Sumário
O cancro do pulmão é uma das principais causas de morte relacionada com câncer em todo o mundo, com mais de um milhão de mortes por ano. O mau prognóstico é devido à sua alta agressividade e sua metástase cedo. Embora os mecanismos exactos ainda são desconhecidas, o processo de epitelial para mesenquimal (EMT) parece estar envolvida nestes processos neoplásicos. Nós já demonstraram que os níveis séricos de CCL18, uma quimiocina específica primata, são altamente elevados em pacientes com câncer de pulmão e correlacionar com o seu tempo de sobrevivência de pacientes com adenocarcinoma do pulmão. Portanto, a hipótese de que CCL18 pode estar diretamente envolvido em processos patológicos de câncer de pulmão, por exemplo, EMT. Investigou-se o efeito de CCL18 em A549, uma linha celular de adenocarcinoma de pulmão, em EMT e outras funções celulares tais como a proliferação, a quimiotaxia, invasão, quimiorresistência e proliferação. A exposição de células do cancro do pulmão A549 para CCL18 em várias concentrações diminui o marcador de E-caderina epitelial, enquanto que FSP-1, um marcador das mesenquimais fenótipo aumenta. Por conseguinte, CCL18 induziu o regulador transcricional EMT SNAIL1 de uma forma dependente da dose. Em contraste, uma concentração crescente CCL18 foi associada com uma diminuição da taxa de proliferação celular. Além disso, a quimiotaxia induzida CCL18 destas células e aumentaram a sua quimioresistência. Portanto, CCL18 pode ser um alvo terapêutico interessante para NSCLC
Citation:. Ploenes T, Scholtes B, Krohn A, Burger M, Passlick B, Müller-Quernheim J, et al. (2013) CC-quimiocinas Ligand 18 Induz epitelial para mesenquimal Transição em células de câncer de pulmão A549 e eleva o potencial invasivo. PLoS ONE 8 (1): e53068. doi: 10.1371 /journal.pone.0053068
editor: Vladimir V. Kalinichenko, Hospital Infantil de Cincinnati Medical Center, Estados Unidos da América
Recebido: 25 de junho de 2012; Aceito: 28 de novembro de 2012; Publicação: 18 de janeiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Ploenes et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Há não há fontes de financiamento externas atuais para este estudo. T. P. é um beneficiário de uma doação pela Universidade de Freiburg Albert-Ludwig (Stiftung Mattern). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
Conflito de interesses:. Os autores têm as seguintes participações. J.M.Q. e G.Z. solicitaram uma patente sobre CCL18 e CCL18R como biomarcador e alvo de terapia (patente pendente). G.Z. é um membro do PLOS ONE Editorial Board. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.
Introdução
Tumor metástase é um evento complexo que envolve várias etapas, incluindo a separação das células cancerosas do compacto tumor primário, a migração em vasos, invasão no tecido ea formação de um nódulo tumoral secundária. Embora ainda sob debate, epitelial para mesenquimal (EMT) parece ser um dos eventos-chave no progresso local e metástases de tumores epiteliais [1], [2]. EMT é um evento complexo de múltiplos passos, que não só altera a morfologia celular, mas também permite que as células para obter novas funções importantes como a expressão de novas moléculas ou migração e invasão. Para além das alterações morfológicas, o processo de EMT é caracterizada por diferenças de transcrição e expressão de genes epiteliais e mesenquimais. Um dos marcadores moleculares mais importantes de células epiteliais, é a molécula de adesão epitelial E-caderina, que medeiam as interacções célula-célula [3]. O processo de EMT está associada com uma perda de E-caderina, que está positivamente correlacionada com a fase do tumor e a sobrevivência pobre em muitos tumores epiteliais [4] – [6]. Além da perda de marcadores epiteliais da expressão de marcadores mesenquimais como FSP-1 é também um