Abstract

A inibição da carcinogênese pode ser uma consequência da atenuação do estresse oxidativo por meio da ativação do sistema de defesa antioxidante, recuperação e estabilização de proteínas supressoras de tumor juntamente com modulação de mediadores inflamatórios. Anteriormente, foram delineadas papel significativo de curcumina durante o seu efeito a longo prazo na regulação da via glicolítica e angiogénese, que por sua vez resulta na prevenção do cancro através da modulação de tensão genes activados. O presente estudo foi desenhado para investigar efeitos de longo prazo da curcumina na regulação das enzimas antioxidantes Nrf2 mediadas fase-II, tumor supressor p53 e inflamação sob microambiente do tumor oxidativo no fígado de ratos linfoma de células T de rolamento. A inibição da sinalização do Nrf2 observada durante a progressão do linfoma, resultou na regulação para baixo da fase II enzimas antioxidantes, p53, bem como a activação de sinais inflamatórios. Curcumina potenciada aumento significativo na activação de Nrf2. Ele restaurou a atividade de enzimas antioxidantes de fase II como GST, GR, NQO1 e nível de p53 supressor de tumor. Além disso, a curcumina modulado inflamação através de regulação positiva de TGF-β e regulação recíproca de iNOS e COX2. O estudo sugere que, durante a efeito a longo prazo, a curcumina leva a prevenção do cancro através da indução de enzimas antioxidantes fase-II através da activação de Nrf2 sinalização, restauração do gene supressor tumoral p53 e modulação de mediadores inflamatórios como iNOS e COX2 no fígado de ratinhos linfoma rolamento.

Citation: das L, Vinayak M (2015) Long Term Efeito da curcumina em Restauração de tumor p53 supressor e Fase-II enzimas antioxidantes através da activação de Nrf2 Sinalização e modulação da inflamação na Prevenção do Câncer. PLoS ONE 10 (4): e0124000. doi: 10.1371 /journal.pone.0124000

Editor do Academic: Gautam Sethi, Yong Loo Lin Faculdade de Medicina da Universidade Nacional de Cingapura, Cingapura

Recebido: 03 de dezembro de 2014; Aceito: 24 de fevereiro de 2015; Publicação: 10 de abril de 2015

Direitos de autor: © 2015 Das, Vinayak. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o trabalho foi apoiada por doações do Departamento de Ciência e Tecnologia (Grant No.-SR /S0 /aS-97/2007), Governo da Índia a MV. O financiador não teve nenhum papel no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

factor nuclear factor relacionado com E2 2 (Nrf2) é um factor de transcrição essencial que se liga à região promotora de um número de genes que codificam enzimas antioxidantes fase-II [1]. Nrf2 está correlacionada com o processo de desintoxicação de rotina e o aumento da sua expressão tenha sido descrita em fígado de murino, intestino, renal e do pulmão. Existe uma alta similaridade entre Nrf2 sequência de ligação (NF-E2 sequência de consenso) e elemento de resposta antioxidante (ARE), que são elementos reguladores na região promotora de enzimas antioxidantes fase-II como GST e de NQO1. GST tem um papel protector contra processos oxidativos e desempenha um papel crucial na desintoxicação de vários xenobióticos em células malignas ou tecidos. GST também exibe várias funções não catalíticos como o transporte intracelular de um vasto espectro de ligandos hidrófobos e a modulação da via de transdução de sinal que conduz a sequestrante de carcinogéneos [2]. NQO1 é um flavoproteína citosólica, expressa de forma constitutiva em uma ampla gama de tecidos de mamífero e linhas celulares. Ela catalisa a redução de dois elétrons de vários contaminantes eletrofílicos ambientais e compostos endógenos, impede a geração de ROS, elimina os radicais de oxigênio e, portanto, mostra um papel direto na proteção contra o estresse oxidativo. NQO1 regula a estabilidade de p53 em resposta ao stress oxidativo [3]. Tumor supressor p53 restringe células anormais por indução de parada do crescimento /apoptose desencadeante. p53 também mostra propriedade antioxidante que protege o genoma da oxidação por ROS, que é uma das principais causas de danos no ADN e instabilidade genética que conduz à transformação oncogénica [4, 5]. Nrf2 é crítica para a manutenção da glutationa (GSH) estado redox por meio de regulação da transcrição de GR [6]. GSH é um tiol intracelular predominante contendo antioxidante no fígado. Ele exibe funções versáteis, como a regulação da expressão do gene, a apoptose e a defesa antioxidante no sentido modulação da proliferação celular. células cancerosas deficientes em p53 são relatados para exibem menor indução de genes alvo Nrf2 em comparação com células proficientes p53, o que sugere o papel importante de p53 na activação de células cancerosas em Nrf2 [7].

