Sumário

O mecanismo de ligando (TRAIL) Resistência de indução de apoptose relacionada com o factor de necrose tumoral em células cancerosas não é totalmente compreendido. Aqui, mostramos que o percurso de sobrevivência Akt desempenha um papel importante na resistência TRAIL em células cancerosas humanas. Especificamente, verificou-se que o tratamento com TRAIL activa a via de sobrevivência de Akt e que a inibição desta via por o inibidor de PI3K LY294002 ou knockdown da Akt sensibiliza as células cancerosas resistentes a TRAIL. Desde Akt é regulada negativamente por o supressor de tumor PTEN, que examinaram a sensibilidade TRAIL em células epiteliais PTEN knockdown rato próstata e descobriram que PTEN

– /- células são mais resistentes do que PTEN

células + /+, enquanto a sensibilidade de PTEN

+/- células caiu no meio. Além disso, mostramos que a sobre-expressão de um mutante de PTEN confere resistência TRAIL em PTEN

+ /+ células, suportando um papel de PTEN em sensibilidade TRAIL. Em células T47D de mama resistentes a TRAIL, a sobre-expressão da PTEN mutante aumentou ainda mais a sua resistência a TRAIL. Tomados em conjunto, os nossos dados indicam que a inactivação de PTEN funcional e a consequente activação da via de Akt previne a apoptose induzida por TRAIL, conduzindo à resistência TRAIL. Portanto, nossos resultados sugerem que a resistência TRAIL pode ser superado pela segmentação PTEN ou a via de sobrevivência Akt em células cancerosas

Citation:. Xu J, Zhou JY, Wei WZ, Wu GS (2010) A ativação do Akt Survival Caminho contribui para a resistência TRAIL em células cancerosas. PLoS ONE 5 (4): e10226. doi: 10.1371 /journal.pone.0010226

editor: Dong-Jin Yan, da Universidade de Hong Kong, Hong Kong

Recebido: 22 de fevereiro de 2010; Aceito: 19 de março de 2010; Publicação: 19 de abril de 2010

Direitos de autor: © 2010 Xu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pela subvenção NIH /NCI R01 CA100073 e Programa de Câncer Departamento de Defesa mama W81XWH-07-1-05-21. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

TRAIL (ou Apo2L) é um membro da superfamília do fator de necrose tumoral que induz selectivamente apoptose em câncer, mas não células normais, tornando-se um agente atraente para terapia do câncer. TRAIL induz a apoptose através da activação dos seus receptores de morte DR4 (TRAIL-R2) e /ou DR5 (KILLER, TRAIL-R1, TRICK2) [1], [2], [3], [4]. Quando TRAIL se liga a DR4 e /ou receptores DR5, os receptores de morte tornar trimerizado e, em seguida recrutar a proteína adaptadora FADD (proteína Fas-associado ao domínio de morte) e procaspase 8 ou procaspase 10 para formar o DISC, levando a caspase 8 activação [1 ], [2]. caspase ativada 8 pode ativar diretamente as caspases efetoras 3, 6 e 7 para acionar apoptose ou indiretamente induz a apoptose através da via da apoptose mitocondrial caspase-induzida tBid 9 mediada [2], [4].

Apesar de TRAIL é um agente terapêutico muitas células cancerosas atraentes são resistentes a este agente [2]. Os mecanismos de resistência TRAIL não são completamente compreendidos, mas pode ocorrer em múltiplos níveis, desde os seus receptores de caspases executor dentro da sua via de sinalização [2], [4]. Ao nível do receptor, mutações em DR4 e DR5 foram encontrados em alguns tumores, incluindo cancros da mama e do pulmão [4]. O aumento da expressão de receptores de engodo e a diminuição da expressão de DR4 /DR5 foram correlacionadas com a resistência à TRAIL, embora outros estudos indicaram que os níveis de expressão de receptores de TRAIL não se correlacionam com sensibilidade TRAIL. Com a morte de indução de sinalização complexo nível (DISC), acredita-c-FLIP ser um grande inibidor para TRAIL sinalização [5], [6]. Um estudo recente mostrou que o câncer de pulmão de células TRAIL sensíveis não-pequenas células (CPNPC) montar DISC em jangadas lipídicas da membrana plasmática que leva a caspase 8 activação, enquanto conjunto de disco não-jangada leva ao recrutamento de c-FLIP e RIP e a activação do pró-sobrevivência vias, tais como NF-kB e ERK1 /2 vias de sinalização [7]. Além disso, demonstrou-se que os membros anti-apoptóticos da família Bcl-2, incluindo Bcl-2 e de Mcl-1, também estão envolvidos na resistência TRAIL [8], [9]. A activação de outras vias, incluindo as vias de sobrevivência Akt e NF-kB leva à sobrevivência celular e quimiorresistência [10]. Consistentemente, foi demonstrado que a activação da via de Akt está intimamente associado com resistência a drogas, incluindo a resistência LIART [11], [12]. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a Akt faz com que a resistência de TRAIL não é totalmente compreendido.