passo importante no processo de EMT [7]. FSP-1, também chamado S100A4, correlaciona-se com o potencial metastático de neoplasmas e alguns autores demonstraram que um nível elevado de FSP-1 está associado com prognóstico pobre em vários tipos de cancro [8] – [10]. EMT é regulada por vários fatores de transcrição [11]. Um dos mais importantes é SNAIL1, que também actua como repressor da E-caderina. Tem sido demonstrado que a expressão elevada SNAIL1 está associada com mau prognóstico no cancro do pulmão [12]. EMT pode ser induzida por vários factores de crescimento e citoquinas, o mais importante por TGF-beta, mas também por EGF, FGF, HGF e outros [13]. A maioria destes factores estão presentes no ambiente tumoral e produzidos pelas células de tumor em si ou por circundante componentes celulares. O microambiente de tumores sólidos é uma mistura complexa de factores celulares e não celulares, em que os macrófagos associados a tumores (TAM) representa até 50% da massa tumoral [14]. TAM são alternativamente activados macrófagos que segregam um padrão específico de várias citocinas promotoras de tumores e factores de crescimento. Uma destas citoquinas é o ser humano específico do ligando de quimiocina CC 18 (CCL18), que é altamente presente no tecido de pulmão e envolvido em vários processos patológicos da fibrose ou doenças malignas [15] – [20]. Nós já demonstrou que CCL18 é altamente elevados em soros de pacientes com câncer de pulmão de células não pequenas e correlaciona-se com o estágio do tumor e sobrevida global no subgrupo de adenocarcinoma [21], [22]. CCL18 nível sérico dos pacientes com cancro do pulmão de células não pequenas significar foi de 150 (857) ng /mL comparativamente com 32 (61) ng /ml no grupo de controlo saudável [22]. Nós, portanto, a hipótese de que CCL18 é um indutor de EMT em células humanas de adenocarcinoma do pulmão e aumenta o potencial metastático.
Materiais e Métodos
Reagentes
TGFbeta1 humana recombinante foi adquirido a R D (R D Systems, Wiesbaden, FRG), CCL18 humana recombinante a partir de Immunotools, Friesoyte, Alemanha, anticorpos policlonais de coelho contra FSP-1 humana e SNAIL1 humano e um anticorpo monoclonal de ratinho contra a tubulina humana foram adquiridos a Abcam (Abcam, Cambridge, UK) e um anticorpo policlonal de coelho contra a e-caderina humana era do norte do estado (norte do estado, Billerica, EUA).
experimentos de cultura celular
adenocarcinoma humano linha celular A549 (ATCC , CCL-185) foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Invitrogene, Carlsbad, EUA) com 10% de soro bovino fetal (PAA, Pasching, Austria), 100 ug /ml de estreptomicina e 100units /ml de penicilina (Invitrogen) a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 atmosfera. As culturas de células foram colhidas a 80% de confluência de 24 horas antes da estimulação, contadas e semeadas em placas de seis poços a uma densidade de 30.000 células por ml. As células foram incubadas com CCL18 em várias concentrações (100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, 100 ng /ml) durante 24 horas ou 72 horas em DMEM isento de soro. TGFbeta (2 ng /ml,) foi utilizado como controlo positivo.
transcrição reversa PCR (RT-PCR)
O ARN total foi isolado utilizando Trizol (Invitrogen). A transcrição reversa foi realizada utilizando Omniscript RT Kit (Qiagene, Düsseldorf, FRG). primers específicos para SNAIL1 humana, FSP-1, E-caderina e GAPDH foram projetados usando software AmplifX (https://ifrjr.nord.univ-mrs.fr/AmplifX-Home-page) usando bancos de dados NLM GenBank (National Center for Biotechnology informação; https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/). números de código de Adesão para as sequências de nucleótidos utilizados para gerar os respectivos primers e as sequências dos iniciadores são listados na tabela 1.
