem ser transferidas de célula-a-célula

via

microvesículas /exossomos. Aqui nós teve como objetivo investigar alterações fenotípicas associados com docetaxel-resistência, a fim de ajudar a determinar a complexidade do problema e avaliar a relevância de exossomos secretados no câncer de próstata.

Metodologia /Principais Achados

docetaxel variantes resistentes do DU145 e 22Rv1 foram estabelecidas e caracterizadas em termos de resistência cruzada, a morfologia, a proliferação, motilidade, invasão,

anoikis

, a formação de colónias, os exossomas a secreção e a sua relevância funcional. A análise preliminar de exossomas a partir de amostras de soro relevantes também foi realizada. Adquiriu-docetaxel resistência conferida resistência cruzada a doxorrubicina e com alterações da motilidade, invasão, proliferação e crescimento independente de ancoragem induzida. Exossomos expulsos do DU145 e 22Rv1 variantes docetaxel-resistentes (DU145RD e 22Rv1RD) conferido docetaxel resistência às células DU145, 22Rv1 e LNCap, que podem ser em parte devido à exosomal MDR-1 transferência /P-gp. Exossomos de soros de pacientes com câncer de próstata induzida aumento da proliferação celular e invasão, em comparação com exossomos de controles pareados por idade. Além disso, os exossomas a partir de soros de pacientes submetidos a um curso de tratamento com docetaxel em comparação com os exossomas combinadas dos mesmos pacientes antes do início do tratamento com docetaxel, quando aplicado a ambas as células DU145 e 22Rv1, mostrou uma correlação entre a resposta celular ao docetaxel e resposta dos pacientes ao tratamento com docetaxel.

Conclusões /Significado

Nossos estudos indicam a natureza complexa e multifacetada do docetaxel resistência no cancro da próstata. Além disso, a

In vitro

observações e estudos clínicos preliminares indicam que os exossomas podem desempenhar um papel importante no cancro da próstata, em comunicação célula-célula, e, assim, podem oferecer o potencial como veículos contendo biomarcadores preditivos e novos alvos terapêuticos.

Citation: Corcoran C, Rani S, O’Brien K, O’Neill A, Prencipe M, Sheikh R, et al. (2012) Docetaxel-Resistência em Câncer de próstata: Avaliando associadas fenotípicas Alterações e potencial de transferência Resistência via exossomas. PLoS ONE 7 (12): e50999. doi: 10.1371 /journal.pone.0050999

Edição: Natasha Kyprianou, da Universidade de Kentucky College of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 28 Março, 2012; Aceito: 30 de outubro de 2012; Publicação: 10 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Corcoran et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esta pesquisa foi apoiado pelo financiamento da Strategic Research Cluster, Therapeutics Molecular para o cancro da Irlanda Science Foundation Ireland (08 /SRC /B1410) para JC, WW, LOD; financiamento, a LOD, para apoiar KOB como uma Bolsa Marie Keating Foundation no Trinity College de Dublin; e infra-estrutura e suporte instalação do núcleo através do Programa de HEA da Irlanda de Investigação em Terceiro Nível Institutes (PRTLI) Ciclo 5 a LOD entre outras TCD IPs. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

enquanto docetaxel oferece melhoria na sobrevida global para pacientes com câncer de próstata hormônio-refratário (HRPC), como é evidente a partir de dois estudos de Fase III (Imposto 327 e SWOG 9916) e subsequente gestão clínica, infelizmente, a reincidência é quase inevitável. Razões para o fracasso de docetaxel para aumentar a sobrevivência além -2,5 meses ainda não foram completamente elucidados. A resistência aos medicamentos é frequentemente atribuída a-expressão através de proteínas de transporte, incluindo a P-glicoproteína (MDR-1 /P-gp), associada com o efluxo de muitos agentes anti-cancro (e outras) [1] – [3]. Além disso, quimio-resistência também foi mostrado para contribuir para alterações no fenótipo invasivo e motilidade das células [4] – [7]. Outras características fenotípicas que podem ser associados com este problema no cancro da próstata ainda não foram definidos.