p53 de tipo selvagem e TGF- β são supressores tumorais chave que regulam uma variedade de respostas celulares. p53 interage fisicamente com Smads e coordenadamente induz a transcrição de vários genes supressores de tumor chave [8]. TGF-beta actua como um factor anti proliferativa em estágios iniciais de câncer e regula ciclo celular via genes alvo a jusante envolvidos na condução de proliferação celular [9, 10]. Ela induz a apoptose em células de linfoma humano e suprime a inflamação [11, 12, 13]. Promoção da inflamação é regulada por COX2 através da síntese de PGE2 em vários tecidos. Expressão de COX2, bem como a produção de PGE2 é regulada por TGF-β1 [14, 15, 16]. COX2 é muitas vezes co-expressos com iNOS e ambos estão envolvidos na progressão do cancro pela regulação da proliferação, apoptose e angiogese etc iNOS desempenha um papel fundamental na mediação da inflamação através de óxido nítrico (NO) biossíntese, que por sua vez modula a expressão de COX2 e a síntese de PGE2 na condição inflamatória [17]. Moderadamente aumento do nível de expressão de iNOS promove o crescimento do tumor, enquanto que novo aumento no nível é relatado para ser citotóxica para células tumorais, assim iNOS mostra duplo papel durante o desenvolvimento de tumores [18]. Fígado é relatada a possuir uma propriedade peculiar onde as células tumorais induzem endógena liberação de NO via regulação positiva de iNOS, levando à morte de células tumorais sinusoidal e reduziu metástases hepáticas [19]. Sendo um importante metabólico e desintoxicação órgão do corpo, o fígado tem papel ativo no sistema anti defesa oxidativo e é muito afectado no cancro avançado. Metástases e neoplasia maligna foi confirmado anteriormente no fígado de rolamento linfoma de Dalton (DL) ratos [20].

O uso de todo o extrato de fonte de ervas ou componente single-isolado ou um metabolito de um componente isolado, para alcançar benefícios de saúde desejáveis ​​tem sido um problema dos últimos anos. A curcumina, um fitoquímico polifenólica é relatado para inibir a carcinogénese induzida quimicamente em múltiplos locais de órgão em vários modelos animais. rápido metabolismo e eliminação são os principais factores de baixa biodisponibilidade da curcumina a nível dos tecidos, independentemente da via de administração, apesar de metabolitos de curcumina permanecer por mais tempo em diferentes tecidos. No entanto, o efeito a longo prazo da curcumina, após a retirada da administração ainda está para ser relatado. Não está claro se a ação anti-cancerígeno da curcumina é devido ao efeito cumulativo de seus metabólitos ou devido a própria curcumina. Além disso, evidencia-se que o consumo de extratos de alimentos inteiros ou parcialmente purificadas é mais benéfico ao longo do componente single-isolado devido à existência de interacções sinérgicas entre os fitoquímicos em alimentos integrais [20, 21]. Anteriormente, relataram que a acção anti-carcinogênico de curcumina durante o seu efeito a longo termo é mediada através da regulação da via glicolítica e angiogénese, como resultado da sequência de modulação de genes do stress activada [20]. O presente estudo foi concebido para investigar efeito a longo prazo da curcumina na regulação do Nrf2 mediada enzimas antioxidantes de fase II, supressor de tumor p53 e inflamação sob microambiente do tumor oxidativo no fígado metastático de ratos portadores de linfoma de Dalton.