Todos os iniciadores foram intron-medindo e sintetizado por Biomers (Biomers.net, Ulm, FRG ). PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green iQ SuperMix, iCycler termociclador, e 3,0 software iCycler iQ (Bio-Rad Laboratories GmbH, Munique, RFA), de acordo com o protocolo do fabricante. Derreter análise da curva foi utilizada para controlar a especificidade dos produtos de amplificação. Sem amplificação dos produtos não específica foi observada em qualquer das reacções. Um valor de ciclo limiar (Ct) foi calculado e utilizado para calcular o nível relativo de ARNm específico nas amostras pela seguinte fórmula: h3>
Western Blot
As células foram lavadas três vezes com gelada PBS e raspadas a partir do fundo. As células foram lisadas com tampão de lise (50 mM de Tris-HCl a pH 7,6, NaCl 150 mM, EDTA 2 mM, EGTA 2 mM, 0,1% Trition X), contendo um cocktail inibidor de protease. A concentração total de proteínas foi medida utilizando o kit de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Waltham, MA) com albumina de soro bovino como padrão. Os lisados celulares totais foram cozidos a 93 ° C durante 5 minutos, em volumes iguais de tampão de carga (Tris-HCl a pH 6,8 a 0,5, SDS a 2%, 0, 05% de bromofenol azul, 20% de 2-mercaptoetanol, 10% de Glicerol ).
Todas as amostras foram submetidas a 12% de dodecilsulfato de sódio-PAGE, separados por electroforese e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (PVDF). Após bloqueamento durante 2 h em solução salina tamponada com Tris (TBS) contendo 5% leite seco não gordo, as membranas foram incubadas com anticorpo primário diluído 1:200 (FSP-1), 1:500 (E-cadherine) ou 1: 3000 (SNAIL1) com TBS contendo 5% de leite seco não gordo a 4 ° C durante a noite. A visualização foi realizada usando anticorpos secundários apropriados marcados com IRDye 800CW ou IRDye 700CW (LI-COR Bioscience, Bad Homburg, RFA) diluída 1:10 000-1:20000 durante 2 h e digitalizados utilizando sistema Odyssey (LI-COR Bioscience, Bad Homburg , FRG) de acordo com as instruções do fabricante.
Ensaio de quimiotaxia
quimiotaxia ensaios foram realizados usando uma câmara de quimiotaxia de 10 poços (NeuroProbe, Gaithersburg, EUA). Os poços inferiores foram cheias com 400 ul de DMEM contendo CCL18 em concentrações de 100 pg /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml e 100 ng /ml (controlo: TGFbeta 2 ng /ml). A 12 uM de poros de diâmetro filtro de policarbonato isento de polivinilpirrolidona (NeuroProbe, Gaithersburg, E.U.A.) foi colocado sobre a placa de fundo. Uma junta de silicone e a placa de topo com 12 furos foram, em seguida, montado, formando o topo poços. 2 × 10
4 células foram adicionadas num volume de 285 ul. Em experiências paralelas, DMEM sem quimiocina foi carregado nas cavidades de fundo como um controlo negativo. Um segundo controlo negativo com quimiocina da mesma concentração, na parte superior e inferior do poço foi também realizada. Após 24 horas de incubação a 37 ° C e 5% de CO2, a folha de filtro foi removido, e as células que não migraram foram varrido a partir do lado superior do filtro. O filtro foi depois corado usando violeta de cristal (Sigma-Aldrich, St. Louis, E.U.A.) e fixados em laca clara. Após este 9 de alto poder campos por filtro foram contadas com uma ampliação de 200 vezes utilizando um microscópio Zeiss.
Invasão Ensaio
A capacidade das células para migrar através de uma matriz de membrana basal foi medida utilizando Matrigel o celular Invasion Assay Kit (Chemicon International, Temecula CA) com 8 mm de membrana de tamanho de poro de policarbonato. Depois de re-hidratação dos geles durante 2 horas, 1 × 10
5 células em DMEM isento de soro, foram aplicadas para a câmara superior, enquanto a câmara inferior continha DMEM isento de soro ou sem soro DMEM suplementado com CCL18 em várias concentrações ou TGFbeta como um controlo. Após incubação a 37 ° C durante 24 horas, todas as células do lado da câmara superior foram removidas com um cotonete e a membrana foi removida e as células foram coradas invasivos usando cristal violeta. A análise foi realizada pela contagem de 9 campos de alta potência por filtro com uma ampliação de 200 vezes usando um microscópio Olympus (Olympus, Tokio, JPN).