adicionada a esta, estudos recentes sugerem que as alterações fenotípicas associadas com o cancro pode ser transferido a partir de célula-a-célula

via

microvesículas /exossomos. Os exossomas foram descritos como vesículas ligadas à membrana nanométricas de origem endocítica [8]. Dependendo da sua célula de origem, estas pequenas vesículas têm sido implicados com várias funções diferentes, algumas das quais incluem a sua associação com os estados de doença, tais como o cancro. comunicação intercelular é um tal papel, através da sua capacidade para promover a transdução de sinal [9] e a transferência de receptores de membrana, proteínas, ARNm, e miARNs [10], [11] a partir de uma célula para outra. A relevância de exossomas em termos do seu potencial para ajudar na progressão do cancro da próstata e o desenvolvimento de quimio-resistência tem ainda a ser determinado.

Devido à natureza complexa da progressão do cancro da próstata, linhas de células de próstata de docetaxel resistente foram desenvolvidos e caracterizados para representar tumores primários e metastáticos, bem como andrógeno-sensibilidade e andrógeno-resistência no cancro da próstata. Em breve, adquirida na resistência ao docetaxel, em duas linhas celulares de cancro da próstata, conferido a resistência cruzada à antraciclina, a doxorrubicina e a alterações na motilidade induzida, migração, invasão, proliferação e crescimento independente de ancoragem. Aplicação de exossomas, isolado a partir de DU145RD docetaxel-resistentes e células cancerosas 22Rv1RD, para DU145 sensível ao docetaxel, células-mãe 22Rv1 e LNCap conferido um aumento significativo na resistência ao docetaxel para cada uma destas células receptoras. Isto pode, pelo menos em parte, ser devido à transferência de MDR-1 /P-gp por exossomas. Os exossomas a partir de amostras de soro do cancro da próstata induziu um aumento significativo na proliferação celular e a invasão comparado com os exossomas a partir de controlos saudáveis ​​de idade. Além disso, os exossomas a partir de soros de pacientes submetidos a um curso de tratamento com docetaxel em comparação com os exossomas combinadas dos mesmos pacientes antes do início do tratamento com docetaxel, quando aplicado a ambas as células DU145 e 22Rv1, mostrou uma correlação entre a resposta celular ao docetaxel e a resposta dos pacientes ao docetaxel tratamento. Estes estudos translacionais preliminares apoiar ainda mais a relevância clínica da exossomos no câncer de próstata.

Resultados

determinar a extensão da resistência à Docetaxel

Conforme detalhado na Tabela 1, DU145RD e 22Rv1RD as células foram encontrados em cerca de 108-, e 71 vezes resistentes a docetaxel em comparação com suas respectivas linhas celulares idade dos pais.

células docetaxel resistente demonstrar alguma resistência cruzada a outros agentes anti-câncer

Ambos linha celular resistente variantes exibiram resistência cruzada (4-8 vezes) à doxorrubicina (Tabela 1), enquanto não foram observadas diferenças significativas na sensibilidade a 5-fluorouracilo ou carboplatina para DU145RD ou 22Rv1RD em comparação com o seu respectivo as células-mãe.

Variantes docetaxel resistentes não diferem em morfologia, mas têm diferentes Proliferação, motilidade e invasão fenótipos Versus Parent linhas celulares

Observação da morfologia celular não revelou quaisquer diferenças substanciais na morfologia das células após o docetaxel adquirido resistência (Figura 1), embora as células resistentes proliferam mais lentamente do que as suas populações parental sensível a docetaxel (Tabela 2). Os ensaios curativos de feridas foram utilizados para avaliar os efeitos do docetaxel-resistência na motilidade celular (Figura 2). Após 24 horas, as células DU145RD demonstraram significativamente (p 0,05) aumento de encerramento de feridas em comparação com DU145. Docetaxel resistente 22Rv1RD mostrou marginal, mas significativa (p 0,05), o fechamento da ferida diminuiu em comparação com 22Rv1. Considerando-se a migração celular (Figura 3A) e invasão (Figura 3B), DU145RD foi encontrada para ter motilidade aumentada (p 0,01) e capacidades invasivas (p 0,05) quando comparados com DU145. 22Rv1RD em comparação com células 22Rv1, no entanto, mostrou uma tendência diminuída em migração (p 0,01) e invasão (p 0,05).

