Abstract

O surgimento de espectrometria de massa (MS) assinaturas baseados como biomarcadores gerou entre oncologistas. No entanto, também existem variações em indivíduos normais, e uma melhor compreensão dos padrões de peptídeos de soro de indivíduos saudáveis ​​será importante para explorar ainda mais os padrões de peptídeos de soro de doenças específicas. Seguindo o desenvolvimento de um padrão da plataforma péptido soro, foram analisados ​​500 amostras de soro obtidas a partir de indivíduos saudáveis. As amostras a partir da mama (n = 84), foram igualmente examinados os pacientes com cancro do pulmão (n = 70), e rectal (n = 30). análise de dados extensiva revelou contribuições insignificantes de idade para os padrões de peptídeos de soro, exceto em indivíduos saudáveis ​​entre 20-30 e 60+ anos de idade. variações relacionadas com o género nos padrões de soro de indivíduos saudáveis ​​foram apenas observados em indivíduos de 20-30 anos de idade. Os nossos resultados revelaram uma variação substancial nos perfis peptídicos individuais, mas aos 65 peptídeos foram detectados em uma freqüência 20% maior na população saudável. Um perfil de péptido foi desenvolvido para cada tipo de cancro, contendo 10 péptidos não discriminam prevalentes em indivíduos saudáveis. identificação da sequência de 111 peptídeos assinatura revelou que eles caíram em vários clusters apertados ea maioria eram produtos exopeptidase de proteínas residentes soro. Obtivemos um perfil peptídico soro baseado no MS para indivíduos saudáveis, fornecendo uma referência para observar a ocorrência de peptídeos específicos do cancro

Citation:. Ele K, Wen XY, Li AL, Li T, Wang J, Wang HX, et ai. (2013) Variações Serum peptidoma em uma população saudável: Referência para identificar péptidos câncer específico. PLoS ONE 8 (5): e63724. doi: 10.1371 /journal.pone.0063724

editor: Philippe Rouet, I2MC INSERM UMR U1048, França |

Recebido: 26 de junho de 2012; Aceito: 11 de abril de 2013; Publicado em: 08 de maio de 2013

Direitos de autor: © 2013 He et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Key Tecnologia R D Programa (2009BAK61B04), Inovação de Metodologia (2010IM030300), National Natural Science Foundation da China (21.007.092), e doações do Nacional de Ciência e Projeto principal Tecnologia (2008ZX10002-016). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O surgimento de espectrometria de massa (MS) assinaturas baseados como biomarcadores gerou entusiasmo considerável entre oncologistas e químicos analíticos [1]. técnicas de MS permitir a resolução de centenas de pequenas e peptídeos médias de apenas microlitros de soro. Villanueva e colegas demonstraram que o cancro pode ser detectado e classificada com base em peptídeos de soro gerados como um resultado da actividade de protease do tumor [2]. Esses chamados padrões proteômicas entrou proteômica tradicionais com a publicação de um estudo de Lancet em 2002, que foi rapidamente seguido por um número significativo de estudos e avaliações. Vários relatórios recentes puseram em evidência determinações baseados em MS de padrões peptídicos específicos, que indicam a presença de tumores com muito elevada sensibilidade e especificidade [3] – [16]. Estes estudos têm sido realizados sobre instrumentos de alta resolução usando a laser dessorção /ionização (MALDI) fontes de iões assistida por matriz e detectores (TOF) íon time-of-flight [2], [10] – [16]. instrumentação mais sofisticada, como a Transformada de Fourier (FT) MS /MS permitir a identificação de um maior número de sequências peptídicas

15. Recentemente, a afinidade purificação à base de talão foi desenvolvido e adotado por alguns investigadores, uma vez que pérolas esféricas têm maiores áreas de superfície combinada e uma capacidade de ligação maior do que manchas de pequeno diâmetro [14] – [19].

O padrão de peptídeos de soro produzidos por vários estados de doença detém uma grande quantidade de informações de diagnóstico específico da doença. Espera-se que os painéis de dezenas a centenas de marcadores de péptidos pode superar a heterogeneidade das amostras de soro para gerar um nível elevado de especificidade do diagnóstico. Medindo painéis de marcadores peptidoma pode ser mais sensível e específica do que as abordagens de biomarcadores convencionais. No entanto, os críticos têm expressado preocupações sobre várias fontes de viés em descoberta de biomarcadores com base em proteômica do soro. Entre eles, idade e sexo são as principais fontes de influências que podem afetar a composição e abundância relativa de peptídeos de soro [20]. Portanto, uma melhor compreensão dos padrões de peptídeos em soro de indivíduos saudáveis ​​será importante para explorar ainda mais os perfis de peptídeos de soro de doenças específicas.