chemoresistance Ensaio
Para medir a influência de CCL18 em quimiorresistência de células de tumor, as células A549 foram cultivadas numa placa de 6 poços e cultivadas a 80% de confluência. As células foram cultivadas durante 24 a 72 h com ou sem CCL18, em concentrações tal como indicado. Subsequentemente, foi adicionada uma série de diluições de cisplatina que varia de 0,4 a 25 ug /ml durante 72 horas adicionais. No final do período de ensaio, as células vivas foram medidos usando MTT [brometo de tetrazólio -2,5-difenil-3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) brometo] ensaio. O meio foi mudado e solução de MTT (5 mg /ml em solução salina tamponada com fosfato /poço) foi adicionado durante 4 h e o formazan gerado foi solubilizado em isopropanol e medido espectrofotometricamente a 563 nm. A densidade óptica obtidos para as células não tratadas foi definida a 100% e utilizado para calcular as percentagens de células viáveis nas culturas tratadas.
ensaio BrdU -Proliferation
a síntese de ADN foi medida utilizando um bromodesoxiuridina (BrdU) Kit de Proliferação celular (Calbiochem, Darmstadt, FRG). solução de marcação com BrdU foi adicionado às células em combinação com os diferentes tratamentos e incubou-se durante 24 h. Após a remoção do meio de cultura, as células foram fixadas, permeabilizadas e o DNA foi desnaturado por meio de micro-ondas. O anticorpo anti-BrdU foi adicionado durante uma hora antes da adição de conjugado de IgG de ratinho-peroxidase durante 20 minutos. O sinal foi desenvolvido com uma solução de tetrametilbenzidina na escuridão. A absorvância foi medida utilizando um leitor de placas espectrofotométrico a 450 nm com um comprimento de onda de referência a 595 nm.
A análise estatística
A análise estatística foi realizada usando StatView (SAS Institute, Cary, NC). Os valores são apresentados como média ± SD de, pelo menos, de um mínimo de três experiências realizadas independentemente. Dose-dependências foram calculados pelo teste Friedman seguido de comparações pareadas pelo teste de Wilcoxon.
Resultados
Mudança de celular Morfologia
Inicialmente, A549 divulgada uma morfologia epitelial paralelepípedo, típica com contactos célula-célula apertadas (Fig. 1A). O tratamento das células com CCL18 durante 24 horas induzidas alterações acentuadas na morfologia celular (fig. 1C e D). Células mudou sua morfologia do cubóide ou um triângulo em forma de fuso-forma; extrusões celulares prolongadas desenvolvidos e contato célula-célula foram menos intensos. Estas modificações podem ser observadas ao longo de um intervalo de dose de 1 a 100 ng /ml (Fig. 1C). Como esperado, a estimulação com 2 ng /ml de TGF-beta durante 24 horas induzida também um fuso-forma, do tipo fibroblastos fenótipo (Fig. 1B). Assim, CCL18 e TGFbeta induzir alterações morfológicas compatíveis com EMT
As alterações morfológicas em células tratadas com CCL18 e TGFbeta:. Células A549 não tratados mostram morfologia epitelial típica com célula-célula-contactos estreitos, que são marcadas por setas brancas ( UMA). Após o tratamento com 2 ng /ml células -p mudou o fenótipo de uma morfologia mais mesenquimais com extrusões celulares prolongados e afrouxou célula-célula-contactos marcados por setas. (B) CCL18 também altera a morfologia celular de uma forma dependente da dose (C [1 ng /ml] e D [10 ng /ml]) para semelhantes a fibroblastos mesenquimais fenótipo e afrouxado célula-célula-contactos marcadas por pontas de seta.
a expressão de genes relacionados com a EMT
Usando RT-PCR, não foi possível detectar qualquer efeito claro de CCL18 sobre a expressão da caderina-E em nenhuma das concentrações utilizadas depois de um tempo de estimulação de 72 horas (Fig. 2A). Em contraste, a estimulação de A549 com CCL18 durante 72 horas aumenta SNAIL1 (Fig. 2B) e FSP-1 expressão (Fig. 2C). O aumento na expressão FSP-1 foi estatisticamente significativa (p 0,03). Curiosamente, o efeito foi máximo a 1 ng /ml CCL18 e diminuiu ligeiramente com concentrações crescentes (Fig. 2C.). Comparado a controlar os estímulos CCL18 quase duplicou expressão média SNAIL1. No entanto, este aumento não atingiu significância e nenhuma dose-relação clara poderia ser detectada (Fig. 2B). Curiosamente, embora TGFbeta induziu um aumento na expressão e SNAIL1 FSP1, os efeitos foram mais baixos do que o observado com a concentração comparável CCL18 (1 ng /ml). Novamente, nenhum efeito sobre a expressão de E-caderina pode ser encontrado.
