Abstract

vias de sinalização modulada de estresse oxidativo têm sido implicados na carcinogênese e resistência à terapia. A lente epitélio factor de crescimento derivado de p75 (LEDGF /p75) é um co-activador de transcrição que promove a resistência à morte celular induzida por stress. Esta proteína tem sido implicado em doenças inflamatórias e auto-imunes, SIDA, o VIH-e cancro. Embora LEDGF /p75 está emergindo como um oncoproteína sobrevivência stress, há escassa informação sobre a sua expressão em tumores humanos. O presente estudo foi realizado para avaliar a sua expressão em um painel abrangente de cancros humanos. Transcrição expressão foi examinada na base de dados de microarray gene do cancro Oncomine e numa reacção em cadeia painel de pesquisa do cancro TissueScan polimerase quantitativa matriz (Q-PCR). a expressão da proteína foi avaliada por imuno-histoquímica (IHQ) em microarrays de tecido de cancro (TMA) contendo 1735 tecidos que representam núcleos simples ou replicar a partir de 1220 casos individuais (985 tumor e 235 tecidos normais). Foram analisados ​​um total de 21 tipos de câncer principais. Análise de expressão transcrição /p75 LEDGF em conjuntos de dados Oncomine revelou regulação positiva significativa (tumor vs. normal) em 15 dos 17 tipos de tumores. A matriz TissueScan Cancer Q-PCR revelou significativamente elevados expressão transcrição LEDGF /p75 em cancros da próstata, cólon, tireóide e de mama. análise IHC do TMA revelou níveis aumentados significativas de proteínas /p75 LEDGF em tumores de próstata, cólon, tireóide, fígado e útero, em relação aos tecidos normais correspondentes. Cima transcrição ou a expressão da proteína de LEDGF /p75 foi observado em vários tipos de tumores. Estes resultados ainda estabelecer LEDGF /p75 como uma proteína relacionada ao câncer, e proporcionar uma base racional para estudos em curso destinadas a compreender o significado clínico da sua expressão em cancros humanos específicos

Citation:. Basu A, Rojas H, Banerjee H, Cabrera IB, Perez KY, De Leon M, et al. (2012) Expressão da resposta ao estresse oncoproteína LEDGF /p75 em Câncer Humano: Um Estudo de 21 tipos de tumores. PLoS ONE 7 (1): e30132. doi: 10.1371 /journal.pone.0030132

Autor: John R. Battista, Louisiana State University e A M College, Estados Unidos da América

Recebido: 10 de junho de 2011; Aceito: 09 de dezembro de 2011; Publicação: 19 de janeiro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Basu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por uma bolsa da National Institutes of Health (NIH) Centro Nacional sobre Minority Saúde e Saúde disparidades [NIH-NCMHD 5P20MD001632 (MDL, CAC)]. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

um crescente corpo de evidências suporta a hipótese central de que um estado aumentado de estresse oxidativo celular (ASCOS) é um fator importante que contribui para a carcinogênese [1], [2]. Possíveis desencadeadores de ASCOS incluem estilo de vida e fatores ambientais relacionadas com tais como a dieta, infecções, tabagismo, álcool e poluentes [3]. ASCOS causa danos ao ADN, proteínas e lípidos, bem como a activação de factores de stress de transcrição, que conduz à activação do stress, antioxidante, inflamatória, e vias pró-sobrevivência que contribuem para a transformação maligna, a desregulação do ciclo celular, resistência à morte celular e terapia, invasão, angiogénese e metástase [1], [2].

LEDGF /p75 é uma proteína de resposta ao estresse, que promove a sobrevivência celular na presença de factores de stress ambientais que induzem ASCOS, tais como a quimioterapia, radiação , calor, e privação de soro [4] – [7]. LEDGF /p75 é também conhecido como co-activador de transcrição p75 [8], e PC4 proteína interagir SFRS1 (PSIP1) [9], e densa fina salpicado auto-antigénio de 70 kD (DFS70) [10]. Ele tem sido implicada na inflamação, autoimunidade, a replicação do HIV-1, e cancro [10] – [17]. As propriedades de sobrevivência de estresse LEDGF /p75 parecem estar ligadas à sua capacidade de ligar a factores de transcrição específicos e facilitar a transactivação de estresse, inflamatória, anti-oxidante, e os genes associados ao cancro [18] – [23]. LEDGF /p75 (530 aminoácidos) e os seus menos caracterizado variante de splicing alternativo, LEDGF /p52 (333 aminoácidos), são derivados do gene LEDGF /PSIP1 [8], [9], [24]. LEDGF /p52 corresponde aos ácidos aminados N-terminais de 1-325 LEDGF /p75, e contém uma cauda de 8-amino ácido adicional derivada-intrão [25]. O nosso grupo relatado anteriormente que LEDGF /p75 é regulada positivamente em células cancerosas em comparação com as células normais, e que LEDGF /p52 é expresso em níveis relativamente baixos em células de cancro, induz a apoptose quando expresso ectopicamente, e antagoniza as funções pró-sobrevivência de LEDGF /p75 [7], [16], [25].