Materiais e Métodos

Chemicals

Todos os produtos químicos eram de grau analítico e molecular biologia, bem como livre de endotoxinas, e utilizado sem mais purificação. A curcumina, reagentes de isolamento de ARN, polimerase Taq, PMSF, menadiona, Sephadex G50 e actina anticorpo conjugado com HRP anti-β foram adquiridos a partir de Sigma Aldrich. Transcriptase reversa, ribonuclease Inhibitor, iniciadores aleatórios (hexâmeros), 100 pb Além disso escada de DNA e enzima Klenow de Fermentase Life Science e DNA-Free

Kit TM TURBO I foram adquiridos da Ambion. iniciadores específicos de gene para RT-PCR foram sintetizados a partir Metabion. p53 anticorpo anti-rato a partir Imgenix, anti-rato iNOS e COX2 anticorpo do anticorpo secundário anti-coelho de cabra Cayman e HRP conjugado de Bangalore Genie. Radiomarcado α

32 P-dCTP de Conselho de radiação e Tecnologia Isotope (BRIT) e ECL (Kit de sinal Super) foi comprado de PIERCE Biotecnologia HYSEL India Pvt. Ltd.

Animais e indução de células T do linfoma (linfoma de Dalton)

Mice (

Mus musculus

, AKR estirpe) foram criados e mantidos sob condições de laboratório padrão com adequada humana cuidado, conforme as orientações do comitê de ética animais institucional, a 25 ± 2 ° C sob 12 horas de luz /12 h cronograma escura e equipados com ratos padrão alimentar, água potável

ad libitum

. Todos os experimentos com animais foram realizados com a aprovação do Comitê de Ética Institucional Animal, Universidade Banaras Hindu. ratos machos adultos saudáveis ​​(30 ± 2 g, 16-20 semanas de idade) foram utilizados no trabalho experimental. células de ascite de linfoma de Dalton foram transplantadas em ratinhos adultos do sexo masculino através de injecção intraperitoneal (i.p.) o transplante em série, tal como descrito anteriormente [20]. células ascite linfoma de Dalton foram dotados pelo Prof. Ajit Sodhi, Escola Superior de Biotecnologia da Universidade Hindu de Banaras, Varanasi, na Índia. linfoma de Dalton é um linfoma de célula T transplantáveis ​​não-Hodgkin murino, originado na glândula timo de DBA 2 mouse /pelo National Cancer Institute, Bethesda, MD, em 1947. [22].

Desenvolvimento de DL foi confirmada pelo inchaço abdominal e aumento do peso corporal, que eram visíveis claramente na pós-transplante 10-11 dia e ratos DL sobreviveu por 20 ± 2 dias. Crescimento do linfoma de Dalton não mostraram qualquer mudança importante no peso corporal e ascite acúmulo de líquido durante os primeiros 7-9 dias a partir de próximo dia do transplante DL (S1 Fig). Assim primeiros 7-9 dias pode ser comparado com o de preparação de fase lag-phase /da curva sigmóide de crescimento da população de células ascite. Portanto, a programação do tratamento curcumina para ratos DL foi selecionado de acordo para 9 dias a partir de próximo dia do transplante e ratos DL foram sacrificados no dia 18 de pós-transplante DL (antes de ratos DL morre naturalmente) para obter o efeito a longo prazo da curcumina. Se a curcumina é administrado através i.v /i.p, é metabolizado em dihydrocurcumin, tetra-hidrocurcumina, hexahydrocurcumin e hexahydrocurcuminol. A curcumina está prevista para ser completamente metabolizado para os seus metabolitos nos últimos 9 dias após o tratamento. Assim, o efeito não deve ser devido ao efeito direto da curcumina, mas pode ser devido a metabolitos da curcumina [20].

