Abstract

Purpose

A terapia de radiação para câncer de bexiga invasivo permite para preservação de órgãos, mas a toxicidade e controle local continua a ser problemático. Como tal, a melhoria da eficácia do tratamento requer a radiossensibilização de células tumorais. O objetivo do estudo é investigar se o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR), uma quinase a jusante da fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /via de sobrevivência AKT, pode ser um alvo para sensibilização à radiação.

Projeto Experimental

ensaios clonogénicos foram realizados utilizando linhas celulares de cancro da bexiga 6 (UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6, KU7, 253J-BV e 253-JP), a fim de examinar os efeitos das radiações ionizantes ( IV) sozinho e em combinação com RAD001, um inibidor de mTOR. análise do ciclo celular foi efectuada utilizando citometria de fluxo.

In vivo

, ratos atímicos foram injectados por via subcutânea com linhas celulares de cancro da bexiga 2. A resposta ao tratamento com RAD001 (1,5 mg /kg, diariamente), IR fraccionado (total de 9 Gy = 3Gy × 3), e combinação de RAD001 e IR foi seguido ao longo de 4 semanas. O peso do tumor foi medido no final do estudo experimental.

Resultados

ensaios clonogénicos revelou que em todas as linhas de células da bexiga testadas, foi observado um efeito aditivo no tratamento combinado, quando comparado com qualquer tratamento sozinho. Os nossos dados indicam que este efeito é devido a paragem em ambas as fases G1 e G2 do ciclo celular quando os tratamentos são combinados. Além disso, nossos dados mostram que essa prisão é regulamentada principalmente por mudanças nos níveis de ciclina D1, p27 e p21 seguintes tratamentos.

In vivo

, uma diminuição significativa no peso do tumor foi observada no tratamento combinado em comparação com somente um ou outro tratamento ou controle.

Conclusões

A alteração do ciclo celular, inibindo a sinalização mTOR via em combinação com radiação têm resultados favoráveis ​​e é uma modalidade terapêutica promissora para o câncer de bexiga

Citation:. Nassim R, Mansure JJ, Chevalier S, Cury F, Kassouf W (2013) Combinando mTOR Inibição com radiação Melhora antitumoral atividade em células de câncer de bexiga

In Vitro

e

In Vivo

: uma nova estratégia para o tratamento. PLoS ONE 8 (6): e65257. doi: 10.1371 /journal.pone.0065257

editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América

Recebido: 24 de fevereiro, 2013; Aceito: 24 de abril de 2013; Publicação: 17 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Nassim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este projecto está sendo financiada por um subsídio do Instituto canadense de pesquisa em Saúde (CIHR) MOP concessão 89796. Dr. W. Kassouf é um destinatário de um prêmio clínica pesquisadora do Fonds de recherche du Québec-Santé (FRSQ). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. O RAD001 inibidor de mTOR foi gentilmente cedido pelo seu fabricante, a Novartis. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O câncer de bexiga é uma doença muito prevalente em América do Norte. Em 2012, 55.000 homens e 18.000 mulheres foram diagnosticadas com câncer de bexiga; 1 em cada 5 homens e 1 em cada 4 mulheres morrerão de sua doença [1]. . A cistectomia radical que consiste em a remoção completa da bexiga, continua a ser o tratamento “padrão de ouro” para cancro invasivo da bexiga [2]. A radioterapia é uma alternativa atraente, uma vez que preserva a bexiga e permite funções urinárias e sexuais normais [3]. No entanto, a falta de controlo local da doença, bem como a toxicidade significativa que está associada com a terapia de radiação continua a ser problemática [4] – [6]. Para melhorar a eficácia, vários ensaios clínicos de gestão de preservação de órgãos foram realizados para testar os efeitos da radiação e quimioterapia combinada de [7], [8]. No entanto, apesar de inúmeros esforços, estudos chemoradiation permanecer associado com o controle local abaixo do ideal da doença e diminuir a sobrevivência, em comparação com a cirurgia radical. Como tal, há uma necessidade imperiosa de aumentar radiossensibilização de cancro da bexiga para aumentar a eficácia, melhorando o controle local da doença e permitindo a redução da dose para diminuir a toxicidade da terapia de radiação.