Diversas linhas de evidência apoiar o recente surgimento de LEDGF /p75 como uma oncoproteína no câncer humano. Por exemplo, LEDGF /p75 é um alvo de translocações cromossómicas em leucemias, o que resulta em proteínas de fusão NUP98 LEDGF /com actividade melhorada [23], [26] – [29]. A sua expressão de mRNA foi encontrado para ser regulada positivamente em blastos de pacientes com leucemia aguda myelogenic quimioterapia-resistente, e a sua sobre-expressão ectópica protegido células de leucemia contra a morte celular induzida por drogas [30]. LEDGF /p75 amarras da linhagem de leucemia (MLL) complexo de fator de transcrição menin-misturada a cromatina para ativar leucemogênese [23]. O nosso grupo relatado anteriormente que LEDGF /p75 é um auto-antigénio no cancro da próstata (PCA), com a expressão da proteína elevada em tecidos tumorais de próstata [16]. Observamos também que a sua sobre-expressão ectópica promovendo a sobrevivência celular contra a morte induzida por estresse em células de tumores de fígado HepG2 [7], e atenuou a morte celular lisossomal induzida pelo docetaxel em células CaP [31]. Daugaard et ai. [17] relataram a expressão elevada transcrição LEDGF /p75 em cancros da mama e da bexiga cancros humanos, e que a sua sobre-expressão ectópica em células de cancro da mama protegidos contra a morte celular induzida por drogas lisossomal e aumentou o potencial tumorigénico das células cancerosas em modelos murinos. Recentemente, gonadotropinas elevadas foram exibidas para realçar /activação dependente de p75 LEDGF de expressão VEGF-C, aumentando a linfangiogénese e a angiogénese de tumores do ovário [32].

Embora a expressão da transcrição LEDGF /p75 foi reportado ser regulada para cima na leucemia, mama, e cancros da bexiga [17], [30], a análise da proteína em tecidos de tumor humanos imuno expressão (IHC) foi realizada apenas para CaP [16]. O papel emergente da LEDGF /p75 como uma sobrevivência estresse oncoproteína nos levou a realizar uma análise abrangente do seu mRNA e expressão de proteínas em 21 principais tipos de tumores humanos, utilizando bases de dados de microarranjos gene do cancro, matriz TissueScan Cancer Q-PCR e análise IHC do tecido microarranjos (TMAs). Este estudo fornece evidências de que LEDGF /p75 é selectivamente regulada positivamente em cancros humanos.

Materiais e Métodos

Análise bioinformática de Câncer Oncomine Gene Microarray Database

Para a comparação da expressão de mRNA LEDGF entre tumores e tecidos normais, foram selecionados conjuntos de dados do banco de dados Oncomine (compêndios Biosciences; Ann Arbor, MI, EUA; www.oncomine.org). Estes conjuntos de dados, contendo microarrays de genes de cânceres e tecidos normais e /ou normais adjacentes livres de doenças correspondentes, forneceu dados dobra de mudança para a expressão do gene (tumor vs normal), com p-valores calculados pelo teste t. Deve mencionar-se que os conjuntos de dados foram analisados ​​não específica para LEDGF /p75, mas forneceu dados de expressão de genes para o gene /PSIP1 LEDGF, o que dá origem a ambos os p75 e P52 variantes de splicing. Um total de 81 conjuntos de dados foram examinados para a expressão transcrição LEDGF /PSIP1 para os seguintes tipos de cancro: bexiga (2 conjuntos de dados), mama (9 conjuntos de dados), colo do útero (2 conjuntos de dados), cólon e reto (3 conjuntos de dados), esôfago (3 conjuntos de dados), rim (6 conjuntos de dados), cabeça e pescoço (8 conjuntos de dados), fígado (2 conjuntos de dados), pulmão (9 conjuntos de dados), linfoma (3 conjuntos de dados), ovário (6 conjuntos de dados), pâncreas (6 conjuntos de dados), próstata (13 conjuntos de dados), glândula salivar (1 conjunto de dados), pele (5 conjuntos de dados), estômago (2 conjuntos de dados) e do útero (1 conjunto de dados). Não existem dados microarray estava disponível para LEDGF /expressão transcrição PSIP1 em cancros da bexiga, intestino delgado, e tireóide.