Calendários de tratamento curcumina para ratos DL e coleta de tecido

Seis grupos de os ratinhos foram tomadas com 6 ratos em cada grupo (n = 6) e curcumina tratamento a ratinhos DL foi programado como descrito anteriormente [20]. Todos os ratinhos foram sacrificados no dia 18 de pós-transplante DL (para evitar a condição séptica antes ratinhos DL morrer devido a tumor) por humanamente eutanásia (luxação cervical após anestesiado; ratinhos foram expostos ao éter apresentadas em gaze de algodão interior de uma câmara pequena e concentração éter era aproximadamente 80μl /litro de volume do recipiente). Fígado foi excisado imediatamente após o sacrifício e lavou-se em solução salina normal gelada e o tecido de cada grupo (n = 6) foi reunido e picado assepticamente a 4 ° C durante resultado médio. O tecido foi usado imediatamente ou conservado a -80 ° C para estudo posterior.

electroforética ensaio de desvio de mobilidade (EMSA)

proteína nuclear foi extraída e a afinidade de ligação a sequências de Nrf2 foi determinado por mobilidade electroforética ensaio de desvio (EMSA), tal como descrito anteriormente [23, 24, 25]. As sondas oligonucleotídicas sintéticas purificadas correspondentes a NF-E2-sequência de consenso (5′-sentido TGGGGAACCTGTGCTGAGTCA-3 ‘, anti-sentido 5′-CTCCAGTGACTCAGCACAGGTTCC-3′ ou ARE-sequência de consenso (5’-sentido AGTCACAGTGACTCAGCAGAAT-3 ‘, anti-sentido 5’-AGATTCTGCTGAGTCACTGTGA -3 ‘) foram emparelhados, final marcado com [α-32P] CTP com Klenow enzima. a titulação para a especificidade e afinidade do oligonucleótido sintetizado de ligação correspondente a ARE e NFE2 elemento de ligação foram determinadas usando sonda não marcado como concorrente específico e poli-di /dC como competidor não específico, respectivamente. A intensidade do complexo no auto-radiograma foi fotografado e analisadas por varrimento densitométrico usando alfa da imagem Analyser System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).

isolamento de ARN e RT-PCR

isolamento de ARN, a síntese e amplificação de ADNc foram realizadas conforme descrito anteriormente genes [20, 23, 24, 25]. a expressão de Nrf2, isoenzimas de GST, GR, em NQO1, p53, TGF-β1, iNOS e COX2 foram estudadas por semi-quantitativo de RT-PCR utilizando ADNc sintetizado. Os pares de iniciadores apropriados (Tabela S1) foram utilizadas para reacções de PCR utilizando termociclador (Applied Biosystem). intensidade da banda dos produtos amplificados foi visualizado, fotografados e analisados ​​usando Gel Doc System (Alpha Innotech

CE) e os valores foram normalizados com β-actina como controlo interno.

ensaio de gel Atividade

actividade de GR e NQO1, bem como de actividades e isoenzimáticos padrões de GST foi medida por coloração na atividade gel. Não desnaturante análise PAGE de enzimas antioxidantes foi preferido ao longo de imunodetecção, porque a mudança na actividade de uma enzima está associada com alterações metabólicas e utiliza o método de detecção com base especificidade para o substrato de apenas uma parte activa das enzimas no mesmo gel. É considerada altamente relevante para correlacionar uma mudança no nível de uma isoenzima específica com a de alterações metabólicas em nível celular [20].

glutationa-S-transferase (GST).