Uma molécula de sinalização que é extremamente atraente e tem recentemente, chamou muita atenção por terapia-alvo é o alvo da rapamicina em mamíferos (mTOR). Mais especificamente, a mTOR é uma proteína quinase serina /treonina a jusante do fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K) /AKT que desempenha um papel crítico na oncogénese [9], [10]. A desregulação da via PI3K /Akt /mTOR gera um ambiente favorável oncogénica e tem sido documentada em uma variedade de tumores humanos incluindo cancro da bexiga [11]. inibição de mTOR tornou-se uma área ativa de pesquisa para desenvolver e testar pequenas moléculas inibidoras tais como rapamicina análogos -notably RAD001 (everolimus Novartis) e CCI-779 (Torisol, Wyeth) para tratar diversas doenças, incluindo câncer. Recentemente, o primeiro ensaio clínico de Fase III de sucesso envolvendo um inibidor de mTOR foi realizado em pacientes com carcinoma de células renais avançado, que experimentaram uma melhoria na sobrevida global [12]. Recentemente, publicou o primeiro relatório demonstrando significativa actividade antitumoral

via

inibir mTOR com RAD001 em modelos de câncer de bexiga

in vitro

e

in vivo

[13]. Curiosamente, as diferenças notáveis ​​na sensibilidade à inibição do mTOR foram observadas entre as nove linhas celulares de cancro da bexiga humana. Além disso, não houve correlação entre os níveis activados AKT e mTOR com características agressivas celulares. No entanto, isto não foi o caso para S6 activados cujos níveis aparentemente mais elevada no RAD001 sensíveis em comparação com linhas celulares relativamente resistentes. De interesse, alguns estudos têm relatado que a inibição do mTOR pode sensibilizar tumores de próstata, mama e cérebro à radiação [14] ionizante – [16]. Uma vez que a radiação foi mostrado para activar a via de PI3K /Akt sobrevivência /crescimento que pode ser responsável pela morte celular e a fuga radiorresistência [17], [18], a inibição de mTOR concomitante pode potencialmente superar a resistência à radiação de cancro da bexiga. Para dar seguimento a esta hipótese, o presente estudo examinou os efeitos da combinação de RAD001 e radiação ionizante,

in vitro

e

in vivo

, na sobrevivência e crescimento das células em uma matriz de células de câncer de bexiga linhas. Além disso, buscou-se lançar luz sobre o mecanismo pelo qual esta combinação de tratamentos pode inibir o crescimento tumoral.

Materiais e Métodos

Ética Declaração

Todos os padrões éticos associados com o uso de nosso modelo animal xenoenxerto foram integralmente seguidos e respeitados. Comitê Animal Care Facility O McGill do Centro de Saúde da Universidade aprovou os nossos protocolos de origem animal (protocolo nº 5428) antes do início do estudo. Além disso, os animais foram mantidos e mantidos em instalações state-of-the-art que seguem os procedimentos rigorosos para a realização de pesquisas com animais, que inclui monitoramento constante e inspeção dos animais e os usuários.

cultura celular

o UM-UC3, UM-UC5, UM-UC6 e KU7 linhas celulares foram caracterizadas e fornecido pelo Specimen núcleo do geniturinário Programas especializados de Investigação de Excelência no cancro da bexiga no MD Anderson cancer Center [19]. O 253-JP e 253J-BV foram gentilmente cedidas pelo Dr. Colin P.N. Dinney da M.D. Anderson Cancer Center, Houston, Texas [20]. As linhas celulares foram rotineiramente cultivadas a 37 ° C num CO 5%

2 incubadora, mantidas em meio essencial mínimo de Eagle (EMEM) contendo soro de bovino fetal a 10% (FBS) (Wisent, Saint-Jean-Batista QC) e passadas ao atingir 80% de confluência. O inibidor de mTOR RAD001 foi gentilmente fornecida pelo fabricante, a empresa Novartis.

clonogénicas ensaio

As células foram semeadas numa placa de 6 poços a uma densidade de 200 células por poço e mantidas em meio de crescimento . Uma vez ligados, eles foram tratados com RAD001 em doses equivalentes para o GI50 para cada linha celular, como descrito anteriormente [13]: UM-UC3 (75 nM), KU7 (50 nM), 253J-BV (8 nM), 253- JP (8 nM), uM-UC5 (0,5 nM) e uM-UC6 (0,5 nM) e mantidos a 37 ° C em 5% de CO