‘Painel de Inquérito TissueScan Cancer’ Human Q-PCR matriz

Foi utilizado o matriz Q-PCR ‘TissueScan Cancer Panel Survey 96-I’ humana (CSRT-101, OriGene Technologies Inc., Rockville, MD, EUA) para análise in-house da expressão de mRNA LEDGF /p75 em 96 tecidos cobrindo 8 principais cancros humanos ( da mama, cólon, rim, fígado, pulmão, do ovário, da próstata, da tiróide e). Esta matriz consistiu de DNA complementar de primeira cadeia (cDNA) a partir de 9 casos individuais de cada tipo de câncer e 3 casos de correspondentes tecidos normais adjacentes. O fabricante forneceu informações limitadas paciente clínico-patológico (idade, sexo, estágio do tumor, estágio pTNM), sem identificação do doente.

Q-PCR foi realizada em 96 poços placas de PCR array (OriGene), utilizando o termociclador MyiQ (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) com iniciadores específicos para o /variante de splicing p75 LEDGF (directo 5′-TGCTTTTCCAGACATGGTTGT-3 ‘e inverso 5′-CCCACAAACAGTGAAAAGACAG-3′), e QI SYBR Green Supermix (Bio- Rad). Resumidamente, 30 uL de mistura de PCR, que incluía 15 ul de 2 × mistura principal, 13 uL de água duplamente destilada, e 1 ul de cada um dos iniciadores directos e inversos (10 pmoles /ul), foram adicionados a cada um dos 96 poços de as placas de matriz de PCR. A amplificação por PCR foi conduzida a 95 ° C durante 10 minutos, seguido por 40 ciclos de 95 ° C durante 15 segundos e 60 ° C durante 1 minuto. a expressão de ARNm foram normalizados utilizando a expressão do gene de manutenção da beta-actina humana, cuja iniciadores (directo 5’-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3 ‘e inverso 5′-AGGTCCAGACGCAGGAT GGCATG-3’) foram fornecidos no kit matriz TissueScan cancro Q-PCR numa concentração de 10 pmoles /uL. Para análise dos dados, foi utilizado o método ΔΔCt. Dobram mudanças foram calculados como a diferença na expressão genética entre os tumores e os correspondentes controles normais adjacentes.

RNA Knockdown mediada por interferência de /p75

PC-3 células de câncer de próstata LEDGF foram adquiridos da American Type Recolha e cultura cultivadas como recomendado pelo fornecedor, num incubador humidificado com 5% de CO

2 a 37 ° C. knockdown transiente de LEDGF /p75 em células PC-3 foi realizada utilizando o método Amaxa Nucleofection (Amaxa, Lonza), tal como descrito anteriormente [21]. LEDGF siRNA /p75 (siLEDGF /p75) eo mexidos duplex siRNA (SISD, controle negativo) foram sintetizados por tecnologias de DNA integrados (IDT). A sequência /p75 siLEDGF correspondia aos nucleótidos 1340-1360 (5′-AGACAGCAUGAGGAAGCGAdTdT-3 ‘) em relação ao primeiro nucleótido do codão de iniciação do /p75 grelha de leitura aberta LEDGF [21]. Esta sequência corresponde a uma região no terminal C do LEDGF /p75 não partilhada por LEDGF /p52. A sequência para SISD foi 5’- GCGCGCUUUGUAGGAUUCGdTdT-3 ‘[21]