Neste estudo, abordamos se os parâmetros de padrões de peptídeos de soro de gênero e influência da idade em indivíduos saudáveis. O estudo incluiu 500 amostras de soro de homens saudáveis ​​e mulheres entre 20 e 80 anos de idade. As amostras a partir da mama, pulmão, e doentes com cancro rectal foram examinados. análise de dados extensiva revelou contribuições insignificantes de idade para os padrões de peptídeos de soro, exceto em indivíduos saudáveis ​​entre 20-30 e 60+ anos de idade. e que a variação de gênero nos padrões de soro em indivíduos saudáveis ​​ocorreu apenas entre 20-30 anos de idade. Os nossos resultados mostraram que os perfis de péptido variou individualmente, mas que 65 péptidos foram detectadas a uma frequência de 20% mais elevada na população saudável. Um perfil de péptido foi desenvolvido para cada tipo de cancro, contendo 10 péptidos não discriminam prevalentes em indivíduos saudáveis. identificação da sequência de 111 peptídeos assinatura revelou que eles caíram em vários clusters apertados ea maioria eram produtos exopeptidase de proteínas residentes soro

Materiais e Métodos

Reagente

kit de purificação de cobre-quelatados esférulas magnéticas foi preparado a partir de nosso laboratório [21]. Os padrões de calibração contendo nove peptídeos foram utilizados como marcadores artificiais (Bruker Daltonik) e consistiu das seguintes moléculas com massas médias moleculares indicadas entre parênteses: angiotensina II (1.046,54180), angiotensina I (1.296,68480), a substância P (1347.73540), bombesina (1.619,82230) , clip1-17 ACTH (2.093,08620), clip18-39 ACTH (2.465,19830), somatostatina (3.147,47100), Ins BOV (5.734,55700), ubiquitina (8.565,88500).

A ética declaração

Depois que nós obteve a aprovação do comitê de ética de 301 general Hospital e da comissão de ética do primeiro hospital clínico de Jilin universidade, todos os doadores tinham assinado os formulários de consentimento.

as amostras de soro

as amostras de sangue de voluntários saudáveis e foram coletados de 301 Hospital Geral e submetido a exame físico e definida como clínica saudável. Os pacientes diagnosticados com câncer de pulmão, câncer de mama e câncer retal foram coletadas a partir do primeiro hospital clínico de Jilin University (Tabela S1, S2 tabela e Tabela S3). Todas as amostras foram recolhidas de acordo com protocolo clínico padrão. As amostras de sangue não-anticoagulados foram recolhidos na manhã antes do pequeno-almoço e dadores tinham deixado coagular à temperatura ambiente durante duas horas, e centrifugada a 1500-2000 rpm durante 15 min. Os soros foram transferidas para criotubos de quatro, e armazenado congelado a -80 ° C até à sua utilização. Para as experiências de reprodutibilidade, os soros a partir de amostras de sangue de 10 voluntários saudáveis ​​foram reunidas como soros de controlo de qualidade. Quando soro chegou no laboratório de espectrometria de massa (MS), cada um criotubo de amostra foi descongelada em gelo e utilizados para gerar dez alíquotas mais pequenas (20 mL cada) em tubos de micro-Eppendorf e armazenou-se a -80 ° C até à sua utilização. Cada amostra de soro foi, assim, congeladas e descongeladas duas vezes, antes de ser sujeita a extracção de péptidos e análise por MS.