2 incubadora durante 12 horas. Isto foi seguido por tratamento com radiação em diferentes dosagens, com e sem RAD001. Os controlos incluiram células não tratadas, juntamente com as células tratadas com cada uma de radiação e tratamento RAD001 sozinho. As células foram ainda cultivadas a 37 ° C e deixa-se formar colónias durante 10-14 dias. foi escolhido um corte aproximado de 50 células viáveis ​​/colônia. As células foram lavadas com solução salina equilibrada com fosfato (PBS) e fixadas durante 15 min, utilizando formaldeído a 3,7% em PBS. Após uma segunda lavagem com PBS, as células foram coradas com violeta de cristal (0,4% w /v em PBS; Fisher Scientific, Waltham, MA) e deixou-se secar ao ar antes da contagem de colónias. Cada tratamento consistiu em poços duplicados de uma placa de 6 poços e o ensaio foi realizado duas vezes. A fracção de sobreviventes foi calculada como (a contagem média de colónias no final da experiência) /(células inoculadas no início) x (plaqueamento eficiência). A eficiência do plaqueamento foi definido como (média de contagem de colónias) /(células banhado no controle não irradiado). As células não irradiadas foram usadas como controlo.

A citometria de fluxo

As células foram semeadas em placas de cultura e deixadas a ligar. RAD001 foi adicionado às amostras apropriadas de 12 horas antes da irradiação, a uma dose equivalente ao GI 50 de cada linha de células. Isto foi seguido por uma dose de 4Gy de radiação ionizante (com base em experiências de sensibilidade previamente determinados) e as células foram ainda cultivadas durante 48 horas. As células foram então tripsinizadas, lavadas uma vez com PBS e fixadas com etanol frio a 100% durante 60 minutos a 4 ° C. Após centrifugação, os sedimentos celulares foram ressuspensos em uma solução de iodeto de propídio (PI) (50 g /ml, Invitrogen, Carlsbad, CA) em PBS, suplementado com ARNase (100 g /ml; Invitrogen, Carlsbad, CA), em seguida, transferido para fluorescência (FACS) e os tubos incubados no escuro durante 30 min a 40 ° C para permitir a entrada de iodeto de propídio no núcleo da célula -activated. ingestão de PI foi, em seguida, avaliada utilizando um Citómetro de Fluxo Coulter (BD Biosciences, Franklin, NJ).

Western blot

As células foram cultivadas e tratadas de acordo com o regime descrito acima (RAD001, radiação ionizante, e uma combinação de ambos), com as células não tratadas que serve como controlo. Após os tratamentos, as células foram raspadas em gelo e re-suspenso durante 30 minutos a 4 ° C em tampão RIPA frio (lise), contendo um cocktail de inibidores de fosfatase e protease (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN). As suspensões de células foram, então, centrifugadas para recolher lisados ​​claras no sobrenadante. A concentração de proteína foi medida pelo ensaio do ácido bicinconínico (BCA) (Pierce Científico-Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL). As amostras de proteína (40 ug-60 ug) foram submetidas a electroforese em gel de poliacrilamida, como previamente descrito [13]. As proteínas em géis foram transferidos para membranas, bloquearam-se com um 5% de leite não gordo e /ou uma solução de albumina de soro bovino a 5%, e de imuno-a hibridar com os seguintes anticorpos primários monoclonais (todos de coelho): fosfo-AKT, AKT total, a fosfo S6, S6 total de, p21, p27kip1, e ciclina D1 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA) nas concentrações recomendadas pelo fabricante. As membranas foram depois incubadas com os anticorpos secundários anti-coelho adequados e um sistema de detecção de quimioluminescência ECL (Amersham-GE Healthcare, Piscataway, NJ) foi usado para revelar bandas de proteína de interesse sobre uma película de raios-X. Os filmes foram digitalizados e os níveis de proteína foram normalizados contra actina (Cell Signaling Technology, Beverly, MA), uma proteína kDa limpeza de controle 42 presentes em todas as amostras e serviu como o nosso controlo de carregamento.