A atividade gel foi realizada por PAGE não desnaturante, de acordo com o método de Ricci et ai. com pequenas modificações [26]. Igual quantidade de proteína de cada amostra foi separada por 10% PAGE não-desnaturante a 4 ° C. Gel foi incubado em tampão de fosfato de potássio 100 mM (pH 6,5) contendo 4,5 mm de GSH, 1 mM e 1 mM de CDNB NBT a 37 ° C durante 10-15 minutos, sob agitação suave. Então gel foi lavado em água e transferida para uma solução de 100 mM de Tris-Cl (pH 9,6) contendo 3 mM de PMS durante 3-5 min e iluminado a luz azul até aparecimento de bandas complexas formazen no gel. A intensidade da banda de diferentes isozimas foram visualizados, fotografados e analisados ​​utilizando Gel Doc System (Alpha Innotech

CE).

glutationa redutase (GR).

A coloração da GR atividade foi realizada de acordo com o método de Hou et al. [27]. Igual quantidade de proteína de cada amostra foi separada por 8% PAGE não-desnaturante a 4 ° C. Após a electroforese completa, o gel foi embebido em 50 mM de Tris-Cl (pH 7,9) contendo GSSG 4 mM, NADPH 1,5 mM e DTNB 2 mM durante 30 min à temperatura ambiente, lavou-se com 50 mM de Tris-Cl (pH 7,9) e transferidos a NBT 1,2 mm e 1,6 mm PMS. atividade de GR foi corada negativamente na escuridão durante 10-15 minutos à temperatura ambiente com agitação suave e, em seguida, expostos à luz até o aparecimento de zonas claras de banda atividade GR. O gel foi lavado em água para descoloração e intensidade da banda foi visualizada, fotografados e analisados ​​utilizando gel doe System (Alpha Innotech

CE)

NAD (P) H:.. Oxidoredutase de quinino (NQO1)

em gel de coloração de actividade de NQO1 foi realizado como descrito por Wrobel et al. [28]. Igual quantidade de proteína de cada amostra foi separada por 10% PAGE não-desnaturante a 4 ° C. A seguir à electroforese, gel foi corado em 50 mM de Tris-Cl (pH 7,5), 0,3 mg /mL de MTT, NADH 1 mM e 30 pM de menadiona, com agitação suave até que a cor escura em desenvolve (10-15 min) nas áreas que têm de NQO1 atividade. A reacção foi parada através da transferência do gel para a (v /v) de solução a 5% de ácido acético. intensidade da banda foi visualizado, fotografados e analisados ​​utilizando Gel Doc System (Alpha Innotech

CE).

Estimativa do estado redox

glutationa total e glutationa reduzida foram determinados como sulfidrila total (T- SH) conteúdo e sulfidrila não protéico (NP-SH) de conteúdo, respectivamente, por meio do coeficiente de absorção molar de 13100 M

-1 cm

-1 e foram expressos em micro moles por mg de proteína [29]. estado redox foi calculado como uma proporção de NP-SH para o conteúdo sulfidrilo ligado à proteína (P-SH).

Western blotting

a mesma quantidade de proteína de cada amostra foi separada em SDS a 10% -Página e transferidos para a membrana de PVDF durante a noite a 4 ° C. Membrana foi bloqueada em leite sem gordura a 5% em PBS (pH 7,4) durante 2 h à TA. Blot foi incubada durante a noite a 4 ° C com p53 de coelho anti-rato (1: 500 de diluição, Imgenix) ou de coelho anti-rato de iNOS (diluição 1: 200, Cayman) ou coelho COX2 anti-ratinho (diluição de 1: 500, Cayman) em 1% de BSA e 0,05% de Tween-20 em PBS (pH 7,4). Membrana foi lavada e incubada com IgG de cabra conjugado com HRP anti-coelho (diluição 1: 2500, Bangalore Genei) em PBS (pH 7,4) contendo 1% de BSA e 0,05% de Tween-20 durante 2 h à TA. proteínas imunorreactivas foram detectadas com um kit sinal de super ECL (Pierce Biotechnology) em filme de raios-X. Os valores de densidade da banda foram normalizados com β-actina