extracção péptido esferas magnéticas cobre quelado e MALDI-TOF-MS (Espectrometria de Massa)

contas magnéticas de cobre quelado preparados no nosso laboratório foram utilizados para extrair péptidos de soro. Uma alíquota de 5 ul de uma solução esferas magnéticas homogénea foi transferida para um tubo de PCR de paredes finas de 0,2 mL, e foi adicionado 50 uL de solução de ligação e misturou-se homogeneamente. Os tubos foram colocados num separador de esférulas magnéticas (MBS) para fixar as esferas magnéticas, e o sobrenadante foi aspirado. Após a etapa de ligação, foi adicionada solução de ligação 20 mL e misturou-se a técnica de PCR-tubo. Em seguida, foram adicionados 5 uL de soro de amostra, misturado e, em seguida, colocados no dispositivo de MBS. O sobrenadante foi aspirado, e 100 uL da solução de lavagem foi adicionado e misturado com as esferas magnéticas. Após o passo de lavagem final, péptidos ligados foram eluídos por incubação da solução de eluição de 20 uL durante 10 min antes de se recolher a solução de eluição utilizando o dispositivo de MBS. 1 mL de eluente foi misturado com 1 ul de matriz solução (HCCA). 1 mL foi flagrado em um 600 mm de diâmetro, tamanho do ponto 384 MTP placa alvo (Bruker Daltonik) e deixa-se secar. O padrão de calibração de péptidos e proteínas (1 mL) da mesma matriz foi aplicado para segmentar pontos na proximidade das amostras de soro para a calibração externa do instrumento. As amostras processadas foram analisadas por um forro espectrómetro de massa MALDI-TOF /TOF (Bruker Daltonics Ultraflex;) equipado com uma fonte de iões de extracção pulsada. O sistema de MALDI-TOF-MS foi controlado por um software de controle v.2.0 Flex (Bruker Daltonics). A ionização foi conseguida por irradiação com um laser de azoto (337 nm), operando a 4 Hz. Os iões foram aceleradas a 20 kV com 250 ns de atraso extracção de iões pulsado. Cada espectro foi detectado em modo positivo e linear foi calibrados externamente utilizando uma mistura de padrões de péptido /proteína entre 1000 e 10000 Da.

Péptido sequenciação

FT-ICR espectrómetro de massa em tandem (Bruker Daltonics) está equipado com um sistema de HPLC 9.4 T magneto supercondutor e nano. Utilizou-se fonte de nanoESI equipado com um sistema de pulverização fora de eixo angular no modo de ião positivo. A tensão aplicada à entrada do capilar revestido com metal da fonte de electropulverização foi ajustada entre-1200 -1600 V e V. Os péptidos extraídos foram dessalinizadas e sequenciado pelo modo de autoMSn com MS /MS função de reforço. O Q FTMS foi criada para fazer a varredura MS /MS. O íon selecionado foi fragmentado por dissociação induzida por colisão (CID). Todos os espectros de massa foram adquiridos no modo de banda larga na faixa de massa de m /z 300-3000 com 512 k pontos de dados. Os espectros foram calibrados externamente com Agilent ES mix tuning (número de catálogo G2421A, Palo Alto, CA) pela calibração de quatro pontos. O instrumento foi controlado usando o software Apex 1.0 e os dados foram analisados ​​por 3,4 A análise dos dados. (Bruker Daltonics). Todos os dados MS /MS em uma corrida foram deconvoluídos e depois transferida para um arquivo (.mgf), e foram introduzidos no Mascot motor de busca (www.matrixscience.com). tolerância da massa dos péptidos foi fixado em 10 ppm, fragmento ion tolerância de massa foi de 0,01, eo tipo de massa de péptido pai e fragmento de péptido foram fixados em monoisotópico.

Processamento de sinal

Spectra foram convertidos em supere formato de arquivo incluído m valor /z e intensidades de sinal utilizando o software FlexAnalysis 2.0. Cada espectro foi suavizada curva, subtracção da linha de base e rotulagem de pico. Todos os picos de espectros qualificados massa (razão 5) com índices de massa-carga (m /z) entre 1000 e 10000 Dalton foram compilados rotulados. Todas as intensidades de pico foram normalizadas para a corrente total de iões de m /z e todos os espectros foram então levado para o alinhamento. Nós normalizada e alinhada picos de espectros distintos usando nosso software MatchPeaks. Alinhamento começa com o primeiro pico de [cuja proporção de massa para carga (m /z) é representado pelo símbolo X] como uma “âncora”. Se outro pico tem m /z = Y, nós definimos o erro massa relativa para ser | X _ Y | /X. O software identifica dois picos se o erro relativo é massa 0,3%. Após a normalização e alinhamento, listas de pico foram então finalmente resolvido usando a resolução dos picos e uma planilha foi criada para posterior análise estatística.