No modelo vivo-Xenoenxerto

Todas as aprovações de protocolo foram obtidos antes do início do estudo da Comissão de Cuidados animal do Centro de Saúde da Universidade McGill. ratinhos atímicos fêmea (estirpe nu /nu, 4-6 semanas de idade; Charles River Laboratories, Wilmington, MA) foram usados ​​para o nosso modelo de xenoenxerto de cancro da bexiga, conforme relatado anteriormente [13]. Resumidamente, os ratinhos foram injectados subcutaneamente com KU7 (10

6 células por injecção). Outra experiência com a mesma metodologia foi realizada utilizando as linhas celulares de cancro da bexiga 253J-BV. Para facilitar a adesão, as células foram suspensas em 200 ul de Matrigel (BD Biosciences, Franklin, NJ) antes da injecção. Os tumores foram deixados crescer e implantar durante uma semana antes da aleatorização em 4 grupos correspondentes para os diferentes grupos de tratamento, com cada grupo consistindo de 14 ratos. O grupo 1

r foi tratado com um placebo (solução de glucose a 5% em água). A

ND grupo 2 recebeu oralmente RAD001 (microemulsão diluída em solução de glucose a 5%) a uma dose de 1,5 mg /kg por dia. No 3

grupo Rd, os tumores foram expostos a uma radiação ionizante numa dosagem fraccionado num total de 9 Gy (3 × 3Gy) a cada segundo dia durante a primeira semana de tratamento. No 4

th grupo, os ratinhos receberam a dosagem RAD001 em um dia acima mencionado antes do início do tratamento de radiação de tumores. Os ratinhos foram seguidos durante 4 semanas a partir do início dos tratamentos. O peso corporal e comportamento dos animais foram monitorados durante todo o experimento. Os tumores foram medidos (comprimento e largura) duas vezes por semana usando um calibrador de Vernier, a fim de calcular o volume (V = [(comprimento x largura

2) x (π /6)] como relatado anteriormente [13]. Os ratinhos foram sacrificados num CO

2 câmara no final do tratamento. os tumores foram colhidos, pesados ​​imediatamente, e conservada fixo ou congelado para estudos futuros.

a imuno-histoquímica

secções dos tumores foram obtidos a partir de ratinhos tratados com placebo, radiação, RAD001 e o regime de combinação. as secções embebidas em parafina de tumores foram montadas em lâminas de vidro para coloração. Seguindo de-parafinização e hidratação, a recuperação de antigénio foi realizado no aquecimento das amostras com uma solução tampão de citrato 5% (pH 7,0). as secções foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo específico para p21 (diluição 1:25). foi adicionado HRP conjugado com anticorpo policlonal de cabra anti-coelho, o anticorpo secundário IgG e incubadas à temperatura ambiente durante 1 hora. 3,3′-diaminobenzidina ( DAB) substrato (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) foi utilizado para o desenvolvimento de cor de acordo com as instruções do fabricante. As lâminas foram vistas sob um microscópio invertido Leica Diaplan equipado com uma câmera Leica DFC300FX (Leica, Wetzlar, Alemanha). Imagens foram capturadas usando uma suíte Leica Aplicação. A análise foi baseada na média de 5 focos, em ampliação de 40 ×, mostrando células viáveis, e um H-score computadorizada foi calculada pela soma dos produtos das células coradas percentuais em uma intensidade de coloração dado (0-100) e a intensidade da coloração (0 para coloração negativa, 1 para baixo e 2 em alta coloração).

T-teste de análise estatística

Student (não emparelhado, bicaudal) foi utilizado em todas as análises estatísticas. Significância foi estabelecido em p . 0,05

Resultados

A sensibilidade relativa de um painel de linhas celulares de cancro da bexiga para RAD001 e radiação ionizante