Anticorpos e imunotransferência

Foram utilizados os seguintes anticorpos:. Anticorpos monoclonais de ratinho anti-β-actina (Sigma-Aldrich), e anti-LEDGF (1:1000, BD Biosciences); policlonais de coelho anti-LEDGF /p75 (1:1000, Novus Biologicals); anti-LEDGF /p75 (1:1000, Bethyl); e peroxidase de rábano (HRP) marcado com anticorpos IgG secundários (Zymed). Nós também utilizado um anticorpo policlonal de coelho LEDGF /específicas do p75, que foi desenvolvido no W.M. Keck auto-imune Centro de Doenças do Instituto de Pesquisa Scripps (La Jolla, CA, EUA). Este anticorpo de coelho, originalmente designado anti-DFS /LEDGFp75 # 5087 anticorpo (doravante referida como Scripps-Ab5087), foi levantada contra um recombinante, proteína truncada DFS70 gerado a partir de um clone de cDNA parcial, pDFS6.1, que codificou o C-terminal região de LEDGF /p75 [10]. Para identificar um anticorpo que é específico apenas para a variante de splicing LEDGF /p75, examinou-se o reactividade de todos os anticorpos LEDGF comerciais e não-comerciais acima mencionados por imunotransf erência utilizando lisados ​​de células de PC-3 de células com SISD e siLEDGF /p75.

imunotransferência foi realizada essencialmente como descrito anteriormente [21]. Resumidamente, as proteínas totais de células PC3 com SISD e siLEDGF /p75 foram separadas por SDS-PAGE (NuPAGE 4-12%, Invitrogen), seguido por transferência para difluoreto de polivinilo (PVDF) membranas (Millipore). As membranas foram bloqueadas com uma solução de 5% de leite seco em tampão TBS-T (Tris-HCl a 20, pH 7,6, 140 mM de NaCl, 0,1% de Tween 20) durante 1 h e sondadas com anticorpos primários. Após várias lavagens com TBS-T, as membranas foram incubadas com peroxidase de rábano (HRP) -conjugated anticorpos secundários durante 30 minutos e depois lavou-se de novo com TBS-T. bandas de proteínas foram detectados por quimioluminescência aumentada (Amersham).

Análise imuno-histoquímica de microarrays de tecido de cancro

microarrays de tecido de cancro Humanos (TMAs), disponíveis comercialmente de doença National Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA , EUA), Imgenex Corp (San Diego, CA, EUA) e US Biomax Inc. (Rockville, MD, EUA), foram utilizados para análise de IHC LEDGF /p75. Vários TMA diferentes foram usadas para aumentar o número de tipos de tecidos de tumor e tamanho da amostra (Tabela 1). Resumidamente, adquirimos da NDRI abrangente pan-câncer TMAs contendo núcleos em duplicado de 642 casos únicos (522 tecidos tumorais de 20 tipos de tumores grandes e 120 espécimes normais adjacentes e /ou normais livres da doença) em um conjunto 5 de slides (TS-1, TS -2, TS-3, TS-4 e TMA5). Cada um pan-câncer TMAs IMH-326, IMH-327 e IMH-328 (Imgenex Corp), continha 59 amostras de vários tipos de tumores, enquanto TMAs IMH-336, IMH-337 e IMH-338 (Imgenex Corp.) continha o correspondendo 59 combinados tecidos adjacentes normais.

Nós também utilizado TMA IMH-303 (Imgenex Corp.), contendo 40 tecidos APC e 9 combinados tecidos adjacentes normais. Oito TMA adicional de US Biomax foram utilizadas, cada uma contendo várias amostras de tecido de um único tipo de tumor (mama, cólon, rim, pulmão, fígado, pâncreas, próstata, tiróide), bem como correspondente livre de doença de controlo normal e /ou normal adjacente tecidos. Os fabricantes desses TMA fornecida pouca informação básica clínico-patológico (idade, sexo, estádio do tumor em alguns casos) que corresponde aos núcleos dos tecidos, sem identificadores do paciente. Nenhuma informação foi disponibilizada na raça ou etnia do paciente, o tratamento neo-adjuvante, técnica cirúrgica, ano da cirurgia, instituições que recolhidos os tecidos, o número de instituições, acompanhamento rotinas e técnicas de manipulação de tecidos. O paciente limitada acompanhar os dados associados com o TMA impediu qualquer análise de sobrevivência de Kaplan-Meier.