de imagens de pai sensível e variantes docetaxel-resistentes de linhas de células DU145 e 22Rv1. (Olympus CKX4, ampliação de 20x).

ensaios de cicatrização de feridas foram realizados para avaliar a motilidade celular. As monocamadas foram riscados com uma ponta de pipeta e as áreas feridas resultantes foram monitorizadas por microscopia de contraste de fase durante 24 horas (DU145) e 48 horas (22Rv1). Os resultados são mostrados como n = 3 ± SEM, onde * = p . 0,05 (teste t de Student)

Os ensaios de migração foram efectuados utilizando 8 um de tamanho de poro de 24 poços câmaras Transwell; B: Para invasão ensaia as inserções foram pré-revestidas com MEC. As células foram deixadas migrar /invadir durante 48 horas (DU145) e 72 horas (22Rv1). Os resultados são apresentados como n = 3 ± SEM, onde * = p 0,05, ** = p . 0,01 (t de Student)

Adquirida Docetaxel resistência Influências Anchorage-independente sobrevivência e Crescimento

investigar se a resistência aos medicamentos adquiridos também podem conferir

anoikis

resistência, observou-se resistência aos medicamentos deve ser significativamente associada com diminuição da morte celular em

anoikis

condições tanto para drogas variantes resistentes ao

ie

DU145RD (p 0,05) e 22Rv1RD (p 0,05); em comparação com as respectivas células de controlo (Figura 4A). Subsequentemente avaliar se essas células viáveis ​​são também capazes de proliferar em suspensão, a formação de colónias em ágar mole foi encontrado para ser significativamente aumentada em DU145RD (

P

0,05) e 22Rv1RD (

P . 0,05) em comparação com as suas respectivas células-mãe (Figura 4B)

para

anoikis

ensaios, as variantes da linha celular foram plaqueadas em poli (hidroxietil methactylic) placas de 24 poços revestidas com ácido – ou 95% placas revestidas com etanol, como controlos – e foram cultivadas durante 24 horas. 100 ul de corante azul de Alamar foi então adicionada a cada poço, incubou-se durante 4 horas e foi medida a absorvância a 570 nm; B: ensaios de formação de colónias foram realizadas utilizando Cytoselect ™ 96-Well kit celular Transformação. As células foram incubadas durante 8 dias em meio de agar semi-sólido antes de ser detectado e lisadas com CyQUANT GR tintura num leitor de placas de fluorescência. Os resultados são apresentados como n = 3 ± SEM, onde * = p . 0,05 (t de Student)

exossomas são secretadas a partir de células cancerosas da próstata e pode influenciar a resposta ao Docetaxel mas não alterar significativamente a proliferação, a motilidade e invasão

microscopia electrónica de transmissão identificaram a presença de exossomas isolados a partir do meio condicionado de linha celular todas as variantes (Figura 5A). Além disso western blotting para ambos TSG101 e PDC6I /Alix (Figura 5B), proteínas normalmente associado com a formação de exossomas e, assim, considerado como sendo importantes marcadores de isolamento de exossomas [12], [13], foram detectadas em isolados a partir do meio condicionado de toda a linha de células variantes. Quantidades de exossomos expulsos das variantes docetaxel resistente e envelhecido-pareados não diferiram significativamente (Figura S1A). Como adquirida docetaxel resistência nas células DU145RD foi associado com o aumento da migração e invasão, nós próxima investigado se autólogo (DU145) ou exosomes resistentes (DU145RD) poderia alterar a motilidade avaliadas pela capacidade de cicatrização de feridas (Figura 5C) e invasão (Figura 5D ( i)) de DU145. Não foi encontrada diferença significativa entre fechamento de feridas de células na presença de DU145 ou DU145RD exossomos. Da mesma forma, quando aplicado a 22Rv1 células, nem exosomes DU145- nem DU145RD derivados conferido um efeito substancial sobre a invasão (Figura 5D (ii))