Classificação

SIMCA P + ™ software, desenvolvido em Umetrics, foi também usado para visualização e análise estatística diferentes grupos etários de 500 indivíduos saudáveis. Após o processamento de sinal, um visualizador gráfico para espectros em formato Excel. O software SIMCA P + começar a analisar dados usando o algoritmo estatístico, Princípio da Análise de Componentes (PCA), por mínimos quadrados parciais (PLS) e Correção Orthoganal Signal (OSC) e depois exportar Mass Spectra Viewer, uma interface visual para processados ​​espectrais de dados, parcelas. Finalmente, neste trabalho, analisamos todos os dados usando uma abordagem quimiométrica simples chamado parcial Menos Squares- Análise Discriminante (PLS-DA)

Resultados

soro peptídicas perfilar

O soro perfil de péptidos de ligação a esférulas magnéticas de cobre quelado foi detectada utilizando MALDI-TOF (Figura 1A) e exibida de acordo com a massa: razão de carga (m /z) (Figura 1B). A manipulação da amostra após a coleta foi uniforme, envolvendo 2 ciclos de congelamento e descongelamento para armazenar e amostras de alíquotas para a extração de peptídeo e análise MS. Os péptidos foram extraídos em contas magnéticas de cobre quelado, e lavaram-se, eluiu-se, misturado com uma matriz, depositados e na placa alvo de MALDI, seguido de análise de MALDI-TOF MS. A reprodutibilidade do sistema foi determinada pela primeira vez no que diz respeito às intensidades relativas dos picos (Figura 1B). Amostras de 500 indivíduos saudáveis ​​de várias idades foram distribuídos aleatoriamente durante o processamento e análise. Após os espectros foram processados ​​alinhados, os dados para cada amostra foram analisados ​​estatisticamente. perfis de péptido para todas as amostras foram analisadas utilizando os Partial Least-Squares (PLS) algoritmo (Figura 1A) contida no pacote de software SIMCA P +. O coeficiente de variação (CV) para a intensidade de pico foi calculada usando 10 picos escolhidos aleatoriamente com um sinal de ruído: 5 e m /z 1-10 kDa que representam péptidos de baixo, médio e alto peso molecular. turnos massa máxima ao longo do intervalo de 1-10 kDa, foram de 0,012% para a mistura de péptidos de calibração e 0,018% para a amostra de soro reunido. Estes resultados correlacionam-se com uma variação de 1da no deslocamento de massa absoluta para os sinais 3000 Da. O prazo-dia (Figura 1B, Tabela S4) e entre-dia (Tabela S4) currículos para análise MS direta dos peptídeos foram ambos. 15%

(A) visão geral Study. O diagrama mostra o desenho do estudo demográfico peptidoma soro saudável, ea abordagem de análise estatística utilizada para diferentes grupos etários e sexo. (B) Exemplo de intra-ensaio reprodutibilidade dos espectros de massa. O soro de uma amostra saudável agrupada (10 indivíduos) foi preparado com a extração do grânulo magnético cobre-quelato. Seis em um dia seleccionados aleatoriamente espectros obtidos por MALDI-TOF MS e espectros de gel de pseudo utilizado na análise. A gama /z análise m é de 1 KD e 10 KD. distribuição (C) Idade de 500 indivíduos saudáveis. Os campos coloridos indicam a cinco grupos de idade utilizados ao longo deste estudo. As linhas horizontais pretas representam medianas para cada coorte. (D) Distribuição de 65 peptídeos com seu peso molecular varia.

peptidoma Serum variabilidade

Para avaliar a diversidade peptidoma soro e os possíveis efeitos dos principais parâmetros demográficos como sexo e idade em profiling peptídeo soro, coletamos sangue de 500 voluntários saudáveis ​​e preparadas as amostras usando um protocolo clínico padrão. Os voluntários foram selecionados para o estudo para produzir cinco faixas etárias: 20-30 anos (61 mulheres e 22 homens), 30-40 anos (68 mulheres e 52 homens), 40-50 anos (78 mulheres e 92 homens) , 50-60 anos de idade (48 mulheres e 56 homens), e acima de 60 anos (13 mulheres e 10 homens) (Figura 1C). perfis de péptidos com motivos de soro quelantes semelhantes foram recuperados simultaneamente afinidade. Foram analisados ​​os perfis gerais de péptidos de todas as amostras. Embora os perfis de péptido variou individualmente, 65 peptídeos foram detectados numa frequência de mais de 20% na população saudável, e a sua m /z e frequência de ocorrência são listados na Figura 2. A maior parte dos picos seleccionados correspondeu a péptidos com molecular massa inferior a 5000 Da (Figura 1D)

m /z (massa: razão de carga). indica protonada médio peso molecular (m + H) linear em MALDI-TOF-MS. Vermelho: a freqüência zero em cancros; Verde: frequência de 20%; Azul: 20-50% da frequência; Grey: 50%