óxido nítrico (NO) Ensaio

NO nível no fígado foi estimada usando o reagente de Griess.; 100 ul de homogeneizado de fígado foi misturada com 100 ul de reagente de Griess (0,1% de dicloridrato de naftiletilenodiamina, e 1% de sulfanilamida em ácido fosfórico a 5%), incubadas durante 10 min à temperatura ambiente e a absorvância foi medida a 540 nm com um leitor de placas (ECL ELISA Reader) . A concentração de NO foi determinada utilizando uma curva padrão, tendo gerado por quantidades conhecidas de nitrito de sódio e os valores foram expressos em termos de equivalência de NaNO2 ug /mg de proteína

A análise estatística

A análise estatística foi realizada pelo software SPSS usando o one-way ANOVA seguido pelo teste de Tucky. Os valores foram expressos em média ± S.E.M. obtida a partir de três diferentes conjuntos de experiências, p . 0,05 foi considerado como estatisticamente significativa (95% intervalo de confiança) em relação ao grupo N (#) e grupo DL + DMSO (*)

Resultados

Efeito da curcumina na ligação do Nrf2 com SÃO sequência de consenso

a especificidade e afinidade de ligação do oligonucleotídeo sintetizado correspondente ao elemento de resposta antioxidante (ARE sequência de consenso) foi validada. Titulação com sonda não marcada (sonda fria) como concorrente específico e com concorrente não específica (poli-DI /DC) confirmou especificidade e afinidade, respectivamente [Fig 1A e 1B]. A intensidade do complexo DNA-proteína específica (SE-Nrf2) obtido no DL e DL + DMSO ratinhos era de aproximadamente 60% e 56% dos ratinhos normais, respectivamente. Uma activação significativa e a translocação nuclear de Nrf2 foi induzida por tratamento curcumina até 148%, 164% e 143% dos ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Figura 1 (C)].

Efeito da curcumina sobre a atividade de ligação ao ADN de Nrf2 com as sequências de consenso. (A) Titulação com sonda não marcada como concorrente específico. (B) A titulação com poli-di /DC como competidor não específico. (C) autorradiograma mostrando Nrf2-SÃO complexo (D) varredura densitométrica da Nrf2-SÃO complexa. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de proteínas nucleares. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

Efeito da curcumina na ligação do Nrf2 com NF-E2 sequência de consenso

Titulação com sonda não marcada concorrente tão específico e poli-dI /dC como concorrente não específica confirmada especificidade e afinidade respectivamente [Fig 2A e 2B]. A intensidade do complexo DNA-proteína específica (NF-E2 com Nrf2) em ratinhos e DL DL + DMSO foi de aproximadamente 32% e 70% dos ratinhos normais, respectivamente. A intensidade do complexo foi encontrado para ser significativamente induzida com 100 mg de curcumina /kg de massa corporal, que era até cerca de 144% dos ratinhos DL + DMSO [Figura 2 (c)].

Efeito da curcumina na ligação de DNA actividade de Nrf2 com sequências de consenso NFE2. (A) Titulação com sonda não marcada como concorrente específico. (B) A titulação com poli-di /DC como competidor não específico. (C) autorradiograma mostrando Nrf2-NFE2 complexo (D) varredura densitométrica do complexo Nrf2-NFE2. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de proteínas nucleares. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

Efeito da curcumina na expressão de mRNA Nrf2

A expressão de Nrf2 foi regulada negativamente em camundongos DL e DL + DMSO até cerca de 63% e 73% dos camundongos normais respectivamente, o que foi significativamente-se regulada para o nível normal, o tratamento curcumina. A expressão de Nrf2 foi de 107%, 127% e 108% de DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Figura 3].