A:. Microscopia Eletrônica de Transmissão foi realizada para investigar tamanho e estrutura da exossomos ; B: transferência Western foi realizada para avaliar a expressão de marcadores de exossomas comuns em 30 ug (TSG101) e 8 mg (PDC6I /Alix) exossomas isolado a partir de células DU145 e linha 22Rv1 variantes; C: DU145-cicatrização de feridas ensaios na presença de exossomas (5 ug) a partir de linha celular DU145 variantes; D (i): Os ensaios de invasão DU145 na presença de exossomas (15 ug) a partir de linha celular DU145 variantes; D (ii): 22Rv1 ensaios de invasão na presença de exossomas (15 ug) a partir de linha celular DU145 variantes

Um ligeiro aumento na proliferação de células DU145 na presença de exossomas DU145 derivados foi observado. . Este aproximou de significância (p = 0,053); No entanto, os exossomas DU145RD não alterou de forma significativa a proliferação de células DU145 (Figura 6A (i)); possivelmente como uma consequência da taxa de crescimento mais lento das células a partir da qual esses últimos exossomas foram derivados. A seguir ao tratamento com o CI

50 concentração de docetaxel, a presença de exossomas DU145 (p 0,05) e a uma maior extensão exossomas DU145RD (p 0,01) (Figura 6A (ii)) foram encontrados para induzir um nível significativo de insensibilidade docetaxel (resistência) para as células. Para investigar de forma mais ampla, se exosomes DU145RD pode induzir semelhante afeta quando aplicado a outras linhas celulares, o próximo investigou essas exosomes em ambos 22Rv1 e células LNCaP (Figura 6B e 6C). Nem DU145- nem exossomas DU145RD derivados afectou significativamente a proliferação de células 22Rv1 ou LNCap (Figura 6B (I) e 6C (i)). Após o tratamento com docetaxel, não se observou alteração substancial na resposta de células 22Rv1 ou LNCap ao docetaxel na presença de exossomas DU145 quando comparado com o efeito do fármaco na presença de PBS em vez de exossomas (Figura 6B (II) e 6C ( ii)). No entanto, na presença de exossomas DU145RD, a capacidade das células 22Rv1 e LNCap para sobreviver neste concentração de docetaxel foi significativamente aumentado (p 0,001) (Figura 6B (II) e 6C (ii)). Para determinar se este é provável que seja específico para exossomos de uma variante linha de células (DU145RD) ou mais em geral para exossomos de células docetaxel de resistência, exossomos de variantes 22Rv1 e 22Rv1RD foram posteriormente avaliados. Aqui encontramos a mesma tendência para ocorrer

i.

Não houve aumento significativo na proliferação de DU145 ou células LNCaP na presença de ambos os exossomos 22Rv1RD (Figura 6D (i) e Figura 6E (i)) 22Rv1 ou. Não houve alteração significativa na resposta ao docetaxel, por utilização de células DU145 ou LNCap, na presença de envelhecido-mãe exossomas 22Rv1-derivados. No entanto, na presença de exossomas a partir da variante resistente 22Rv1RD, ambas as células DU145 (p 0,01) (Figura 6D (ii)) e células LNCaP (p 0,01) (Figura 6E (ii)) mostraram um aumento significativo na resistência à docetaxel

CA (i):. DU145, 22Rv1 e LNCap proliferação na presença de exossomas (20 ug) a partir de linha celular DU145 variantes; A-C (ii) Resposta de células DU145, 22Rv1 LNCap e ao docetaxel na presença de exossomas (20 ug) a partir de linha celular DU145 variantes; D-E (I): DU145 e proliferação LNCap na presença de exossomas (20 ug) a partir de linha de células 22Rv1 variantes; D-E (II): Resposta de células DU145 e LNCap ao docetaxel na presença de exossomas (20 ug) a partir de linha de células 22Rv1 variantes; M: Western blotting foi realizado para avaliar a expressão de MDR-1 /P-gp em proteína total celular (50 ug) e exossomas correspondentes (30 ug) de variantes de linhas celulares DU145 e 22Rv1. Os resultados são apresentados como n = 3 ± SEM, onde * = p 0,05, ** = p 0,01, *** = p . 0,001 (teste t de Student)