Recentemente, demonstrou que um painel de nove linhas celulares de cancro da bexiga apresenta diferenças relativas de sua sensibilidade RAD001 e, consequentemente, o tratamento RAD001 resultou em diferenças relativas de inibição de mTOR e parada de crescimento, conforme verificado por ensaios MTT. Com estes dados, que foram capazes de se dividir nossas linhas de células em 3 grupos com base na sua sensibilidade RAD001 [13] como segue: relativamente resistentes (UM-UC3, UM-UC13, KU7 (GI50≥50 nmol /L)), moderadamente sensível (253J-P, 253J-BV, RT4 (GI50 50 nmol /L)). e, finalmente, altamente sensível (UM-UC1, UM-UC5, UM-UC6 (GI50≤0.5 nmol /L) neste estudo olhando para o efeitos de tratamentos combinados (RAD001 e radioterapia), ensaios clonogénicos foi utilizado para classificar as seis linhas celulares testadas de acordo com as suas sensibilidades relativas à RI a várias doses de radiação (Fig. 1A). com base nestes sensibilidades relativas à radiação, as linhas celulares eram divididos em três grupos, resistentes, moderadamente resistentes e sensíveis. o grupo resistente inclui uM-UC5 com a fracção mais elevada de sobreviver, a moderadamente resistente incluída uM-UC13, KU7, uM-UC3, uM-UC6 enquanto 253J-BV teve um menor fracção sobrevivente e, portanto, foi definida como uma linha de células sensível à radiação. comparou-se a resposta destas seis linhas celulares para cada uma das RAD001 e radiação ionizante. Com base nos dados da Figura 1B e Tabela 1, conclui-se que não existe uma correlação entre a sensibilidade à RAD001 e a sensibilidade à radiação ionizante.

células plaqueadas foram expostas à radiação ionizante para medir os efeitos sobre o crescimento pela ensaio clonogénico, como descrito em Métodos. (A) Com base nos resultados recolhidos, fomos capazes de classificar essas linhas celulares como, moderadamente sensível e -relatively resistentes sensíveis à radiação. (B) O RAD001 IC50 foi plotada contra a inclinação da curva para cada linha de células no ensaio clonogênica quando tratados com IR.

Radiação ionizante ativa AKT enquanto RAD001 inibe S6 fosforilação

tem sido relatado que a radiação ionizante activa AKT na fracção sobrevivente de células [17], [21]. Como isso pode ser associado com resistência ao tratamento, escape morte celular e sobrevivência, procurou-se determinar se a exposição à radiação de células de câncer de bexiga levaria a activação AKT. Para este fim, uma linha celular relativamente resistente, KU7, foi exposto a radiação ionizante ao longo do tempo (0 a 60 minutos) e lisaram-se para analisar pAKT por transferência de Western directa utilizando anticorpos fosfo-AKT específica dirigidos contra o local de fosforilação S473. Os resultados na Figura mostra 2A que, de fato AKT foi rapidamente ativadas seguinte 15 min de tratamento de radiação e esta ativação persistiram aos 30 e 60 min. Estes resultados sugerem, assim, que KU7 submetidos a uma activação da via de sobrevivência pro-oncogénica após a exposição à radiação ionizante. Em todas as experiências, os níveis de pAkt aumentada após o tratamento com radiação ionizante a um máximo e diminuiu depois. Do mesmo modo, como células KU7 também são relativamente resistentes RAD001, eles foram tratados com RAD001 para verificar que o seu alvo mTOR foi inibida. Para este efeito, os níveis de S6 fosforilada foram determinados utilizando um anticorpo específico para os resíduos serina-240/244 na proteína S6. Como esperado, RAD001 foi potente na diminuição dos níveis de fosforilação da molécula de sinalização a jusante de mTOR e alvo S6, conforme mostrado em 30 minutos pós-tratamento (Fig. 2B) e esta inibição é sustentada às 24 h pós-tratamento (dados não mostrados). Além disso, foram obtidos resultados semelhantes com outras linhas celulares de cancro da bexiga (253J-BV, UM-UC3, e UM-UC6) tratados com radiação e RAD001 (dados não mostrados).

células KU7 (A) foram tratados com 4 Gy de radiação ionizante. As células foram lisadas 15, 30 e 60 minutos após o tratamento para analisar activação AKT (p-AKT; linha superior) por transferência de Western. Os níveis totais de AKT são mostrados na fila inferior. células (B) KU7 foram tratados com 5 Gy de radiação, 100 nM de RAD001 ou ambos, e lisadas. Os níveis de fosforilação de Akt e S6 foram analisados ​​por Western blot. Os níveis totais de Akt e expressão S6 são mostrados. Resultados semelhantes foram obtidos quando 253J-BV, UM-UC3, e UM-UC6 foram tratados com radiação e RAD001 sozinho e em combinação (dados não mostrados).

