Abstract

Objectivo

5-fluorouracil (5-FU) tem sido amplamente utilizado como uma droga de primeira linha para o tratamento do câncer colorretal (CRC), mas limitada pela resistência aos medicamentos e toxicidade grave . Os quimio-sensibilizadores que aumentam sua eficiência e superar suas limitações são urgentemente necessários. Gypenosides (Gyp), os principais componentes de

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, mostrou potencial propriedade anti-tumor com pouco efeito colateral. Aqui, nós cuidadosamente explorado a quimio-sensibilização dos Gyp para potenciar o efeito anti-tumoral de 5-FU

in vitro Comprar e

In vivo

.

Metodologia /PRINCIPAIS CONCLUSÕES

3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltertrazolium brometo de tetrazólio e ensaio de formação de colónias de teste revelam que cigano poderia melhorar significativamente o 5-FU provocou SW-480, SW 620 e Caco2 células perda de viabilidade. A análise mostra que CalcuSyn Gyp age sinergicamente com 5-FU. Anexina V-PE /7-AAD coloração indica o 5-FU + cigano poderia induzir a apoptose de células SW-480. As activações de caspase 3, caspase 9 e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) foram envolvidos no processo. GYP também foi encontrada para regular a 5-FU provocou a expressão de fosfo-p53 e, assim, aumentar a captura de fase induzida por 5-FU G0 /G1. Gyp nível elevado intracelular ROS, aumentou significativamente a resposta de 5-Fu-desencadeada DNA danos como evidenciado por citometria de fluxo, teste do cometa ea expressão de Ser139-histona H2A.X. Inibição de ROS e p53, respectivamente, inverteu a morte celular induzida por 5-FU + cigano, sugerindo o papel-chave de ROS e p53 no processo. Além disso, o 5-FU e cigano em combinação exibe muito superior do volume tumoral e a inibição de peso em TC-26 de rato modelo de xenoenxerto em comparação com o 5-Fu sozinho ou cigano. A análise imuno-histoquímica sugere a proliferação do tumor significativamente suprimida combinações. resultados toxicológicos preliminares mostram que o tratamento com 5-FU + Gyp é relativamente segura.

Conclusões

Como um potencial quimio-sensibilizador, Gyp exibe um efeito sinérgico esplêndida, com 5-FU para inibir a proliferação de células cancerígenas e o crescimento do tumor. Usando 5-FU e Gyp em combinação seria uma estratégia terapêutica promissora para o tratamento CRC

Citation:. Kong L, Wang X, Zhang K, W Yuan, Yang Q, Fan J, et al. (2015) Gypenosides aumenta sinergicamente o efeito anti-tumoral de 5-fluorouracil sobre o Cancro Colorectal In Vitro e In Vivo: um papel para dano oxidativo DNA mediada por estresse e ativação p53. PLoS ONE 10 (9): e0137888. doi: 10.1371 /journal.pone.0137888

editor: Wei-Guo Zhu, Peking University Health Center Ciência, CHINA

Recebido: 27 de junho de 2015; Aceito: 24 de agosto de 2015; Publicação: 14 de setembro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Kong et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

financiamento:.. os autores não têm apoio ou financiamento para relatar

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer maligno mais comum ea quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer em todo o mundo, que respondendo por cerca de 1,2 milhões de novos casos e 600 000 mortes por ano [1]. A ressecção cirúrgica, seguido por quimioterapia ou radioterapia, continua a ser o único tratamento curativo estabelecida por CRC, mas limitada pela resistência à droga e toxicidade grave [2].

5-fluorouracilo (5-FU), um análogo de uracilo , é o fármaco quimioterapêutico mais amplamente utilizado para o tratamento de tumores sólidos, especialmente para o cancro colo-rectal [3]. Em células tumorais, o 5-FU é convertido em monofosfato fluorodesoxiuridina (FdUMP) para exercer o seu efeito citotóxico. FdUMP pode mis-incorporar no ADN ou ARN, inibe as actividades de timidilato-sintetase (TS), em última análise, provocar a apoptose de células [4]. No entanto, a taxa de resposta global com a monoterapia com 5-FU como tratamento de primeira linha para o CRC é bastante limitada (approximately10-20%) [5]. Além disso o aumento da dose iria produzir resistência à droga e os efeitos colaterais inevitáveis ​​limita assim o seu efeito terapêutico. Recentemente, combinação ou multi-componente (em vez de um único agente) terapia, em que dois ou mais tipos de fármacos são utilizados em simultâneo, é um tratamento para o cancro comprovada [6,7]. 5-FU combinada com novas drogas citotóxicas, tais como oxaliplatina, o resveratrol e irinotecano não só melhorou as taxas de resposta de 40-50%, mas também reduziu a reacção indesejável destas drogas [8-10], sugerindo que 5-FU tem um perfil de segurança favorável e podem ser adequados para o tratamento de combinação com outras drogas. Apesar destas melhorias, são urgentemente necessárias novas estratégias terapêuticas e novos quimio-sensibilizadores.