Para investigar se os 65 peptídeos representou o padrão de péptidos do soro de uma população saudável, analisamos também a frequência de ocorrência dos 65 peptídeos em soros de mama (n = 84. ), pulmão (n = 70), e rectal (n = 30) doentes com cancro. Os nossos resultados mostraram que a maioria dos 65 péptidos foram detectados em pacientes de cancro com uma frequência que foi significativamente diferente da população saudável (Figura 2). Ele sugere que os 65 peptídeos podem ser desenvolvidas em uma assinatura para indivíduos saudáveis ​​e fornecer uma referência para definir os padrões de peptídeos específicos do cancro. Por outro lado, descobrimos 3 séries de 10 peptídeos distintos com uma frequência elevada nos três cancros diferentes, respectivamente (Figura 3), e descobriu que eles não tinham sido observadas na população saudável (Figura 2).

asterisco vermelho: ocorrência em três cancros com 20% de frequência; asterisco azul:. ocorrência em dois dos três tipos de câncer com 20% de frequência

A variabilidade peptídeo soro associado ao género foi insignificante nas 500 amostras (Figura 4A), exceto no grupo de 20 -30 anos de idade. Na faixa etária de 20-30, os cinco primeiros componentes PLS tinha um R

2 valor de 0,82. Com o aumento da idade, a variabilidade de gênero tornou-se menor, e os cinco primeiros componentes PLS tinha R

2 valores inferiores a 0,5. Nosso estudo também mostrou variação desprezível associada à idade em comparações entre a maioria dos grupos. Figura 4B contém gráficos de dispersão 3D dos três primeiros componentes PLS de cada par de grupos etários. Uma diferença significativa apareceu apenas no emparelhamento entre os grupos de 20-30 e 60-80 anos de idade, onde os cinco primeiros componentes PLS tiveram um R

2 valor de 0,64. Em geral, quanto mais próximo dois grupos etários foram, menor a variabilidade (Figura 4B).

(A) gráficos de dispersão 3D de análise PLS nos perfis de peptídeos de soro derivadas do sexo masculino (azul) e do sexo feminino doadores (vermelho) com diferentes faixas etárias. parcelas (B) de dispersão 3D de análise PLS sobre a variação relacionada com a idade de perfis de peptídeos de soro.

peptídeo Serum identificação

Para obter identificações peptídicas confiança mais elevados, nós empregamos um híbrido FT- ICR MS /MS com um magneto supercondutor e nano-HPLC sistema de 9,4 T para adquirir medições de massa precisas (dentro de 2 ppm). Dos péptidos a partir de indivíduos saudáveis ​​e os três grupos de pacientes com cancro, 111 foram positivamente identificados por pesquisas de banco de dados usando MASCOT (Tabela 1). Note-se que os valores de m /z listados na Tabela 1 são valores médios e isotópicas monoisotópico + H [M + H] (consistente com os resultados obtidos com MALDI). A Figura 5 representa um exemplo típico dos dados obtidos para o péptido SSSYSKQFTSSTSYNRGDSTFESKSY (Fibrinogénio α), o qual foi identificado como um ião de triplo-carregada com uma precisão de 0,3 ppm em massa. Os 111 péptidos foram derivados a partir de 20 proteínas séricas que ocorrem naturalmente, incluindo α Fibrinopeptide (FPA), ITIH4 e C3F. Curiosamente, todos, mas alguns sequências de péptidos agrupados em conjuntos de fragmentos alinhados dentro de cada grupo em qualquer C ou N terminal e com truncagens escada-like nas extremidades opostas sobrepostas. As atribuições de sequência ou tiveram pontuação acima da soleira ou foram inequivocamente atribuído como a massa do ião precursor, e selecionou massas de iões de fragmento (y ou b) correspondeu a um degrau particular na escada.