Combinando RAD001 com radiação ionizante reduz significativamente colónia formação

Para fornecer informações sobre os efeitos da combinação de RAD001 com radiação ionizante em linhas celulares de cancro da bexiga, acompanhámos a fração de células sobreviventes ao longo do tempo usando ensaios clonog�icas. Após o tratamento, as células plaqueadas foram monitorizados ao longo do tempo e o número de colónias foi contado. A dose RAD001 foi mantida no GI50 para cada linha de células, enquanto que a dose de radiação foi variada. Em todas as linhas celulares testadas (253J-BV, UM-UC6, KU7, UM-UC3, UM-UC13, e UM-UC5), foi observado um decréscimo significativo no número de colónias de células tratadas com a terapia de combinação em comparação com quer radiação sozinha, ou o controlo não tratado (Fig. 3) ionizante. Curiosamente, enquanto que esta diminuição da fracção sobrevivente foi observada em todas as linhas celulares testadas, a diminuição relativa mais dramática quando ambos os tratamentos foram combinados foi observada com duas linhas de células mais sensíveis a RAD001 (UM-UC5 e UM-UC6). Em todas as linhas celulares testadas, os resultados apontam para um efeito aditivo sobre o crescimento quando se combina com RAD001 radiação ionizante. Vale a pena notar que uma menor inibição da formação do cólon foi observado nas duas linhas de células (UM-UC5 e UM-UC6) que foram caracterizados inicialmente pelo nosso laboratório para ser mais sensível a RAD001. Este encontra-se principalmente com o próprio ensaio colonogenic onde a formação do cólon (tal como determinado por um tamanho de colónia universalmente definido), enquanto que a sensibilidade a RAD001 foi feito com um ensaio enzimático (MTT). Esta discrepância de sensibilidades dos ensaios, comprimento de ensaio, combinado com o tempo de duplicação rápida, poderia explicar os resultados clonogénicas para estas duas linhas de células.

Seis linhagens de células foram tratadas com RAD001 durante 12 horas antes da exposição à radiação ionizante radiação e ainda crescidas como indicado nos Métodos. A formação de colónias foi medida após a fixação das células e a coloração com violeta de cristal, 10-14 dias após o tratamento de acordo com as linhas celulares. Os resultados foram estatisticamente significativos (p 0,05). No tratamento combinado em relação a qualquer dos tratamentos por si só em todas as linhas celulares testadas

O tratamento com RAD001 e radiação ionizante induz tanto um aumento da percentagem de células em G0 /G1 e G2 as fases do ciclo celular

para obter insights sobre o mecanismo subjacente à inibição do crescimento observada, análise do ciclo celular foi realizada por citometria de fluxo para estudar a distribuição de células durante as diferentes fases do ciclo celular 48 horas após cada tratamento sozinho e em combinação. As células foram tratadas com uma dose de RAD001 equivalente a sua GI50 (variando 0,5-75 nmol /L), bem como 4Gy de radiação ionizante. Os resultados são mostrados na Figura 4. RAD001 induziu uma prisão G0 /G1 em todas as linhas celulares de cancro da bexiga testadas: KU7 62% ± 4%, UM-UC3 71% ± 6%, UM-UC6 77% ± 3% e 253J- BV 67% ± 4% em comparação com os controlos não tratados, 54% ± 3%, 64% ± 2%, 66% ± 2% e 55% ± 3%, respectivamente. As percentagens representam a proporção de células em cada fase, relativamente ao número total de células. Como esperado, a radiação ionizante levou principalmente a uma paragem G2, ilustrado por um aumento significativo na percentagem de células nessa fase após o tratamento com radiação ionizante: KU7 38% ± 4%, UM-UC3 23% ± 4%, UM-UC6 19% ± 4% e 253J-BV 22% ± 3% em comparação com os respectivos controlos não tratados: 23% ± 2%, 19% ± 3%, 14% ± 3% e 4% ± 2%, respectivamente. No braço combinado com RAD001 e radiação ionizante, observou-se tanto um aumento na percentagem de células nas fases G0 /G1 e G2 (Fig. 4). Mais especificamente, uma diminuição na percentagem de células na fase S foi observada em comparação com qualquer dos tratamentos por si só ou com o controlo (sem tratamento) e este foi acompanhada com um aumento da percentagem de células em G0 /G1 e G2 fases. Tomados em conjunto, conclui-se que o efeito citostático de RAD001 combinada com radiação ionizante exibe um efeito aditivo inibidor sobre a progressão das células através do seu ciclo.