os níveis de ARNm de (A) a E-caderina, (B) SNAIL1, (C) FSP-1 após a estimulação com várias concentrações -β ou para CCL18 72 h em relação ao controlo não estimulado. Cada barra representa a média ± DP de quatro expericias independentes. GAPDH foi utilizado como gene de manutenção para normalizar as diferenças na quantidade de RNA total.
Alterações na expressão de Proteines relacionadas com a EMT
Para confirmar nossas descobertas PCR, analisamos a proteína expressão por Western Blot. Em paralelo com os resultados da PCR, expressão de E-caderina divulgado um ligeiro, mas não significativo decréscimo quando as células foram estimuladas com CCL18 durante 72 horas (Fig. 3a). Em contraste, foi encontrado um aumento significativamente SNAIL1 (p 0,005; Fig. 3B) e FSP-1 expressões (p 0,05; Fig. 3C) por quarenta e cinquenta por cento, respectivamente. TGFbeta (2 ng /ml) induziu quer não (snail1) ou apenas marginal e alterações insignificantes (E-caderina, FSP1, Fig. 3).
Todos os resultados foram normalizados para o controlo não tratado. Bares resumir os resultados de três western blot independente análises, no painel direito um blot representativo é descrito.
Relacionado com o CCL18 de quimiotaxia e Invasão
Boyden experimentos câmara revelou que CCL18 induz a quimiotaxia de As células A549 de forma dependente da dose. Observou-se uma dose dependente e significativa (p 0,0001) aumento da quimiotaxia induzida por CCL18, que atingiu o seu máximo (50% em relação ao controlo) a uma dose de 100 ng ml CCL18 /(Fig. 4). TGFbeta (2 ng /mL) aumenta a quimiotaxia de 40%, o que também foi estatisticamente significativa (p 0,0001). O ganho da capacidade de invasão em um tecido ou matriz é uma característica adicional e importante de EMT requerendo actividade proteolítica adicional de quimiotaxia. Assim, analisamos o efeito de CCL18 sobre a capacidade de invasão. Descobrimos que CCL18 (1 ng /mL) aumenta a invasão para mais do dobro em comparação com o controlo (p 0,0001; Fig. 5). . TGFbeta (2 ng /ml) aumenta invasivo na mesma faixa, mas menos pronunciada (p 0,0001)
Significados foram calculadas usando comparação pareada (Wilcoxon Signed Rank Test), controle: células não tratadas (n = 4) .
Significados foram calculadas usando comparação pareada (Wilcoxon Signed Rank Test), controle: células não tratadas (n = 3)
Proliferação
Para. determinar o efeito de CCL18 na proliferação de células, as células A549 foram tratadas durante 24 horas, quer com 2 ng /ml de TGF-beta ou 0,1 ng /ml, 1 ng /ml, 10 ng /ml, ou 100 ng /ml de CCL18, respectivamente, e subsequentemente um ensaio BrdU foi realizada. A incubação com CCL18 diminuiu a taxa de proliferação de um modo dependente da dose, atingindo uma redução significativa de 50% em comparação com os controlos a 1000 ng /ml (p 0,001; Fig. 6). TGFbeta (2 ng /ml) reduziu a taxa de proliferação em 55% em comparação com os controles (p 0,001).
chemoresistance
Nós investigados se CCL18 modula a sensibilidade das células A549 para o tratamento com cisplatina. Portanto, as células incubadas com CCL18 e subsequentemente tratado as células com diluições em série de cisplatina. Após estimulação CCL18 durante 72 horas, sem efeitos tóxicos de CCL18 ou TGF-beta pode ser detectada (dados não mostrados). LD
50 de células A549 não tratados foi de 6 mg /ml Cisplatina. Após estimulação CCL18 (0,1 ng /ml) das células durante 72 horas, o LD
50 aumentou a 9 ug /mL de cisplatina. Da mesma forma, a DL50 de células estimuladas subiu para 10 ug /ml quando as células foram pré-tratadas com 1 ng /ml CCL18 (Fig. 7). Concentrações mais elevadas de CCL18 foram ensaiados mas nenhum efeito adicional foi observada (dados não mostrados).