Gypenosides (Gyp), os componentes principais excertos do

Gynostemma pentaphyllum

(Thunb.) Makino, existe principalmente como dammarane glicosídeos -tipo triterpene (Fig 1A) e tem sido usado como uma medicina popular tradicional popular na Ásia durante séculos para tratar o cancro [11-13], hiperlipoproteinemia [14], hepatite [15], e doenças cardiovasculares [16]. Estudo experimental tem relatado que cigano poderia desencadear a apoptose no cancro colo-rectal humano 205 células através de via dependente de mitocôndrias e a activação de caspase-3 [17]. As nossas investigações anteriores também sugerem que Gyp inibida humana câncer colorretal SW-480 e SW-620 células proliferação e migração de uma maneira dose e tempo-dependente [18,19]. Apesar destas potências, cigano foi relativamente menos tóxicos para as células humanas normais [20], que mostram a aplicação potencial na terapia do cancro. No entanto, não há qualquer informação sobre o efeito quimio-sensibilização dos Gyp até agora. E se cigano pode tornar-se um bom quimio-sensibilizador para amplificar a eficácia da quimioterapia em clínica não é clara. No presente estudo, nós utilizamos o cancro colorectal humano SW-480, SW-620, células Caco2 e mouse modelo CT-26 xenotransplante para explorar o possível efeito quimio-sensibilização dos Gyp para potenciar o efeito anti-tumoral de 5-FU

in vitro

e

in vivo

. Para o melhor de nosso conhecimento, o presente estudo é o primeiro

in vitro

e

in vivo

investigação pré-clínica que avalia o efeito quimio-sensibilização dos Gyp eo efeito anti-tumoral de usar 5 -Fu e Gyp em combinação. Estas descobertas podem fornecer uma nova estratégia terapêutica para alcançar sinergismo anti-câncer.

(A) dammarane Chemical estrutura de esqueleto de Gypenosides. viabilidade (B) das células foi medido pelo ensaio de MTT às 48 h após o tratamento com 5-FU em células, SW-620 e Caco2 SW-480. (C-F) A viabilidade celular foi medida pelo ensaio de MTT às 24 e 48 h após o 5-FU e /ou tratamento cigano, em células SW-620 e Caco2 SW-480. índice de combinação de valor (CI) foi analisada utilizando o software CalcuSyn. CI 1 indica um efeito sinérgico. formação de (L) Colónia de células SW-480 e Caco2 cigano após o tratamento com 5-FU e /ou. Todos os dados são expressos como média ± SD de triplicados e

p

* 0,05,

p

** 0,01 versus controle;

p

## Restaurant 0,01 versus 5-FU ou Gyp só grupo.

Materiais e Métodos

produtos químicos e reagentes

Gypenosides (Gyp) foi gentilmente cedido por Ankang Pharmaceutical Instituto do Universidade de Pequim (Shaanxi, China) e dissolveu-se em 80% de etanol (EtOH) a uma concentração de armazenamento final de 100 mg /ml. 5-fluorouracilo (5-FU) foi adquirido a Sigam-Aldrich (St. Louis, MO, EUA) e dissolvido em sulfóxido de dimetilo (DMSO) também a uma concentração de armazenamento final de 100 mg /ml. GYP e solução de 5-FU foram esterilizados através de um filtro de 0,22 para utilização em experiências subsequentes e armazenado em -20 ° C.

3- (4, 5-dimetiltiazol-2-il) -2, 5-diphenyltertrazolium brometo de tetrazólio (MTT), Hoechst 33342, iodeto de propídio (PI), ARNase a, a N-acetilcisteína (NAC), e pifithrin-α foram adquiridos da Sigma-Aldrich. Goiaba nexina Reagente foi obtido a partir de Millipore Corporation (Billerica, MA, EUA). 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-DA) foi na Molecular Probes Inc. (Eugene, OR, EUA). O aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT), ureia (BUN) e creatinina sérica (Cr) kit de ensaio foram fornecidos pelo Nanjing Jiancheng Bioengenharia Institute (Nanjing, China).