TMA foram coradas utilizando um i6000 Biogênica auto-Stainer (Biogenex Corporation, Fremont, CA, EUA) como descrito anteriormente [16] , [33]. Resumidamente, embebidos em parafina secções de tecido em lâminas TMA foram desparafinados e as lâminas foram imersas em Citra-Plus solução de recuperação de antigénio (Biogenex Corp.). A recuperação de antígenos foi realizada por microondas as lâminas durante 2 min a potência de 100%, seguido de 10 min a 20% de energia. As lâminas foram em seguida arrefeceu-se a solução em recuperação de antigénio durante 20 min. A actividade da peroxidase endógena foi extinta por meio de tratamento com peróxido de hidrogénio a 3% em metanol a 10%, e de potência de bloco © reagente de bloqueio universal (Biogenex Corp.) foi usado para bloquear a proteína de ligação não específica.

lâminas foram incubadas durante a noite TMA Scripps com anticorpo-anti-Ab5087 LEDGF /p75 [16], seguido por 3 lavagens em PBS. As lâminas foram então incubadas com Multi-Link © anticorpo secundário biotinilado (Biogenex Corp.) durante 20 minutos, seguida por incubação com estreptavidina acoplada a peroxidase de supersensíveis etiqueta © (Biogenex Corp.) durante 20 min. A imunocoloração foi detectada por activação da peroxidase do cromogénio 3-amino-9-ethycarbazole (AEC) (Biocare médica, Concord, CA, EUA). TMA foram contrastadas com hematoxilina de leve (Sigma, St. Louis, MO, EUA) e montada com Permount (Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, EUA). Para controlo negativo do anticorpo primário foi omitido e substituído com soro de coelho pré-imune. As secções de tecido foram examinadas sob um microscópio Olympus BX50, e as imagens foram adquiridas usando uma câmera digital Mancha RT3 ™ (Diagnostic Instruments, Sterling Heights, MI, EUA). Imunologicamente TMAs foram marcados cegamente para LEDGF /p75 imuno por um patologista placa certificada. Um sistema de pontuação quatro camadas (0 = negativo, 1 = fraco, 2 = moderada, 3 = forte) foi usada para avaliar a intensidade da coloração. Tecidos com dezenas de 0-1 foram considerado de baixa coloração de intensidade, enquanto que tecidos com dezenas de 2-3 foram considerados como tendo alta coloração intensidade. Os espécimes de tecido que apresentam má qualidade foram excluídos das análises. Estes estudos foram realizados sob aprovação do Conselho de Revisão Institucional.

Análise Estatística

O teste t de Student foi utilizado para avaliar a importância da alteração na expressão de mRNA entre o tumor e normal controle adjacente amostras na matriz TissueScan cancro Q-PCR. A análise estatística dos dados IHC e sua relação com os resultados clínicos dos pacientes foi feito usando o pacote SAS software (versão 9.2; SAS Institute). Para facilidade de análise estatística, as amostras de tecido foram agrupados em duas categorias com base nas suas pontuações. coloração ‘Low’ foi determinada como agrupados pontuações de intensidade de coloração de 0 e 1, enquanto a coloração ‘alta’ tinham juntado dezenas de 2 e 3. Diferença de níveis de proteína LEDGF /p75 entre tumores e tecidos normais foram analisados ​​utilizando o teste exato de Fisher expressão.

para controlar falsos positivos, que possam surgir no-múltiplas hipóteses de teste de estudos, a taxa de descoberta de falsas (FDR) p-valores ajustados foram também calculados. FDR é uma quantificação de erro usado comumente em comparações múltiplas. Ele controla a proporção esperada de hipóteses nulas rejeitadas incorretamente. Em outras palavras, FDR controla a fracção de detecções positivas que são falsas. As associações entre os níveis de expressão de LEDGF /p75 e os parâmetros clínico foram determinados pelo teste exato de Fisher (para idade e sexo) e análise de correlação tau de Kendall (para o estágio do tumor). Os valores de probabilidade

P Art 0,05 foram considerados estatisticamente significativos. Reprodutibilidade dos núcleos de réplicas foi avaliada por Cochran-Mantel-Haenszel teste que testou para a homogeneidade entre as repetições.

Resultados

transcrição LEDGF /p75 é regulada em vários tipos de câncer humano

a análise in silico de expressão LEDGF /PSIP1 mRNA em tecidos de câncer foi realizada utilizando conjuntos de dados de microarranjos gene do cancro do banco de dados Oncomine que, em comparação tecidos de câncer de tecidos normais (ou livre de doença normal e /ou normal adjacente). Conforme resumido na Tabela 2, foi observado um aumento estatisticamente significativo (