Temos anteriormente relatado que tanto DU145RD -e 22Rv1RD a uma maior extent- expressa MDR-1 /P-gp, enquanto MDR-1 /P-gp foi sem ser detectado nas células de controle pareados por idade, DU145 e 22Rv1 [14] (Figura 6F). Para investigar se a MDR-1 /P-gp é possivelmente levada

via

exossomos de células DU145RD ou 22Rv1RD, foi investigada a presença desta bomba de efluxo em exossomos isoladas a partir destas variantes resistentes. Aqui nós relatamos que MDR-1 /P-gp é, de fato, presente nas extrações exosomal correspondentes (Figura 6F).

exossomas são detectados no soro de pacientes com câncer de próstata e pode influenciar Cellular Proliferação, Invasion e resposta ao Docetaxel

Western blotting para ambos TSG101 e PDC6I /Alix (Figura 7A) demonstraram sucesso no isolamento de exossomas a partir de soros de pacientes com cancro da próstata e controlos saudáveis. Quantidades de exossomos detectados no soro de pacientes com câncer de próstata e controles com idade-correspondida não diferiram significativamente (Figura S1B). Quando adicionado às células DU145, exossomos de pacientes com câncer de próstata docetaxel-naïve (n = 6) demonstraram um aumento significativo (

P Art 0,001) aumento da invasão quando comparado com exossomos de controles saudáveis ​​pareados por idade (Figura 7B ). Além disso, quando aplicados a células 22Rv1, houve um aumento significativo na proliferação, na presença de exossomas de cancro da próstata em comparação com os de controlos saudáveis ​​(

P

0,01) (Figura 7C). Para efeitos de avaliação do potencial relevância de exossomas circulante no que diz respeito à forma como eles podem ajudar a prever ou, na verdade, afectar a resposta do paciente ao tratamento com docetaxel, as influências de exossomas isoladas de tratamento os pacientes pré-docetaxel (N = 8) em comparação com os exossomas combinados isolado a partir dos mesmos pacientes durante o decurso das suas 10 ciclos de tratamento com docetaxel foram avaliadas. Para o propósito deste estudo piloto, os pacientes (n = 6) que alcançou a diminuição dos níveis de PSA com o tratamento em comparação com os seus níveis de PSA pré-tratamento foram considerados como “respondedores”, enquanto que os (n = 2), cujos níveis de PSA aumentada durante o curso do tratamento foram considerados como “não-respondedores”. Tal como indicado na Figura 7D, células 22Rv1 e DU145 foram expostos às suas IC aproximados

50 concentrações de docetaxel e a viabilidade de células resultante foi subsequentemente atribuído um valor arbitrário de 1. Os exossomas isolados durante o curso do tratamento de pacientes com o aumento da PSA os pacientes níveis (a B; “não-respondedores”) foram encontradas para proteger tanto células DU145 22Rv1 e dos efeitos do docetaxel. Em contraste, para os seis docetaxel “respondedores”, os exossomas isolados durante o curso do tratamento pareceu aumentar os efeitos inibidores de docetaxel em ambas as células 22Rv1 e DU145.

Western blotting foi realizado para avaliar a expressão de exossomos comuns marcadores em 30 ug exosomes isolado do soro de pacientes docetaxel-naïve (paciente # 1-6) e controles saudáveis ​​pareados por idade (controle # 1-6). B: invasão DU145 na presença de exossomos de pacientes docetaxel-naïve e controles saudáveis ​​com idades entre pareados (25 ug), imagem Invasão representativa com exibido. C: proliferação 22Rv1 na presença de exossomos de pacientes virgens de tratamento e controles saudáveis ​​pareados por idade (25 ug). Os resultados são mostrados como n = 6 ± SEM, onde ** = p 0,01, *** = p 0,001 (teste t de Student). D: Resposta, ao docetaxel, de células 22Rv1 e DU145, na presença de exossomas derivados do soro de pacientes com níveis elevados de PSA (n = 2; Pacientes A B) e na presença de exossomas a partir de pacientes com a diminuição dos níveis de PSA ( n = 6; pacientes C-H)