As linhas celulares

o cancro colorectal humano SW-480, SW-620, células Caco2 e umbilical células endoteliais da veia humana normal HUVEC foram obtidos a partir da Cell Bank da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As células foram cultivadas em meio RPMI-1640, meio L-15 (Sigam-Aldrich) ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM, Gibco, Life Technologies, EUA) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone, EUA), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina e glutamina 1 mM. As culturas foram mantidas a 37 ° C, com humidade e 5% de CO

2.

A viabilidade celular ensaio

A viabilidade celular foi avaliada utilizando o ensaio de MTT e teste de formação de colónias. Para o ensaio de MTT, as células (1 x 10

5 células /ml) foram semeadas em placas de 96 poços (Corning Inc., Nova Iorque, EUA) durante a noite e a exposição ao 5-FU (1, 5, 10, 50, 100 , 300 ug /ml), cigano (70, 85, 100 ug /mL) ou 5-FU + cigano durante 24 e 48 h (controlo de solvente exposição a 80% de etanol e DMSO em simultâneo). Após o tratamento, a viabilidade celular foi determinada por adição de uma solução de MTT de 10 ul (5 mg /ml em PBS) a cada poço seguido por incubação durante 4 h a 37 ° C com 5% de CO

2. A mistura de MTT foi removido e 150 ul de DMSO foi adicionado a cada poço. As amostras foram agitadas num agitador para 15 min, e a absorvância a 570 nm foi registada usando um leitor de microplacas (Bio-Tek, ELX800, EUA). A viabilidade celular foi calculada como se segue:. (1-absorvância média de absorvância grupo tratado /média de grupo de controlo) × 100%

foi realizado o teste de formação de colónias para avaliar o potencial proliferativo de longo prazo de SW-480 ou células Caco2 seguinte 5-FU e /ou tratamento cigano. As células foram semeadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1000 células /poço e cultivadas durante 7-10 dias a 37 ° C com 5% de CO

2. O meio foi trocado a cada 3 dias até que colónias visíveis formadas. Em seguida, as colónias foram fixadas com paraformaldeído a 4% a 4 ° C durante 15 min e corados utilizando Giemsa durante 30 min. As amostras foram lavadas com PBS e secas à temperatura ambiente. O número de colónias coradas que continha 50 células foi contado manualmente. potencial de proliferação foi calculado da seguinte forma:. taxa de formação de colónia relativa (%) = número de colónias no tratamento em grupo /número de colônias no grupo de controle × 100%

Avaliação para o índice de combinação

após a detecção foi calculado os efeitos inibidores individuais e combinação de 5-FU e cigano, o índice de combinação (IC) de acordo com o método de Chou e Talalay [21] utilizando o programa de software CalcuSyn (Biosoft, Cambridge, Reino Unido). O valor de IC é uma medida quantitativa do grau de interacção entre fármacos. CI 1, indica sinergismo; CI = 1, denota efeitos aditivos; CI 1, indica antagonismo.

Determinação da apoptose das células

apoptose celular foi detectada utilizando um ensaio de goiaba nexina, que utiliza anexina V-PE para detectar a fosfatidilserina na membrana externa das células apoptóticas [22] . células SW-480 (2 × 10

5 células /ml) foram semeadas em placas de 24 poços e tratadas com 5-FU e /ou cigano durante 24 h, em seguida, as células foram colhidas e lavadas com PBS. Depois que 100 células L de cada amostra foi suspensa numa mistura de 100 Anexina ul V-PE e tampão de ligação 7-AAD, incubou-se a 37 ° C durante 20 min no escuro e submeteu-se citometria de fluxo (Millipore, EUA) imediatamente . Histogramas foram analisados ​​utilizando software FCS Expresso V3.