P

0,05) a regulação positiva de LEDGF /PSIP1 transcrição em alguns dos conjuntos de dados de microarray disponíveis a partir de cancros da mama, do colo do útero, do cólon, do esófago, rim, cabeça e pescoço, fígado, pulmão, linfoma, ovários, pâncreas, próstata, glândula salivar, pele e estômago. O vezes de aumento era maior do que 2 em cancros da mama, colo, cabeça e pescoço, rins, pele, estômago e (Tabela 2). O aumento foi modesto (entre 1 e 2) em colorrectal, do esófago, fígado, pulmão, ovário, pâncreas, próstata, e cancros das glândulas salivares. Não ocorreram alterações em LEDGF expressão /PSIP1 transcrição foram detectados em bexiga (5 conjuntos de dados) e câncer uterino (1 conjunto de dados). Nenhum dos 17 tipos de câncer acima mencionados mostraram regulação baixa significativa de LEDGF /PSIP1 transcrição em qualquer conjunto de dados. Nenhum conjunto de dados estavam disponíveis comparando tumor vs expressão normal de LEDGF /PSIP1 transcrição na vesícula, intestino delgado e cancros da tiróide.

A expressão de LEDGF /p75 transcrição foi ainda avaliado experimentalmente em oito tipos de tumores sólidos (mama, cólon, rim, fígado, pulmão, ovário, próstata e da tiróide), utilizando a matriz TissueScan cancro Q-PCR, que continham amostras de tecido de cancro a partir de 12 casos individuais dadores (n = 9 para cada tipo de cancro, n = 3 para o correspondente tecidos normais). Os iniciadores específicos para LEDGF /p75 foram usados ​​nestas experiências. Como mostrado na Figura 1, um aumento estatisticamente significativo (

P

0,05) a regulação positiva de LEDGF /p75 transcrição foi observada na próstata (2,38 vezes,

P

= 0,002), tiróide (1,85 dobra ,

P

= 0,031), peito (2,26 vezes,

P

= 0,037) e cólon (2,04 vezes,

P

= 0,047) cancros. Embora o nível de LEDGF /p75 transcrição foi elevada ( 1,02 vezes) em outros tipos de cancro (com excepção de cancro do fígado) as mudanças de dobragem não foram estatisticamente significativas. tumores do fígado mostrou uma ligeira regulação negativa (-1,24 vezes) em LEDGF /p75 expressão transcrição, mas a redução foi estatisticamente insignificante.

Os dados foram analisados ​​utilizando o método ΔΔCt com valores normalizados para p-actina níveis. O eixo y representa a indução de dobragem do nível de ARNm /p75 LEDGF em oito tipos de cancro (n = 9) comparado com correspondentes tecidos adjacentes normais (N = 3) na matriz. As barras de erro exibe o intervalo de erro padrão. *

P Art 0,05.

valores

P foram determinados com o teste t de Student.

Seleção de LEDGF Antibody /p75-específico para IHC

A fim de identificar um anticorpo que é específico para LEDGF /p75 e que pode ser utilizado por IHQ para avaliar os níveis desta proteína no cancro TMA expressão, foi avaliada por imunotransf erência a especificidade dos anticorpos anti-LEDGF actualmente disponíveis. Três anticorpos disponíveis comercialmente anti-LEDGF (Bethyl, BD e Novus) e um anticorpo não comercial (Scripps-Ab5087) contra LEDGF foram testados por imunotransferência em células PC-3 com e sem knockdown transiente da proteína (Figura 2). Células PC-3 transfectadas com SISD serviu como controlo. análise immunoblotting indicou que todos os 3 anticorpos comerciais para LEDGF reagiu com tanto p75 e variantes P52. No entanto, o anticorpo Scripps-Ab5087 detectada apenas LEDGF /p75 e, por conseguinte, foi seleccionado para estudos de IHC.

As células foram transfectadas com siLEDGF /p75 para induzir knockdown transiente de LEDGF /p75. PC-3 transfectadas com pequena interferindo mexidos RNA duplex (SISD) serviu como controle correspondente. análise de imunotransferência, testou a reactividade específica de todos os anticorpos contra LEDGF /PSIP1. Todos os pares blot (SISD e siLEDGF /p75) para cada anticorpo foram derivados do mesmo blot.

LEDGF Protein /p75 é sobre-expresso em vários tipos de câncer humano

Eu executei IHC análise de expressão /proteína p75 LEDGF em tecidos de tumor utilizando um amplo painel de TMA contendo um total de 2330 núcleos dos tecidos, incluindo 1754 tumores núcleos de tecido a partir de mais de 35 tipos principais de cancro humano e os correspondentes 576 não tumoral (normal e não-canceroso inflamatória ) núcleos de tecido (Tabela 1). Foram excluídos da nossa análise estatística esses tipos de tumores que tinham 5 núcleos de tecido de tumor ou /e não tinha correspondentes tecidos não tumorais. Os núcleos dos tecidos inflamatórios não-tumorais também foram excluídos porque nem todos os tipos de tumores teve nos tecidos inflamatórios correspondentes. Alguns núcleos de tecido não podia ser marcado devido à má qualidade do tecido. No final, 21 tipos de tumor foram incluídos na nossa análise estatística (Tabela 3). Estes compreendia um total de 1735 tecidos representando única ou replicar núcleos de 1220 casos de doadores individuais, com 985 casos de tumor e 235 casos não-tumorais.