Discussão

enquanto docetaxel permanece como o padrão ouro atual para o tratamento HRPC, ele só aumenta a sobrevida global por, em média, 2,5 meses e aqueles. doentes que respondem inicialmente, eventualmente, desenvolver a resistência a esta droga. Neste estudo, demonstramos a natureza complexa do docetaxel resistência através do uso de

in vitro

modelos da linha de células de câncer de próstata humano. Ambos linha de células docetaxel resistente variantes neste estudo demonstrou resistência cruzada a doxorrubicina, que é consistente com estudos anteriores de células docetaxel resistente ao cancro do pâncreas [15] e células de cancro da mama [16]. Além disso, o paclitaxel, o docetaxel a partir do qual é derivado sinteticamente, tem sido associada com resistência cruzada a doxorrubicina em linhas celulares de cancro da próstata de paclitaxel-resistente [2]. Curiosamente, as células DU145RD e 22Rv1RD, quando comparado com as suas populações idade dos pais, também compartilhou uma série de outras alterações características fenotípicas, além de resistência e resistência cruzada. Estes incluíram diminuição da taxa de proliferação, o aumento da

anoikis

resistência e aumento da formação de colónias; mas DU145RD e 22RV1RD diferiu com relação a mudanças na sua motilidade e invasão

O aumento da migração e invasão foram previamente ligado com chemoresistance [4] -. [6], que se refletem nos resultados de nosso modelo DU145. Embora as variantes celulares 22Rv1 exibidos os efeitos opostos com respeito à migração e invasão, é de salientar que, para os ensaios de motilidade do nível de fechamento da ferida foi mínima seguinte de 48 horas e ensaios de invasão /migração foram semeadas a uma densidade substancialmente maior do que o necessário para DU145 células para alcançar os resultados observados. É possível que estas diferenças podem ser identificados associados com as diferenças entre as já conhecidas linhas celulares (como, as células são detalhados 22Rv1 a partir de um tumor primário e de androgênio-sensível, enquanto DU145 são a partir de uma metástase cerebral e androgénio são insensíveis). Isso enfatiza ainda mais a necessidade para estes tipos de estudos ea inclusão de maiores painéis de modelos da linha celular, sempre que possível, para o melhor possível reflectir outras diversidades de paciente para paciente e assim aumentar a nossa compreensão da complexidade do docetaxel resistência em câncer de próstata. O knockdown de beta catenina em células osetocarcinoma aumentando a resistência a doxorrubicina foi previamente associada a invasão suprimida [7]. Além disso, as linhas celulares resistentes a múltiplas drogas derivadas do modelo Dunning R3327 de carcinoma prostático de rato foram mostrados para perder potencial metastático em animais hospedeiros, em comparação com as suas células progenitoras [17].

Estudos anteriores utilizando o cancro colorectal ( HT29), cancro da mama (T47D) e cancro do cólon (H630) células, de acordo com a nossa própria, descobri que adquiriu quimio-resistência pode reduzir a taxa de crescimento [18], [19]. proliferação celular reduzida devido à presença de instabilidade cromossómica, que está associado com resistência a multi-drogas, tem sido recentemente demonstrada em células de cancro colorrectal [20]. Assim, o aumento da capacidade de variantes de docetaxel resistente para resistir morte celular sob

anoikis

condições em nosso estudo não pode ser atribuído a uma taxa aumentada da proliferação simples. A associação entre o aumento da sobrevida clonogênica e quimio-resistência, observada tanto no nosso DU145RD e células 22Rv1RD, é consistente com vários outros estudos [18], [21], [22].