Hoechst 33342 coloração

Hoechst 33342 coloração foi utilizada para confirmar as alterações da morfologia núcleos de SW-480 células após 5-FU, Gyp ou 5- tratamento Fu + Gyp. Resumidamente, após a incubação durante 24 e 48 h, as células foram coradas com mM Hoechst 10 33342 a 37 ° C no escuro durante 15 min, em seguida, lavada três vezes com PBS e observadas utilizando um microscópio de fluorescência com filtros de excitação padrão (Nikon, Japão) .

análise do ciclo celular

SW-480 células foram semeadas em placas de exposição e de 24 poços a 5-FU, cigano ou 5-FU + cigano durante 24 e 48 h. Em seguida, as células tratadas foram recolhidos e eliminados como seguintes passos: lavadas duas vezes com PBS frio, fixadas com etanol a 70% arrefecido em gelo a -20 ° C durante a noite, lavada duas vezes com PBS frio, incubaram-se com 100 mg /ml de RNase A durante 30 min a 37 ° C, após o que coradas com 50 mg /mL de PI no escuro durante 30 min e sujeitas a análise de citometria de fluxo. Para cada experiência, as células 5000 foram registados. Os resultados obtidos foram analisados ​​pelo software celular Quest.

A avaliação dos danos do ADN

intercala no ADN PI e o tamanho dos fragmentos de DNA aparece como um histograma de ADN hipoplóides [23]. As células em placas de 24 poços foram tratadas com 5-FU, cigano ou 5-FU + cigano durante 24 e 48 h, em seguida, coradas com 5 ug /ml de PI, permeabilizadas por congelamento-arremesso e submetido a análise de citometria de fluxo. Os histogramas foram analisados ​​utilizando o software de FCS expresso V3.

ensaio Comet, uma técnica sensível e rápido para a detecção de danos no DNA em células individuais, foi realizada como previamente descrito [24].

Medição de intracelular produção de ROS

a alteração do nível de ROS intracelular foi medido utilizando a conversão oxidativa da sonda fluorescente sensível 2 ‘, 7′-diclorofluoresceína-diacetato (DCFH-dA) para fluorescente 2′, 7’-diclorofluoresceína (DCF ). DCFH-DA facilmente se difunde através da membrana da célula e é hidrolisada enzimaticamente por esterases intracelulares para formar DCFH não fluorescente, o qual é, em seguida, rapidamente oxidado para formar DCF altamente fluorescente na presença de ROS, e a intensidade de fluorescência é proporcional a produção de ROS. As células foram incubadas com 5-FU, cigano ou 5-FU + cigano durante 6 e 12 h, em seguida, coradas por 10 uM DCFH-DA, a 37 ° C no escuro durante 30 min. Após lavagem três vezes com PBS, as células foram visualizadas com um microscópio de fluorescência, imediatamente (Nikon, Japão).

NAC (5 mM) foi utilizado como um eliminador de ROS adicionado ao meio de cultura simultaneamente com 5-FU e /ou Gyp acrescentando. A apoptose a produção de ROS, e danos no ADN de células foram analisados ​​como descrito acima.

Pifithrin-α (10? M) foi utilizada como um inibidor de p53 para diminuir a expressão de p53 para o meio de cultura quando as células foram incubadas com 5 -Fu e /ou Gyp. Os danos a viabilidade celular, a produção de ROS e ADN foram analisados ​​como descrito acima.

Western blotting

transferência de Western foi realizada como previamente descrito [25]. As proteínas (60 ^ g) foram submetidas a electroforese em géis de poliacrilamida 5-13,5%, e os géis foram transferidos para membranas de nitrocelulose (Millipore, MA, EUA) que foram incubadas com anticorpos relevantes. Foram utilizados os seguintes anticorpos: fosfo-p53 (Ser15), fosfo-CDK2 (Thr160), caspase 3, caspase 9, Bcl-2, Ser139-Histona H2A.X, clivada por PARP, β-actina (Signaling Technology celular, Danvers , MA, EUA) e Ciclina e (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). A expressão β-actina foi utilizada como intervalo de referência. A taxa de expressão da proteína foi quantificada por Quantidade Um software.

modelo de tumor xenoenxerto

O câncer colorretal células de murino CT-26 foi obtido a partir do celular Resource Center, Instituto de Ciência Básica Medical (Beijing, China), ea condição da cultura foi mesmo com células SW-480. Os ratinhos BALB /c (fêmeas, 18-20 g de peso corporal) foram fornecidos pelo Centro Experimental animal da Quarta Universidade Médica Militar (Xi’an, China). Eles foram alojados em um quarto com ar condicionado a 23 ± 2 ° C, com livre acesso a comida e água e foram mantidos em um ciclo claro-escuro de 12 h. Depois de ser alimentados em nossas instalações por 1 semana, esperar três ratos foram utilizados como controle normal, todos os outros foram inoculados com 0,1 ml de células CT-26 (1 × 10