Os resultados da análise IHC de partituras reunidas para LEDGF /expressão da proteína p75 (ou seja, elevados = contagens 2-3 vs baixa = 0-1) em tecidos tumorais em comparação com tecidos normais são mostrados na Tabela 3. Não foi sobre-expressão significativa de proteína /p75 LEDGF na próstata, cólon, tiróide, fígado, e tumores uterinos (

P

0,05) (Tabela 3 e Figura 3). Os níveis de expressão elevados em tumores de mama, esteve próximo de significância estatística (

P

= 0,087). Quando corrigida para a ocorrência de falsos positivos, única próstata, tireóide e tumores de fígado foram encontrados para exibir superexpressão significativa de proteína /p75 LEDGF (FDR ajustado

P Restaurant 0,05).

Tissue microarrays foram coradas com anticorpo contra LEDGF /p75, e os núcleos individuais foram cegamente registados com a seguinte escala: 0 = nenhuma coloração, 1 = baixa coloração, 2 = coloração moderada, 3 = forte coloração. tecidos marcados foram agrupados em dois grupos: baixo de coloração (escores 0 e 1, barras escuras) e alta coloração (notas 2 e 3, barras de luz). O percentual de espécimes em duas categorias de coloração foi traçado para tecidos tumorais em relação ao normal (incluindo livres de doenças normais e normais adjacentes) tecidos. *

P Art 0,05; **

P Art 0,01.

valores

P foram determinados com o teste exato de Fisher.

A porcentagem de tecidos tumorais com altas pontuações (2-3) expressão LEDGF /proteína p75 foi de 70,5% na tireóide, 68% no fígado, 38,3% na próstata, 30,2% em uterina, e 25% em cancros do cólon, em comparação com 12,5%, 31,3%, 0%, 0% e 6,3%, respectivamente, nos seus tecidos normais correspondentes (Tabela 3) . Havia quatro tipos de cancro (mama, colo do útero, ovário e da glândula salivar) em que a frequência de tumores que exibem expressão elevada de proteína /p75 LEDGF foi cerca de 20% ou superior, e os tecidos normais correspondentes mostrou pouca ou nenhuma expressão da proteína. No entanto, quando comparamos as diferenças de LEDGF expressão /p75 (alta vs. baixa expressão) entre tumor e tecidos normais, o

P

valores não atingiu significância. Curiosamente, quando comparamos as diferenças entre tecidos tumorais e normais com relação ao LEDGF expressão /p75 (escores 1-3) vs nenhuma expressão (pontuação 0),

valores P Compra de mama e câncer cervical significância alcançado (

P

0,05; dados não mostrados). Comparação dos núcleos replicadas não apresentou diferença significativa (

P

= 0,6226) entre as repetições, sugerindo alta reprodutibilidade entre os núcleos em duplicado.

Figura 4A mostra núcleos de tecido tumoral representativos imunomarcadas com Scripps-Ab5087 anti-LEDGF /anticorpo p75. As imagens representativas IHC correspondem a próstata, cólon e núcleos de tecido de tumor da tireóide com baixa (escores 0-1) e alta intensidade (escores 2-3) coloração. Como mencionado acima, estes três tipos de tumores exibida regulação positiva significativa de ambos transcrição (TissueScan cancro Q-PCR matriz) e proteína (IHC). A Figura 4B mostra imagens representativas de IHC de tecidos normais da próstata e do cólon livres da doença (a partir de doadores não cancerosas), assim como amostras de tumor da próstata e do cólon com os seus tecidos adjacentes correspondentes. O câncer de tireóide TMAs não ter acompanhado os tecidos adjacentes para tumores específicos da tiróide. Observou-se que os tecidos “normais” adjacentes para os tecidos da próstata e do cólon tumor tinha coloração LEDGF /p75 moderada, em comparação com a coloração relativamente baixa intensidade de tecidos normais sem doença. Outra observação interessante foi que LEDGFp75 imunocoloração foi distribuído em ambos o núcleo e o citoplasma, na maioria dos tecidos de tumor examinados.