As células foram cultivadas na presença ou ausência de -TGFbeta CCL18 ou nas concentrações indicadas, durante 72 h. Após o período de cultura, o meio foi mudado e as células foram incubadas com cisplatina durante mais 72 horas a concentrações entre 0,4 e 25 ug /ml. A sobrevivência das células foi medido pelo ensaio de MTT. A linha horizontal indica o LD
50, as linhas verticais indicam a LD
50 para a respectiva condição de pré-incubação (n = 4).
Discussão
Lung o cancro é uma das doenças malignas com maior incidência no mundo ocidental e, apesar de todos os avanços no diagnóstico e terapia uma das principais causas de câncer relacionado a morte [23]. Cerca de 85% destes doentes sofrem de cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC), que está subdividido em carcinoma escamoso, adenocarcinoma, carcinoma de células grandes e outros subtipos raros [24]. Adenocarinoma representa as maiores proporções de NSCLC e, desde a década de 1970 a sua proporção está a aumentar [25]. No momento do diagnóstico, a maioria dos doentes com NSCLC já sofrem de doença avançada ou metastático, o qual está associado com prognóstico pobre [26]. O mecanismo de metástases do cancro do pulmão não é totalmente compreendido, mas epitelial para mesenquimal (EMT) parece ser um acontecimento chave no processo de metástase. Alguns autores já demonstrado que vários mediadores libertados no microambiente de tumores sólidos são capazes de induzir EMT e, por conseguinte, promover a progressão da doença [14]. CCL18 é uma quimiocina produzido e libertado por macrófagos associados a tumores (TAM) no microambiente das células cancerosas e fibrose pulmonar [16], [17]. Foi possível demonstrar que CCL18 é altamente elevados em pacientes com NSCLC e correlaciona-se com t-fase e o tempo médio de sobrevivência no subgrupo de adenocarcinoma [21]. Isso leva à pergunta se CCL18 está diretamente envolvido nos processos patogênicos em doenças cancerosas. Desde CCL18 foi encontrada para induzir colagénio em fibroblastos de pulmão e para agir de uma maneira semelhante como TGFbeta [17], [27], [28], a hipótese de que CCL18 pode promover o processo de metástase através EMT. As células A549 são uma linha celular humana bem caracterizada isolado a partir de um adenocarcinoma do pulmão, o qual já tenha sido utilizado em vários estudos investigando a indução de EMT por TGF-β [29], [30]. De acordo com os outros, que demonstram que as células A549 tratadas com o mesmo uma dose baixa de TGF-β sofreu mudanças morfológicas de células epiteliais cubóides à haste células semelhantes a fibroblastos em forma e adquiriu um fenótipo mesenquimal após 24 horas de tratamento. Da mesma forma, também foram capazes de demonstrar que as mesmas CCL18 induz alterações morfológicas como TGF-β. Isto é ainda apoiada pela análise do padrão de genes epiteliais e mesenquimais em ARNm e proteína nível de expressão. A sobre-regulação de genes mesenquimais como FSP-1 ou SNAIL1 é uma característica do processo de EMT. As alterações observadas do padrão de expressão característico foram bastante semelhantes em TGF-β e em estimulações CCL18. Neste contexto, é notável que Miyazaki et al. publicado em 2006, que os pacientes com adenocarcinoma pulmonar demonstrando uma baixa expressão da caderina-E em combinação com uma alta FSP-1 expressão tem que enfrentar um pior prognóstico significativo devido à metástase hematogênica [9]. Observou-se também que SNAIL1, um factor de transcrição envolvidos nos eventos iniciais da EMT, foi regulado para cima por tratamento CCL18, do mesmo modo como por TGFbeta. No processo de metástase, as células cancerosas adquirem novos recursos como invasão, migração acrescida e a sub-regulação da proliferação. Nós, portanto, estudaram também a influência de CCL18 sobre estas funções celulares e observou-se um potencial migratório e invasiva aumentada após 24 horas de tratamento CCL18. Além disso, a taxa de proliferação de A549 diminuiu após 24 horas de tratamento CCL18, que pode ser devido ao início de diferenciação processos. No total, estas grandes alterações em funções celulares mencionadas acima demonstram uma forte influência de CCL18 no processo de metástase. Assim, com base em nossos dados apresentados aqui, em nossos dados publicados anteriormente que o aumento CCL18 soro correlaciona-se com a diminuição do tempo de sobrevida no adenocarcinoma do pulmão [22] e na observação por Chen et al. demonstrando que CCL18 promove a metástase do câncer de mama [5] a hipótese de que CCL18 pode ser um dos factores determinantes EMT no ambiente do tumor.