7 células /ml) na região oxter esquerda e aleatoriamente divididos em 6 grupos com 6-8 animais em cada grupo. O tratamento iniciado no dia seguinte ao TC-26 de células de implante (1 dia). O grupo I foi dada água de osmose reversa através de lavagem gástrica diária e soro fisiológico normal via intraperitoneal injetada a cada dois dias como o grupo controle; O grupo II foi injectado com 5 mg /kg de 5-FU por via intraperitoneal a cada dois dias; Grupo III recebeu 25 mg /kg através de lavagem gástrica cigano todos os dias; Grupo IV foi dado 50 mg /kg Gyp via lavagem gástrica todos os dias; Grupo V foi dado 5 mg /mL de 5-FU + 25 mg /ml de cigano e Grupo VI foi dado 5 mg /kg de 5-FU + 50 mg /kg de cigano. As longas (a) e (b) curtos diâmetros dos tumores foram medidos utilizando compassos de calibre de corrediça todos os dias depois do dia 6 para o volume do tumor calculado como a fórmula: AB

2/2. O peso corporal foi também medida.

Os ratos foram observados diariamente quanto a sinais clínicos e sacrificados no dia dezenove. espécimes de tumores foram pesados ​​e fixadas com formalina a 10% durante pelo menos 24 h, embutidos com parafina, em seguida, coradas por coloração com hematoxilina-eosina e imuno-histoquímica. A taxa de inibição foi calculada como se segue: (1- média de peso do tumor do grupo tratado peso /médio do tumor do grupo de controlo) x 100%. Enquanto isso, baço foram retirados e pesados ​​para calcular os índices de baço da seguinte forma: baço peso /peso corporal × 100%. Os níveis de AST, ALT, BUN e Cr no soro também foram detectados.

Experimentos com ratos foram realizados de acordo com o Instituto Nacional do Guia de Saúde para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório e foram aprovados pela Comitê de Cuidado e Uso Institucional animal da Universidade de Shaanxi normal University (Xi’an, China).

imunohistoquímica ensaio

a imuno-histoquímica foi realizada em 7 mm secções de espécimes embebidos em parafina usando monoclonal anti-PCNA anticorpo (Abcam, Cambridge, Reino Unido). Resumidamente, após desparafinização e hidratação, as secções foram tratadas com recuperação de antigénio mediada por calor utilizando 10 mM de tampão de citrato (pH 6,0) durante 15 min e permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 durante 15 min. Em seguida, a actividade de peroxidase endógena foi extinta por solução de peróxido de hidrogénio a 3% durante 10 min. A ligação não específica foi prevenida por incubação com soro de cabra normal a 5% durante 15 min. Depois disso, as secções foram incubadas com anticorpo anti-PCNA (1: 8000 diluições) durante a noite a 4 ° C numa câmara húmida. A ligação do anticorpo foi detectada utilizando um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano a 37 ° C durante 30 min. Em seguida, as seções foram visualizados por solução de diaminobenzidina, contrastadas levemente com hematoxilina, desidratadas com etanol e observada usando microscopia de luz (Nikon, Japão).

A análise estatística

SPSS 16.0 (SPSS Inc., Chicago ) foi usado para análise estatística. Os valores são expressos como média ± desvio padrão (DP) de três amostras obtidas a partir de três experiências independentes. As comparações estatísticas foram feitas utilizando-se análise de variância (ANOVA),

p

* 0,05 foi considerado como diferença significativa,

P

** 0,01 e

p

## Restaurant 0,01 foram considerados diferença extremamente significativo.

Resultados

cigano sinergicamente potencia a inibição de viabilidade celular induzida por 5-FU

Figura 1B mostra a citotoxicidade de 5-FU em SW -480, células SW-620 e Caco2 para o tratamento de 48 h, respectivamente. células Caco2 realizada mais sensível do que o SW-480 e células SW-620 a 5-FU tratamento (o valor de IC50 foi calculado como 31.75 ug /ml para Caco2 e 257,23, 366.40 ug /ml para o SW-480, células SW-620). Quando a concentração exceder 50 mg /ml, SW-480 e apresentação de células SW-620 um pouco a resistência ao tratamento com 5-FU. No entanto, cigano inibida, SW-620 e Caco2 proliferação de células SW-480 de uma maneira dose e dependente do tempo (o valor de IC50 foi calculada como 99,59, 107,53 e 112,22 pg /mL, para as células SW-620 e Caco2 SW-480 após incubação durante 24 h, a Fig 1C-1E). Quando as células co-tratadas com cigano (70, 85, 100 ug /ml) e 5-FU (5, 10 ug /ml) ao mesmo tempo, o tratamento combinado, mesmo nas doses baixas exibida actividades muito mais elevadas de anti-proliferativa em SW-480 , células SW-620 e Caco2 do que o de um tratamento único. Por exemplo, o tratamento de células SW-480 com 5 ug /mL de 5-FU ou 70 ug /ml de cigano sozinho durante 24 h inibiu a viabilidade celular de 14,6 ± 2,67% (