A evidência emergente de que as células podem comunicar-se com “células secundárias ou” através da secreção das vesículas micro ou nano-sized (conhecido como exossomos) que transportam informação celular vizinha destacou recentemente a importância dessas entidades [23]. Nós, por conseguinte, investigado o potencial dessas vesículas para ser expulso e transferir alterações fenotípicas associadas com docetaxel,-resistência, a células secundárias. Não foram observadas diferenças significativas na motilidade, invasão ou a proliferação de células DU145 e 22Rv1 na presença de DU145- ou exosomes DU145RD derivados. Estudos limitados, até à data, têm demonstrado que expressam exossomas anfirregulina [24] e HSP90α [25] pode aumentar a motilidade de células cancerosas e a migração. No entanto, isto não parece ser o caso com os exossomas derivadas de células de cancro da próstata avaliadas aqui.

Curiosamente que encontramos induzida docetaxel-resistência com células DU145, na presença de exossomas DU145RD (aprox. 22%), em comparação com quando estas células foram expostas às suas próprias exossomas. Isto sugere que os exossomas DU145RD são, de facto, a transferência de resistência ao docetaxel. Além disso, um padrão similar foi encontrada quando DU145- e exossomas DU145RD derivados foram adicionados às células e 22Rv1 LNCap. Especificamente, um aumento significativo na resistência à docetaxel (aproximadamente 15% para 22Rv1;. 16% para LNCap), independente de influências proliferação, resultou. Isto, pela primeira vez sugere que exossomas podem ser um meio de comunicação de docetaxel-resistência entre as células. Para confirmar que a observada afeta de exossomos DU145RD derivados não se limita a esta variante linha de células, foi realizada uma investigação semelhante com 22Rv1 e 22Rv1RD exossomos. De acordo com os resultados de nossos ensaios exossomos DU145RD iniciais, observou-se uma tendência semelhante de docetaxel-resistência conferida (

ou seja

um aumento de aprox. 11-12%) para ambas as células DU145 e LNCap na presença de exosomes 22Rv1RD.

MDR-1 /P-gp é expressa por ambas as nossas células DU145RD e 22Rv1RD mas é indetectável nas células-mãe, implicando-lo como envolvido no docetaxel-resistência adquirida (esta observação é um pouco de acordo com a situação clínica onde a maioria dos cancros da próstata são MDR-1 /P-gp-positivos [26]). Mais importante, verificou-se que o padrão de expressão nos exossomas correspondentes que reflectida das células a partir do qual eles foram derivados, suportando ainda mais o potencial de transferência de resistência e a sugestão de que MDR1 /P-gp pode ser potencialmente -pelo menos partly- envolvido na resistência conferida pelos exosomes recém-adquirida. No entanto, a diferença de MDR-1 níveis /P-gp entre exossomos de variantes docetaxel resistente em comparação com as suas células parentais não implica necessariamente um papel causal para MDR1- /P-gp na droga-resistência observado.

Para investigar ainda mais o potencial de exossomos em um ambiente clínico, como um estudo piloto, isolado exossomos de pacientes com câncer de próstata docetaxel-naïve e controles saudáveis ​​da mesma idade. Investigamos efeitos destes exossomas na invasão de células de cancro e proliferação. O aumento da proliferação e invasão de células na presença de exossomas de pacientes com cancro sugere um papel causal para estes exossomas. Embora este seja um pequeno estudo piloto, tomados em conjunto com os nossos estudos celulares exossomas derivada da linha, que apoia ainda mais a hipótese de que os exossomas podem ter um papel na comunicação celular de cancro da próstata.

No contexto do docetaxel-resistência, que posteriormente investigado a relevância da exossomos derivados de pacientes relevantes. Especificamente este estudo piloto (n = 8 pacientes) incluiu combinados exossomas de soro obtidas antes e durante o curso de tratamento com docetaxel. Aqui foi avaliada a resposta de células DU145 e 22Rv1 a sua IC

50 concentrações de docetaxel (como mostrado na Tabela 1

isto é, 1,7 nM para

células DU145; 4 nM para 22Rv1 células) na presença de estes exossomos populações. O docetaxel-resistência observada conferida a ambas as linhas de células por isolados exossomas a partir de pré-ciclo sete soros (n = 2 pacientes) correlacionados com o aumento dos níveis de PSA em doentes. Os exossomas a partir dos 6 pacientes restantes parecia para conferir sensibilidade aumentada para ambas as células DU145 e 22Rv1, correlacionando com os pacientes (n = 6) diminuição dos níveis de PSA ao longo do seu curso de tratamento.