A célula linhas foram cultivadas e tratadas com RAD001 sozinho, a radiação ionizante sozinha e com a combinação de radiação e RAD001. Para esta última série, as amostras foram pré-tratadas com RAD001 durante 6 horas antes da irradiação. As células foram fixadas e coradas para a ingestão de iodeto de propídio a 48 horas após o tratamento, e, em seguida, foram realizadas medidas por citometria de fluxo. A proporção de populações de células nas diferentes fases do ciclo celular é mostrado para cada linha de células por barras coloridas (G0 /G1: laranja /azul; S: Vermelho e G2: Amarelo)

RAD001. e radiação ionizante alterar os níveis dos pontos de verificação do ciclo celular da ciclina D1, p27kip1 e p21

com base nos dados da análise do ciclo celular acima e para melhor compreender o mecanismo pelo qual RAD001 e ionizante ato radiação em conjunto para inibir o crescimento celular, testou-se a probabilidade de alterações nos níveis de diversos reguladores do ciclo celular de expressão, particularmente associada com pontos de verificação, tais como ciclina D1, p27, e p21. Os resultados na Figura 5 ilustram o caso de KU7, utilizado como um representante do grupo de linhas de células verificou-se ser relativamente resistente à radiação ionizante e ambos RAD001. Dito isto, uma dose de RAD001 equivalente ao GI50 de que a linha celular foi usado para assegurar uma resposta ao tratamento RAD001. Os nossos resultados mostram que o nível de ciclina D1, que é uma proteína necessária para a G1 /S de transição através do ciclo celular, foi diminuída após 24 horas de tratamento com RAD001 (Fig. 5), uma descoberta que suporta as nossas observações no ciclo celular alterar. Em contraste, os níveis de p27, que é uma proteína, também associado com o G1 /transição S, mudou de uma correlação inversa (aumentada) após 24 horas de tratamento com RAD001, radiação ionizante, e o tratamento combinado em comparação com o controlo (Fig. 5). Curiosamente, níveis de p21, que também está associada à inibição da progressão do ciclo celular, foram diminuídas nas células tratadas com RAD001 isoladamente, em comparação com o controlo, ou radiação (Fig. 5). Os níveis de proteína p21 aumentam em resposta ao tratamento com radiação em comparação com o controlo, e os níveis de proteína p21 são os mais elevados, quando as células são tratadas com ambos RAD001 e radiação ionizante. É digno de nota que resultados semelhantes foram obtidos para a ciclina D1, p27 e p21, em todas as linhas celulares testadas:. UM-UC3, UM-UC6 e 253J-BV

células cancerosas da bexiga foram tratados com RAD001, ionizante radiação (IV) ou o tratamento combinado. Eles foram lisadas 24 horas após o tratamento tal como descrito em Métodos. A análise de Western blot para ciclina D1, p27kip1 e p21 em células KU7 e normalizada em painéis inferiores como uma função do nível medido de actina em paralelo. Foram obtidos resultados semelhantes para todas as linhas celulares testadas, UM-UC3, UM-UC6 e 253J-BV (não mostrado).

Combinando RAD001 tratamento com radiação ionizante inibe significativamente o crescimento do tumor em xenoenxerto de cancro da bexiga humano modelo, em comparação com um ou outro tratamento sozinho

para verificar significância e verificar se

in vitro

dados com relação ao efeito da associação de RAD001 e radiação sobre o crescimento de linhas celulares de cancro da bexiga ionizante pode ser transposta