P

˂ 0,05

vs

controle) e 13,8 ± 2,80% (

p

˂ 0,05

vs

controle), respectivamente. No entanto, o tratamento de células SW-480 com 5 ug /mL de 5-FU + 70 ug /ml durante 24 h cigano viabilidade celular inibida por significativa 53,29 ± 1,02% (

P

˂ 0,01

vs

controle e 5-FU sozinho). Quando o tempo de incubação foi aumentado de 48 h, a inibição da viabilidade celular de 5 ug /mL de 5-FU foi 32,37 ± 3,22% (

P

˂ 0,01

vs controlo), 70 ug /ml cigano foi 24,87 ± 1,83% (

P

˂ 0,01

vs controlo), 5 ug /mL de 5-FU + 70 ug /ml foi cigano 72,11 ± 1,53% (

P

˂ 0,01

vs controle e 5-FU sozinho)

.

Para validar ainda mais o recurso sinérgica de 5-FU e Gyp, os efeitos de inibição de viabilidade celular do tratamento único e combinado foram analisados ​​usando o software CalcuSyn. O valor CI para 5-FU + tratamento Gyp SW-480 células foi de 0,68 ± 0,05, células SW-620 foi de 0,65 ± 0,10 e células Caco2 foi de 0,72 ± 0,07 sob as doses aplicadas (Fig 1C-1E). Para SW-480 células, a combinação de 5-FU (5 ug /ml) e cigano (70 ug /ml) mostrou a melhor capacidade de inibição sinérgica (os valores de Cl foram de 0,63 e 0,68 para 24 e 48 h), o qual foi seleccionado para estudos mecanicistas. Além disso, o 5-FU e cigano em combinação exibiram toxicidade muito mais fraco para células endoteliais da veia umbilical humana normal HUVEC (Figura 1F).

teste de formação de colónias foi realizada para verificar ainda mais o potencial proliferativo de células SW-480 e Caco2 após o tratamento cigano 5-FU e /ou. Figura 1G mostraram que 5-FU, cigano, 5-FU + cigano todos inibem potencial proliferativo de longo prazo de células Caco2 SW-480 ou, em comparação com o grupo não tratado (

P

0,01 vs controlo), e o mais significativo com menos formação dois pontos foram observados em 5-FU grupo + Gyp (

p Art 0,01 vs 5-FU ou Gyp sozinho).

resposta apoptótica desencadeada por 5- Fu e /ou Gyp

Como mostrado na Figura 2A, no controle sem tratamento, 93,35 ± 0,84% eram viáveis, 0,2 ± população de células 0,06% estavam na fase inicial da apoptose (inferior direito) e 2,75 ± 1,32% população de células estavam em fase tardia da apoptose (canto superior direito). Em 5-Fu grupo de tratamento, a população celular por apoptose (inferior direito certo e superior) foram 3,65 ± 0,81%. No grupo de tratamento Gyp, 20,6 ± 1,63% de células estavam em fase de apoptose (

p Art 0,01

vs

controle). Enquanto no grupo + Gyp 5-Fu, 42,15 ± 0,67% das células estavam em fase de apoptose (

p Art 0,01

vs controle

e 5-FU sozinho).

(a) de células foi detectada por Anexina V-PE /7-AAD ensaio após o tratamento cigano durante 24 h em células SW-480 5-FU e /ou. (B) O nível de expressão da caspase 3, caspase 9, Bcl-2 e clivado-PARP em células SW-480 foi detectada por transferência Western. (C) a condensação e celular mudança morfologia Nuclear na SW-480 células após 5-FU co-tratados com Gyp foi observada usando Hoechst 33342 coloração. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado por ponto experimental e resultados representativos foram mostrados. Todos os dados são expressos como média ± SD de triplicados e

p

* 0,05,

p

** 0,01 versus controle.

Western blot foi realizada para análise do potencial mecanismo trabalhou em 5-FU e Gyp desencadeada apoptose. Como mostrado na Fig 2B, 5-FU + cigano grandemente aumentada da caspase 3, caspase 9 e PARP clivagem e regulados negativamente a expressão de proteína anti-apoptótica de Bcl-2 em células SW-480 (