(A) cromatograma pico de base ion péptidos de soro. A seta indica o pico incluindo o péptido tripla carregada a m /z 977,7690 (B) espectro de massa do pico cromatografia iónica indicada em (A), o diamante indica o ião precursor a m /z 977,7690. O inserto é uma vista ampliada do ião precursor mostrando um ião triplo carregada a alta precisão de massa (0,3 ppm). espectro de massa (C) o péptido em tandem de triplo-carregada a m /z 977,7690 com sequência de aminoácidos deduzida a partir da série de iões y. Note-se que os iões y originam no terminal C e, portanto, a sequência lê para trás.

Discussão

Serum diversidade peptidoma contém uma rica variedade de informações de diagnóstico específico da doença. A composição do peptidoma soro é um espelho verdadeiro da função celular e sistema de órgãos em curso. Embora isto signifique que os subconjuntos do peptidoma soro pode potencialmente refletir eventos de doença subtis em pequenos volumes de tecido, isto também significa que a peptidoma está constantemente a flutuar em resposta a eventos fisiológicos diárias em curso [1], [22]. Oncologistas e químicos clínicos temem que o nível de peptídeos individuais podem ser muito influenciados por vários fatores epidemiológicos não relacionados com a doença e condições fisiológicas normais. Variações em indivíduos normais e também existem provavelmente contribuem para a dificuldade na identificação de sinais específicos de doença em perfis de péptido no soro. Assim, como acontece com qualquer descoberta de biomarcadores, grande cuidado é necessário para reduzir viés. Ao fazer isso, um grande número de indivíduos saudáveis ​​deve ser medido para definir um perfil peptídico soro saudável. Nós desenvolvemos uma plataforma única para estudar um grande grupo de amostras de forma idêntica recolhidos e processados ​​a partir de 500 homens e mulheres saudáveis ​​com idade entre 20 a 80 anos. Uma análise extensiva dos dados MALDI-TOF MS sugeriu uma contribuição negligenciável género ao soro padrões de peptídeos em todas, mas aquelas de 20-30 anos de idade. Nossos resultados mostraram, ainda, que houve uma diferença significativa na composição de péptido apenas no emparelhamento entre os grupos etários 20-30 e 60-80 anos de idade,. Além disso, a variabilidade diminuiu com grupos tornaram-se mais perto da idade.

Idade e sexo são as principais fontes potenciais de viés que pode afetar os padrões moleculares sendo avaliado para o utilitário de diagnóstico e prognóstico. perfis de peptídeos de soro são afetados por variações na expressão gênica e eventos pós-transcricional. Recentemente, Villanueva relatou diferenças insignificantes nos padrões séricos entre diferentes grupos etários, mas dividiu seus dados em faixas etárias de 20-35, 35-50 e 50-80 anos (20). Em nossos experimentos, os grupos etários foram divididos em grupos de 10 anos, exceto acima de 60 anos, e as comparações produziu resultados consistentes para todos os grupos, exceto aqueles entre 20-30 e acima de 60 anos de idade. Em consonância com o relatório do Villanueva, foram observadas variações relacionadas com o género de perfis de soro em indivíduos saudáveis ​​apenas nos 20-30 anos de idade. Desde o pulmão, mama e pacientes com câncer retal em nosso estudo eram predominantemente 40 anos ou mais, idade e sexo não são susceptíveis de influenciar os perfis séricos de câncer. No entanto, a idade e as variações relacionadas com o género deve ser considerado quando estudos envolvem pacientes com câncer com menos de 30 anos de idade.

Outras fontes potenciais de viés incluiu a coleta de amostras, processamento e armazenamento, detecção de MS, e os métodos de análise de dados. Estas fontes foram examinados em estudos anteriores e corrigidas em nossos experimentos. fontes criticamente importantes de variação incluem tubos de sangue recolha, tempos de coagulação e temperatura, e o número de ciclos de congelamento e descongelamento. Outras fontes incluem lote inconsistência-a lote das esferas magnéticas, cristalização amostra MALDI e nível de irradiação do laser [17], [23], [24]. Além disso, os procedimentos de controle de qualidade cuidadoso assegurado extração de peptídeo constante e as condições de detecção de MS. O reagente grânulo magnético preparado em nosso laboratório mostraram uma variação insignificante entre lotes. A alta sensibilidade e reprodutibilidade da plataforma baseada em magnética talão para criação de perfis de soro, que foi defendida por um estudo recente do Villanueva et al, também foram obtidos em nosso estudo [14] -. [16], [18]