in vivo

, foi utilizada a linha de células de cancro da bexiga KU7 a crescer como xenoenxertos de tumores subcutâneos em ratinhos atímicos. Em todos os ratinhos, os tumores foram evidenciados nos primeiros 10 dias após o implante. Não houve perda de peso corporal ou qualquer toxicidade significativa associada directamente com RAD001 e os tratamentos de radiação ionizante durante toda a duração do estudo (um total de 5 semanas). Em ratinhos tratados com RAD001 combinadas e radiação ionizante, não havia um efeito inibitório máximo na progressão do cancro da bexiga, como indicado pela diminuição significativa no peso do tumor em comparação com o tratamento quer por si só ou grupo de placebo (o peso de tumor médio de 31 mg para o braço combinação vs 117 mg com RAD001 sozinha, 80 mg de IR com, ou 340 mg para o placebo, P 0,05) (Figura 6).. Achados semelhantes também foram obtidos utilizando as linhas celulares 253J-BV onde a terapia combinada alcançados efeito inibitório máximo na progressão do cancro da bexiga após 4 semanas de tratamento, em comparação ao controle. Os mesmos resultados foram demonstrados usando a cinética de crescimento do tumor, quando o volume do tumor foi medido ao longo do tempo de tratamento (dados não mostrados). Nossa coloração imuno-histoquímica p21 nas seções de xenotransplante confirmou nossas descobertas a partir da análise western blot para p21 níveis

in vitro

(Fig. 7). Os níveis de p21 significativamente (p 0,05) aumentada após o tratamento com radiação e o regime de combinação quando em comparação com o placebo. Além disso, os nossos dados indicam um decréscimo ligeiro, mas estatisticamente não significativo, os níveis de p21 no grupo tratado com RAD001 sozinho.

O modelo de tumor de ratos atímicos da bexiga KU7 foi usada como descrito nos Métodos. Os pesos dos tumores (em gramas) obtido no ponto final experimentais e expressos como média de peso de tumores colhidos de cada grupo de ratinhos em 4 grupos de tratamento, conforme indicado. resultados semelhantes obtidos usando células 253J-BV (dados não mostrados).

(A) imuno-histoquímica foi utilizado para detectar os níveis de p21 no rato tecidos de cancro da bexiga xenoenxerto embebidos em parafina tratados com placebo, IV, RAD001 e em combinação. (B) Quantificação dos dados de imuno-histoquímica revelaram um aumento significativo na expressão de p21, como observado em tumores tratados com radiação ionizante e em combinação em comparação com o tratamento com placebo e RAD001.

Discussão

a radioterapia é um elemento-chave de muitos regimes de tratamento do câncer, portanto, seu uso generalizado. No entanto, a radiação ionizante parece contribuir para um aumento desfavorável de sinalização no /AKT /mTOR pró-sobrevivência PI3K. No presente estudo, observou-se diferenças na sensibilidade de um painel de linhas celulares de seis bexiga à radiação ionizante, com alguns sendo eram mais resistentes do que outros. Também demonstraram a activação de Akt após a exposição à radiação ionizante. Vários fatores podem potencialmente ser determinante nos mecanismos de activação da via PI3K /AKT seguintes radiação ionizante e, em seguida, ajudar as células cancerosas no estabelecimento de resistência [22]. Entre outros, a actividade aumentada de enzimas chave, tais como a actividade de telomerase [23], bem como o envolvimento das moléculas de sinalização, tais como o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e RAS [24], [25] pode explicar por que razão alguns tumores não fazer responder à radiação de forma tão eficaz como os outros. Notavelmente, o EGFR sinalização através da via PI3K /AKT foi relatado para regular as subunidades catalíticas de proteína-quinase dependente de DNA, que são parte do mecanismo de reparação do ADN ligado depois da radiação [26]. Enquanto estas observações enfatizam a importância do papel que a activação da via PI3K /AKT desempenha na radiorresistência do cancro, que demonstram que o bloqueio da via PI3K /Akt /mTOR com RAD001 aparece como um meio valioso para aumentar a eficácia do tratamento com radiação em células cancerosas da bexiga. O mecanismo pelo qual RAD001 exibe este efeito melhorado ainda necessita de avaliação adicional. Pode simplesmente ser que o bloqueio da activação da via de recuperação de radiação seguinte é suficiente para diminuir radiorresistência; um mecanismo plausível que os dois tratamentos não partilhar alvos comuns na célula, tais como o factor de transcrição indutível hipoxia (HIF-1), uma molécula de jusante de mTOR [27].

Além de sinalização celular, a eficácia