Efeito da curcumina na expressão de ARNm de Nrf2. (A) RT-PCR de Nrf2 e β-actina. (B) A observação densitométrica de Nrf2 após normalização com β-actina. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de ARN total. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

Efeito da curcumina na expressão do mRNA e atividade enzimática de GST isozimas

A expressão e atividade de cinco isozimas de GST ou seja GSTA, GSTM, SGPC, GSTt e GSTo foram observados no rato fígado, onde GSTA é encontrado como sendo o mais abundante isozima. Em comparação com os ratinhos normais, a expressão de GSTA, GSTM, GSTP, GSTt e GSTo foi regulada negativamente aproximadamente até 30%, 71%, 80%, 50% e 71% respectivamente em murganhos DL e cerca de 35%, 61%, 82% , 68%, e 76% respectivamente em murganhos DL + DMSO. Curcumina tratamento induziu expressão de cinco isozimas com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, em comparação com DL + DMSO, que foi como se segue-GSTA: 137%, 180%, 150%; GSTM: 117%, 110%, 125%; SGPC: 113%, 107%, 108%; GSTt: 102%, 122%, 115%; GSTo:. 107%, 108% e 102%, respectivamente [Fig 4 (A)]

Efeito da curcumina sobre a expressão actividade enzimática de isozimas de GST (A) RT-PCR de isozimas de GST e β-actina (B) digitalização densitométrica da GST isozimas após normalização com β-actina. (C) mostrando atividade coloração específica dos isozimas de GST. (D) de varredura densitométrica da banda de isozimas de GST atividade. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de RNA total e proteínas. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

As atividades de cinco isozimas de GST como GSTA, GSTM, SGPC, GSTt e GSTo não seguiu padrão de variação semelhante à de expressão. A actividade de GSTA, GSTM e GSTP foi reduzida em ratinhos DL e DL + DMSO, onde como GSTt e GSTo isozimas apresentaram actividade induzida em ratinhos DL e DL + DMSO, em comparação com ratinhos normais. A diminuição da actividade de GSTA: 46%, 41%; GSTM: 59%, 67% e GSTP: 35%, 21% em DL e DL + DMSO ratinhos, respectivamente, em comparação com ratinhos normais. No entanto, GSTt e isozimas GSTo mostrou induzida atividade até 172% e 123% em caso de GSTt e 145% e 126% em caso de GSTo respectivamente em ratos DL e DL + DMSO, em comparação com ratos normais. A curcumina modulada atividade de isoenzimas de GST para o nível normal. GSTA, GSTM e GSTP foram estimuladas diferencialmente com diferentes doses de tratamento a curcumina. Todas as doses de curcumina elevada a actividade de GSTA e GSTP. GSTA foi elevado até cerca de 132%, 155%, 143% e SGPC até cerca de 247%, 366%, 420% dos ratos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente. No entanto, a actividade de GSTM foi estimulada significativamente até 156%, 106%, com 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente. Diminuição da actividade de GSTt foi até cerca de 94%, 81%, com 50 e 100 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente, e GSTo até cerca de 75% com 50 mg de curcumina /kg de peso corporal, em comparação com ratinhos DL + DMSO [Figura 4 (C)] .

Efeito da curcumina na expressão do mRNA e atividade enzimática de GR

A expressão de GR no fígado de DL e ratos DL + DMSO foi regulada negativamente até cerca de 58% e 72% dos ratinhos normais respectivamente. Curcumina tratamento induziu expressão de GR de uma maneira dependente da dose. A regulação da expressão de GR por curcumina é de aproximadamente 118%, 129%, 134% dos ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente, [A Fig 5A e 5B]. A actividade de GR foi encontrado para ser diminuída em ratinhos DL e DL + DMSO até cerca de 69% e 70% dos ratinhos normais. Tratamento de curcumina elevou significativamente a actividade de GR até cerca de 126%, 136%, 109% dos ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Fig 5C e 5D].