os péptidos conhecidos por variar, naturalmente, com uma incidência elevada (por exemplo, os 65 péptidos observados em mais de 20% da coorte saudável na Figura 2) pode ser eliminado como marcadores de diagnóstico ou mais rigorosamente controlado para variantes originais específicos para a doença. Em contraste, peptídeos encontrados para variar em uma freqüência baixa são de maior interesse para os esforços de descoberta de biomarcadores. Observamos 3 conjuntos de assinaturas, cada um contendo 10 discriminando peptídeos. Cada conjunto de 10 péptidos foi fortemente associado a um cancro particular e não estava presente no perfil de soro padrão da população saudável. Acreditamos que a abordagem e os resultados descritos neste relatório irá adicionar à compreensão da diversidade peptídeo soro e têm aplicações subseqüentes em proteômica clínicos.

As identidades de ambos os peptidomes soro normais e os péptidos que compreendem os íons discriminatórias pode potencialmente levar a insights sobre as suas origens e relações com a fisiologia subjacente e patologia. Apesar de avanços na MS agora tornam possível identificar pequenas e peptídeos médias no soro utilizando apenas microlitros de volume de amostras, esta tecnologia continua a ser uma barreira significativa para a aplicação a proteômica clínicos. A identificação directa de péptidos em soro digerido-tríptica continua a ser difícil por causa da complexidade das amostras. A identificação directa de MS /MS dos ptidos utilizando MALDI TOF /TOF não é possível devido à presença de vários péptidos, mesmo em pequenas janelas de massa. Embora desligada nanoLC-MALDI poderia resolver este problema, pensamos que o melhor método para identificar peptídeos em misturas complexas é transformada de Fourier MS (FT-MS), em que a massa exata do peptídeo de interesse é obtido [25] – [27 ]. Usando estratégias de FT-MS e de enriquecimento para caracterizar a região de baixo peso molecular do proteoma, identificámos 111 péptidos, incluindo péptidos 20 com frequência de 20% em soros saudável (Figura 2, Figura 3 e Tabela 1), 6 íons discriminatórias para o cancro do pulmão, 4 para o cancro rectal, e 8 para o cancro da mama (Figura 3 e Tabela 1).

Villanueva et ai. informou que a identificação de sequência de 61 peptídeos assinatura revelou que eles se dividem em vários clusters apertados, ea maioria são gerados por atividades exopeptidase que conferem câncer diferenças específicas do tipo [2]. Os peptídeos de soro empregados como assinaturas de câncer não são marcadores clássicos, mas eles podem servir como uma piscina substrato endógeno para os biomarcadores reais, isto é, proteases. Porque eles não são liberados por cânceres, eles provavelmente representam um epifenômeno não específica associada com a presença de câncer [1], [2], [23]. Demonstrou-se que a maioria dos péptidos identificados em ambos os indivíduos saudáveis ​​e pacientes com cancro foram agrupados em conjuntos de fragmentos alinhados com truncagens escada semelhante a sobreposição; mais exopeptidase são produtos de proteínas residentes no soro. Como peptídeo profiling pode contribuir mecanicamente para ambas as classificações específicas do tipo específico de câncer e câncer permanece sem explicação e pode exigir uma grande quantidade de estudos futuros para entender. No entanto, as diferenças são estatisticamente significativas, segurando uma informação importante que pode ter utilidade clínica direta como biomarcadores substitutos na forma de proteoma produtos metabolômica. Acreditamos que os padrões de degradação proteolítica na peptidoma soro de ambos os pacientes com câncer e controles saudáveis ​​dispor de informações importantes para a definição de perfis de peptídeos específicos do cancro que podem ter utilidade clínica direta como biomarcadores substitutos.

Informações de Suporte

Tabela S1 . .

Cancro da mama dados demográficos do paciente

doi: 10.1371 /journal.pone.0063724.s001

(DOC)

Tabela S2. câncer retal

dados demográficos do paciente

doi: 10.1371. /journal.pone.0063724.s002

(DOC)

Tabela S3. cancro do pulmão de células não pequenas

dados demográficos do paciente

doi: 10.1371. /journal.pone.0063724.s003

(DOC)

Tabela S4.

Reprodutibilidade dos espectros de massa perfilado por contas de cobre-quelatados e análise MALDI-TOF

doi:. 10.1371 /journal.pone.0063724.s004

(DOC)