Uma possível explicação para a maneira através do qual são exossomas afectar o fenótipo das células “alvo” é que eles estão transferindo mRNAs, miARNs e /ou proteínas a partir de células de resistência adquirida, que são moléculas causais em alterar o fenótipo celular das células receptoras secundárias. Isto está de acordo com a acumular evidência que exossomas desempenhar um papel importante na comunicação célula-a-célula. Por exemplo, em 2007 Valadi et ai. demonstraram que os ARNm realizadas através de exossomas a partir de mastócitos são traduzidos em proteína na sua transferência para as células [10] alvo. A implantação bem sucedida de exossomas por células secundárias também foi demonstrada por Skog et ai. [11], quando exossomas glioblastoma fluorescentemente marcadas foram incubadas com células endoteliais. Muitos exemplos mais recentes destas observações foram reportadas e um parecer recente por Mittelbrunn e Sanchez-Madrid, [27] descreve ainda como pode ocorrer a transferência da informação genética, com os efeitos de exossomas em células secundárias que pode contribuir para o crescimento carcinogénese e do tumor; moldar o microambiente do tumor; promoção da angiogénese; e modular a resposta imune [28], [29]. Especificamente em relação à modulação da resposta à terapia anti-cancro, que sobre-expressam HER2 exossomas a partir de células do doador foram mostrados para diminuir a sensibilidade das células receptoras ao trastuzumab [30]. Assim, enquanto não podemos especular sobre as moléculas específicas que podem ser transportadas

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exossomos de nossas células resistentes para induzir alterações fenotípicas nas células-alvo (exceto para sugerir que a transferência de MDR-1 /proteína P-gp pode, em parte, ser um factor que contribui), é razoável sugerir que pode ser uma única combinação -OR de- mRNAs, miARNs e /ou proteínas que têm um papel causal na docetaxel-resistência. Assim, agora que a relevância funcional tem sido associada com estes exossomas em conferir um nível de docetaxel-resistência, perfilar o conteúdo destes exossomas está garantido para melhor compreender a molécula exacta (s) e mecanismo (s) envolvido.

em conclusão, este estudo corrobora que o docetaxel-resistência no cancro da próstata é altamente complexo e pode ser associado com variadas afecta celular em termos de resistência a outros fármacos quimioterapêuticos, motilidade, invasão e crescimento independente de ancoragem. É claro, porém, que, dada a natureza multifacetada de docetaxel-resistência que não um, mas vários fatores parecem mediar os seus efeitos no câncer de próstata. Aqui nós mostramos, pela primeira vez, que a comunicação celular

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exossomos podem, em parte, resultar em docetaxel-resistência conferida às células secundárias. estudos futuros sobre maiores coortes de amostras de soro, de ambos os pacientes docetaxel-naïve e também de pacientes após o tratamento com docetaxel, são garantidos -assessing tanto os efeitos da e os conteúdos moleculares da exosomes- para expandir nossa compreensão da exossomos e sua relevância para celular comunicação e docetaxel resistência no cancro da próstata

Materiais e Métodos

linhas celulares e Cultura celular

linhas celulares de cancro da próstata, 22Rv1 (ATCC CRL-2505;. andrógeno-sensíveis , a partir de um tumor humano primário), DU145 (ATCC HTB-81; androgénio-insensível; a partir de uma metástase cerebral) e LNCap (ATCC CRL-1740; sensível ao androgénio, a partir do nó de linfa metástase) foram adquiridos da American Type Culture Collection ( ATCC). 22Rv1 células DU145 e foram mantidas em meio RPMI (Sigma-Aldrich) suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAA), 1% de L-glutamina (Sigma-Aldrich) e a 37 ° C /5% de CO

2. As células LNCaP foram mantidas em meio RPMI avançada (Biosciences) suplementado com 10% de soro bovino fetal (PAA), 1% de L-glutamina (Sigma-Aldrich) e 1% de HEPES (Sigma-Aldrich) e a 37 ° C /5% de CO

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