Efeito da curcumina na expressão actividade enzimática de GR (A) RT-PCR de GR e β-actina (B) digitalização densitométrica de GR após normalização com β-actina. (C) mostrando atividade coloração específica de GR. (D) de varredura densitométrica da banda de GR atividade. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de RNA total e proteínas. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

redox estatuto

estado redox no fígado de ratos com linfoma rolamento foi medido em termos de redução da relação forma oxidada da glutationa (NP-SH /P-SH), como o estado redox é também um importante indicador de estresse oxidativo. O estado foi observado ser de 51% e 58% dos ratinhos normais em ratinhos DL e DL + DMSO respectivamente. Todas as três doses elevadas estado redox de forma significativa, o que era até cerca de 131%, 159% e 124% dos ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Figura 6].

Efeito da curcumina sobre o estado redox celular em termos de NP-SH /P-SH. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de proteínas totais. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

Efeito da curcumina na expressão do mRNA e atividade enzimática de

ratinhos portadores de NQO1

linfoma apresentaram reduzida expressão de fase II enzima antioxidante NQO1. A expressão foi regulada negativamente em camundongos DL e DL + DMSO até cerca de 66% e 77% dos ratos normais. Curcumina tratamento significativamente acima expressão regulada para o nível normal (95% do normal) com a dose de 100 mg de curcumina /kg de peso corporal. O aumento da expressão de NQO1 por curcumina foi de aproximadamente 104% e 123% dos ratinhos DL + DMSO com 50 e 100 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente, [A Fig 7A e 7B]. A actividade de NQO1, observada pelo ensaio de actividade de gel segue o padrão de variação da sua expressão. Verificou-se ser diminuída em ratinhos DL e DL + DMSO até cerca de 52% e 51% dos ratinhos normais, respectivamente. Curcumina tratamento com 100 e 150 mg /kg de peso corporal elevado a actividade de NQO1 significativamente, o que era aproximadamente até 134% e 115% de DL + DMSO ratinhos, respectivamente [Fig 7C e 7D].

Efeito da curcumina na ARNm expressão actividade enzimática de NQO1 (A) RT-PCR de NQO1 e β-actina (B) densitométrica de varrimento do ARNm de NQO1 após normalização com β-actina. (C) mostrando atividade coloração específica dos NQO1. (D) de varredura densitométrica da banda de NQO1 atividade. Fígado de todos os seis animais de cada grupo foram reunidos separadamente e utilizados para a extracção de RNA total e proteínas. Os dados representam ± médios S.E.M. # E * denota diferença significativa em comparação com N e grupo DL + DMSO respectivamente. Cur é curcumina e BW é o peso corporal. N, DL, DL + DMSO, DLT50, DLT100 e DLT150 representa normais, rolamento do linfoma de Dalton, linfoma de Dalton ratinhos portadores tratados com linfoma de DMSO e Dalton ratinhos tratados com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso do corpo foi dissolvido em DMSO, respectivamente rolamento.

Efeito da curcumina na expressão do mRNA e nível de proteína de p53

O p53 sendo uma proteína lábil, se degrada rapidamente sob estresse oxidativo. A expressão de mRNA de Trp53 (gene p53) foi encontrado para ser regulada negativamente em camundongos DL e DL + DMSO até cerca de 43% e 40% dos ratos normais. Todas as três doses de curcumina induzida expressão de Trp53 significativamente. A regulação para cima da expressão Trp53 era aproximadamente até 200%, 240% e 223% dos ratinhos DL + DMSO com 50, 100 e 150 mg de curcumina /kg de peso corporal, respectivamente [Figura 8A e 8B]. O nível de proteína supressor tumoral p53 segue padrão de variação semelhante de sua expressão. nível de proteína foi reduzida em caso de ratinhos DL e DL + DMSO até cerca de 47% e 50% dos ratinhos normais, respectivamente.