P

0,01 ou

p Art 0,05

vs

controle)

As alterações morfológicas induzidas por 5-FU e Gyp no SW-480 células

Figura 2C. mostra as alterações morfológicas após tratamento cigano 5-FU e /ou utilizando coloração Hoechst 33342. Ligeiramente células azuis e homogéneas foram observados no grupo controle; 5-Fu células ou Gyp tratados apresentaram ligeiro aumento da Hoechst 33342 coloração; enquanto no grupo 5-FU + Gyp, as células exercida notavelmente alterações: cromatina condensada, pontuar fragmentada fluorescência nuclear azul. Além disso, as imagens de fase revelou que as células em 5-FU + grupo de tratamento foram cigano encolhida para tipo redondo anormal, e os números de células foram também reduzidas nitidamente.

Efeitos de 5-FU e /ou cigano na célula a distribuição do ciclo

a citometria de fluxo analisar na Fig 3A indicam que, comparado com o controlo (G0 /G1-fase, 33,8 ± 1,06%; a fase S, 28,25 ± 0,59%, e G2 /M-fase, 37,94 ± 0,65 %), houve uma acumulação de população de células em G0 /G1-fase (51,56 ± 1,08%,

P

0,01

vs controlo) e da fase-S (36,6 ± 0,91% ,

p

˂ 0,05

vs

controle) após o tratamento com 5-FU. Gyp induziu um acúmulo de população de células em G0 /G1 fase (45,97 ± 1,06%,

p Art 0,01

vs

controle). No grupo de tratamento + Gyp 5-Fu, havia mais células na /G1 fase G0 (56,58 ± 0,57%,

p Art 0,01

vs

controle) e S-phase (38,78 ± 0,46%,

p Art 0,05

vs

controle). Uma tendência semelhante também foi encontrado após 5-FU, Gyp ou 5-FU + tratamento Gyp por 48 h.

(A) a distribuição do ciclo celular após 5-FU e tratamento Gyp. (B) A expressão de fosfo-p53, fosfo-cdk2 e ciclina E, após 5-FU e /ou tratamento cigano em SW-480 células foram detectados por Western blotting. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado por ponto experimental e resultados representativos foram mostrados. Todos os dados são expressos como média ± SD de triplicados e

p

* 0,05,

p

** 0,01 versus controlo.

A expressão de fosfo-p53, fosfo-cdk2 e ciclina E em células SW-480 após tratamento cigano 5-FU e /ou foram detectados por Western blotting. Como mostrado na Fig 3B, 5-FU + cigano notavelmente aumentou a expressão de fosfo-p53, mas diminuiu a expressão de ciclina E e fosfo-CDK2 (

P

0,01 ou

P

0,05

vs

controle) após 24 e 48 h de incubação

resposta a danos no DNA induzidos por 5-Fu, Gyp e 5-FU + Gyp

Conforme descrito na. os métodos, citometria de fluxo foi realizada para investigar a eficácia do tratamento com 5-FU + cigano na fragmentação de DNA em células SW-480. Figura 4A mostra que o grau de fragmentação do ADN no grupo de controlo foi de 4,66 ± 1,55%. Depois de ter sido tratada por 5-FU, cigano ou 5-FU + cigano durante 24 h, havia uma tendência crescente (8,2 ± 0,48%, de 15,4 ± 2,74%, e 45,15 ± 1,63%, respectivamente) sobre os níveis de fragmentação de DNA. O grau de fragmentação do DNA em 5-FU grupo tratado + Gyp foi significativo aumento (

p Art 0,01

vs controle e 5-FU sozinho

). Um fenômeno similar foi encontrado após 48 h de incubação e da fragmentação do DNA foi aumentada para 64,65 ± 3,62% (

p Art 0,01

vs controle

e 5-FU sozinho) após 5-FU + GYP tratamento quando a fragmentação do ADN no controle, 5-FU, e só grupo GYP foram de 4,2 ± 0,81%, 20,85% ± 2,70 e 24,80 ± 1,96%, respectivamente.