. Imagens representativas de coloração imuno-histoquímica (baixa intensidade, 0-1; alta intensidade, partituras 2-3) para LEDGF /p75 em tumores de próstata, cólon e da tiróide (escala bar-40 m; ampliação = 200 ×). imagens B. representativos de LEDGF /p75 imunocoloração de tecidos normais da próstata e cólon não-doença e em tecidos tumorais e seus tecidos adjacentes correspondentes (Scale bar-40 um; ampliação = 400 ×). TMA foram coradas utilizando o anticorpo de coelho específico LEDGF /p75 Scripps-Ab5087, como indicado em Materiais e Métodos. configurações da câmera idênticos foram utilizados na aquisição e processamento de imagens para um tipo de tecido particular.

As características clinicopatológicas disponíveis de pacientes com tipos tumorais que apresentam significativa superexpressão LEDGF /p75 estão resumidos na Tabela 4. O número de amostras de tecido para cólon e próstata difere nos conjuntos discutindo idade e sexo por causa de dados perdidos na TMAs disponível no mercado. Os dados sobre idade estava faltando para 4 núcleos no cancro da próstata TMAs enquanto os dados sobre o sexo estava faltando para 2 núcleos no cancro do cólon TMA. Correlação entre essas características e expressão da proteína LEDGF /p75 revelou que a sobre-expressão desta proteína em tumores hepáticos e da tireóide foi significativamente associada com menor idade (

P Art 0,05) (Tabela 4). As idades medianas de pacientes representados nas TMA foram 62 anos para o câncer de cólon, de 53 anos para o câncer de fígado, 66 anos para câncer de próstata, 48 anos para câncer de tireóide e 70 anos para o câncer uterino. Nenhum dos cinco tipos de tumores exibiram correlação significativa entre o aumento da expressão LEDGF /p75, sexo ou aumento tumor estádio TNM. Os pacientes limitada de dados de acompanhamento associados com o TMA se opõe a correlacionar LEDGF expressão /p75 com os resultados de sobrevivência do paciente.

A análise multi-plataforma de expressão /p75 LEDGF em vários tipos de tumores humanos foi resumido em tabela 5. as expressões de transcrição e proteínas para cada tipo de tumor são comparados entre as diferentes plataformas utilizadas:. in silico, Q-PCR e IHQ

Discussão

O presente estudo foi realizado como parte de nossos esforços contínuos para entender o significado biológico e clínico de LEDGF expressão /p75 no cancro humano. Os nossos resultados indicaram regulação positiva significativa de ambos LEDGF transcrição /p75 e proteína na próstata, cólon e tumores da tiróide, inferida por meio da análise da expressão de transcrição na base de dados de microarray gene do cancro Oncomine (quando os dados disponíveis) e a matriz TissueScan cancro Q-PCR, e análise de expressão proteica por IHC no TMA. A sobre-regulação observado de LEDGF /p75 em tumores da próstata é consistente com as nossas relatórios anteriores que esta proteína é o alvo dos auto-anticorpos nalguns pacientes com CaP, é regulada positivamente em linhas celulares de APC e tecidos, e promove quimiorresistência em linhas celulares de CaP quando ectopicamente overexpressed [16], [31].

regulação positiva significativa de LEDGF /PSIP1 transcrito foi também observada em alguns conjuntos de dados Oncomine para os cancros da mama, do colo do útero, do esófago, do rim, da cabeça e pescoço, fígado, pulmão, linfoma, ovário, pâncreas, glândula salivar, pele e estômago. No entanto, apenas 4 dos 8 tipos tumorais (próstata, do cólon, da mama e da tiróide) exibiram significativa supra-regulação da transcrição /p75 LEDGF na matriz TissueScan cancro Q-PCR. Apesar de outros tipos de tumores (rim, pulmão, e do ovário) apresentaram 1,02 vezes LEDGF /p75 elevação transcrição nessa matriz, a supra-regulação não foi estatisticamente significativa. Estas diferenças entre o banco de dados Oncomine ea matriz Cancer TissueScan Q-PCR pode ser atribuída ao pequeno tamanho da amostra no segundo, variações metodológicas /plataforma, a análise dos LEDGF /PSIP1 vs LEDGF /p75, bem como a utilização de conjuntos de dados tumor não relacionadas. [17].