Tendo em mente que a maioria dos pacientes necessitam de quimioterapia ou como adjuvante ou neoadjuvante parte de uma abordagem multimodal ou como uma única terapia, chemoresistance ainda é um dos principais obstáculos no tratamento suficiente de NSCLC ea razão do progresso do tumor, recidivas e morte do tumor. A quimioterapia de NSCLC ainda depende de platina derivado drogas embora se saiba que existem vários mecanismos de como as células de cancro do pulmão escapar cisplatina citotoxicidade e CCL18 pode ser um mediador crucial nestes processos. Estes mecanismos parecem estar ligados à EMT porque factores de transcrição que regulam EMT também regulam a proteínas transportadoras ligadas a um aumento da resistência aos agentes de platina [31], [32]. Por isso, investigamos o papel de CCL18 em chemoresistance. Observou-se, na verdade um aumento chemoresistance induzida por CCL18. Curiosamente, este aumento de chemoresistance atingiu o pico no mesmo intervalo como marcadores de EMT (por exemplo FSP1). Isto fornece evidência para um papel de CCL18 na indução de quimioresistência. Porque CCL18 é uma quimiocina, que também pode estar envolvido na homing das células do cancro, nós também investigou as propriedades chemotacic de CCL18 em células A549. Observamos que CCL18 exerce um aumento dependente da dose na quimiotaxia de células de câncer de pulmão, indicando, que CCL18 atrai células de câncer de pulmão aos locais de liberação CCL18. Como o pulmão é o órgão com o maior nível de produção CCL18, este efeito pode influenciar o homing de CCL18 células tumorais responsivas ao pulmão.
Curiosamente, na maioria dos experimentos não poderíamos observar um corte claro dose-dependente efeito de CCL18. Em contraste, o aumento das concentrações de CCL18 muitas vezes resulta em efeito de CCL18 diminuindo. Isto é compatível com a expressão dos diferentes receptores de agonistas e antagonistas de CCL18. Recentemente, Catusse et ai. publicado que CCL18, desencadeando através de GPR30, actua agonística e diminui os efeitos mediados-CXCR4 de CXCL12 [15]. Chen et al. demonstraram que PITPNM3, uma proteína contendo o domínio de transferência de fosfatidilinositol associada à membrana, pode actuar como um receptor CCL18 [5]. Identificamos a CCR6 receptor de quimiocinas já conhecido como um receptor CCL18 com potência para iniciar as atividades descritas nos fibroblastos [33]. Isso indica que CCL18 pode usar vários receptores e o equilíbrio da expressão do receptor pode regular o agonista e os efeitos antagônicos de CCL18.
Em conclusão, nossos dados demonstram que CCL18 induz EMT em células A549, melhora o seu potencial metastático e apoia a resistência à quimioterapia. Assim, CCL18 é não só um mediador libertado por macrófagos associados a tumores e, potencialmente, reflectindo o tamanho do tumor, mas também influencia processos neoplásicos de adenocarcinoma. Os dados aqui apresentados demonstram que CCL18 é capaz de desencadear eventos envolvidos em metástase de tumor, tais como a mudança a partir de células tumorais epiteliais primárias em migratória células mesenquimais, quimiotaxia, e invasão. Além disso, CCL18 também protege as células tumorais a partir de quimioterapia, aumentando quimioresistência. Assim, podemos concluir que CCL18 será um alvo futuro no tratamento de câncer de pulmão.