(a) a fragmentação do ADN foi detectada utilizando fluxo citometria após 5-FU, cigano e 5-FU + cigano tratamento em SW-480 células após 24 e 48 h. Os histogramas mostram o número de canais de células (eixo vertical) versus fluorescência de PI (eixo horizontal). (B) ensaio do cometa foi realizada para a detecção de danos no DNA após 5-FU co-tratados com cigano. (C) O nível de expressão de Ser139-Histona H2A.X foi determinada utilizando Western blotting. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado por ponto experimental e resultados representativos foram mostrados. Todos os dados são expressos como média ± SD de triplicados e

p

* 0,05,

p

** 0,01 versus controle;

p

## Restaurant 0,01 versus 5-FU ou Gyp só grupo.

Ensaio Cometa ea expressão de γH2A.X foram realizados para comprovar que o dano ao DNA foi agravada por 5-Fu combinado com Gyp. Figura 4B mostra que o 5-FU, cigano e 5-FU + cigano todos induzida diferentes graus de dano de ADN, em comparação com o grupo de controlo não tratado, e o mais significativo com mais células produziram uma grande cauda do cometa foi observada em 5-FU + grupo Gyp. Fig 4C mostra que o 5-Fu combinado com Gyp agravou a fosforilação de γH2A.X.

ROS acúmulo após 5-FU tratamento + Gyp

intracelular ROS foi detectada por coloração DCFH-DA às 6 e 12 h após diferentes tratamentos. Como mostra a fig 5A ilustra, em comparação com células de controlo em 5-FU + grupo cigano mostraram forte fluorescência de DCF no 6 e 12 h após o tratamento, de células no grupo cigano mostrou alguma fluorescência de DCF visível às 6 h e ligeiramente aumentada em 12 h, enquanto que nenhuma óbvia fluorescência foi observada no grupo 5-FU sozinho. Para validar melhor o papel de ROS no efeito anti-tumor do 5-FU + cigano, NAC foi adicionado para diminuir o nível de ROS, em seguida, foram analisados ​​danos no ADN e apoptose celular. Os resultados mostraram que a NAC co-tratamento eficaz suprimiram a produção de ROS intracelular com o DCF fluorescência desapareceu (Fig 5B). O dano ao DNA causado pelo tratamento com 5-FU + Gyp foi parcialmente resgatado pelo NAC (

p Art 0,01

vs

controle, Fig 5C). 5-FU + Gyp causou apoptose celular foi também significativamente impedido pelo NAC (

p Art 0,01

vs

controle, Fig 5D).

(A) produção intracelular ROS após o tratamento cigano 5-FU e /ou foi detectada utilizando a coloração de DCFH-DA. (B-D) produção intracelular de ROS, fragmentação de ADN e apoptose celular em células SW-480 foram medidos depois adicionou NAC ao meio de cultura simultaneamente com 5-FU e cigano. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado por ponto experimental e resultados representativos foram mostrados. Todos os dados são expressos como média ± SD de triplicados e

p

** 0,01 versus controle;

p

## Restaurant 0,01 versus 5-FU + Gyp grupo.

Papel do p53 em 5-FU tratamento + Gyp

A produção excessiva de ROS podem danificar o DNA e provocam a atividade p53 para induzir ciclo celular prisão e a apoptose [26,27]. Nossos resultados encontrados fosforilação p53 foi significativamente aumentada após 5-FU tratamento + Gyp (Fig 3B). Para investigar ainda mais o papel da p53 em 5-FU co-tratados com apoptose induzida por cigano, pifithrin-α, um inibidor de p53, foi adicionado para diminuir a expressão de p53, e, em seguida, intracelular nível ROS, danos no ADN e viabilidade celular foram detectou. A Fig 6A sugere que pifithrin-α notavelmente reverteu a morte celular induzida por cigano 5-FU + em células SW-480 com a viabilidade das células foi aumentado de 47,49 ± 2,1% para 79,22 ± 0,63% (

P

0,01

vs

controle). No entanto, o co-tratamento com pifithrin-α não influenciam a acumulação intracelular de ROS e danos no ADN grave causada por 5-FU + cigano tratamento (Figura 6B e 6C).

(A) a viabilidade celular, (B) produção intracelular de ROS e (C) de dano de ADN foram detectados depois adicionou-pifithrin α ao meio de cultura simultaneamente com 5-FU mais cigano. Experimentos foram realizados de forma independente em triplicado por ponto experimental e resultados representativos foram mostrados. Todos os dados são expressos como média ± SD de triplicados e

p

** 0,01 versus controle;