A via PI3K /Akt via de sinalização é uma via de sobrevivência prototípicas que desempenha um papel central em diversas funções celulares, incluindo a proliferação, crescimento, sobrevivência, e metabolismo [13]. Após estimulação do factor de crescimento, a PI3K é activado para fosforilar o fosfatidilinositol-3, 4-bifosfato (PIP2), gerando phosphatidylinsitol-3, 4, 5-trifosfato (PIP3). PIP3 se liga a Akt, em seguida, transloca-se para a membrana de plasma onde Akt é activada pela fosforilação nos resíduos sequencial T308 e S473. A fosforilação em T308 é mediada por PDK-1 (cinase 1 3′-fosfoinositide-dependente), enquanto a fosforilação em S473 pode ser mediada por várias quinases, incluindo PDK-1 e mTORC2 [13]. Uma vez ativado, Akt pode fosforilar muitos substratos para exercer suas funções. O substrato melhor caracterizado de Akt é o mTOR serina /treonina quinase (alvo da rapamicina em mamíferos). Akt pode fosforilar directamente e ativar mTOR e indiretamente ativar mTOR por fosforilação e inativação complexo esclerose tuberosa 2 (TSC2). mTOR activado forma um complexo com rapina para activar quinases da proteína ribossomal S6 (S6K) e inibir a 4E-BP, levando ao aumento da tradução de proteínas [13]. Sabe-se que a activação da via PI3K /Akt /mTOR pode aumentar a sobrevivência das células e resistência à apoptose induzida por um número de agentes de [12], [13]. Por exemplo, a sobreexpressão de Akt aumenta a resistência TRAIL [11], [14]. Por outro lado, a PTEN gene supressor de tumor (fosfatase e homólogo tensina suprimida no cromossoma dez) pode desfosforilar PIP3 funcionar como um regulador negativo da via PI3K /Akt sinalização /mTOR. PTEN inactivação conduz à activação da via de sinalização da via PI3K /Akt /mTOR. No entanto, o mecanismo exato pelo qual a via PI3K /Akt /mTOR confere resistência trajecto não é totalmente compreendido.

Neste estudo, foi demonstrado que o aumento da activação da via de Akt desempenha um papel importante na resistência TRAIL. Especificamente, mostraram que LIART activa a via de Akt e que o bloqueio da activação de Akt por o inibidor de PI3K LY294002 ou knockdown de expressão Akt por siARN sensibiliza células resistentes a TRAIL. Nós também descobrimos que a reintrodução do tipo selvagem PTEN em células knockout PTEN sensibiliza PTEN

– /- células a trilha enquanto inactivação de PTEN em PTEN

+ /+ e células PTEN

+/- leva à resistência à TRAIL . Estes resultados sugerem que o aumento da ativação da via de Akt através de inactivação de PTEN desempenha um papel importante na resistência TRAIL.

Materiais e Métodos

Reagentes

LY294002 foi comprado de Alexis Biochemicals (San Diego, CA). TRAIL recombinante foi adquirida a partir de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ). Os anticorpos policlonais de coelho contra a Akt fosforilada (Ser473), mTOR fosforilado, fosforilado p70S6K, fosforilado eIF4E, PTEN, Akt total e poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technology (Beverly, MA). O anticorpo anti-actina foi adquirido de Sigma. Os adenovirus que expressam o tipo selvagem e de PTEN dominante negativa, bem como adenovírus de controlo expressando -galactosidase (Ad-LacZ), foram gentilmente cedidas pelo Dr. Lee Mengjer (Universidade de Louisville).

linhas celulares, condições de cultura, e tratamento

As células T47D de cancro da mama humano foram obtidas de American Type Culture Collection e mantidas em DMEM com soro de bovino fetal a 10% (FBS). células SKOV3 do cancro do ovário humano foram cultivadas em RPMI 1640 com 10% de FBS, OVCA432 células foram cultivadas em meio MCDB105 /M199 com 10% de FBS como descrito [15]. células epiteliais PTEN-knockout rato próstata (PTEN

– /- e PTEN

+/-) e células normais (PTEN

+ /+) foram obtidas de Dr. Young Chen (Wake Forest University) e mantida em DMEM com FBS a 10%, como descrito previamente [16]. Todas as linhas celulares foram cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada constituída por 5% de CO

2 e 95% de ar.

siARN transfecção para knockdown da Akt

Sinal silêncio siRNA para Akt e correspondentes ARNsi de controlo foram adquiridos a partir de Cell Signaling. As transfecções foram realizadas como sugerido pelo fabricante com ligeiras modificações, tal como descrito anteriormente [17]. Resumidamente, as células T47-D foram plaqueadas a 6 x 10

5 por poço em placas de seis poços. No dia seguinte, as células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou Akt não-alvo usando Oligofectamine (Invitrogen). Após 24 h, as células transf ectadas foram tripsinizadas e plaqueadas a 6 x 10

5 por poço em placas de seis poços. 48 h mais tarde, as células transfectadas foram deixadas sem tratamento ou tratada com TRAIL (100 ng /ml) durante 24 h e, em seguida, colhidas para avaliar a expressão de Akt e PARP clivada por análise de Western blot. Para determinar a quimiossensibilidade, as células com ou sem transfecção foram colocados em 8000 por poço em placas de 96 poços e em seguida tratada com TRAIL durante 24 h, e a viabilidade celular foi determinada por 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2 , brometo de ensaios (MTT) 5-dif.

ensaios MTT

ensaios MTT foram descritos anteriormente [18].

Western blot análise

Os procedimentos para a preparação de lisados ​​de proteína de célula inteira e análise de Western blot foram descritos anteriormente [18].

infecções Adenoviruse

PTEN

+ /+, PTEN

+/- e PTEN

– /- células epiteliais do rato da próstata e células T47D câncer de mama humano foram semeadas em 60 pratos mm a 8 × 10

5, 6 × 10

5, 5 × 10

5 e 8 × 10

5 células por prato, respectivamente. No dia seguinte, as células foram lavadas com meio normal e infectadas com adenovírus de tipo selvagem que expressam PTEN, PTEN dominante negativa, ou LacZ. Durante a infecção, as células foram suavemente agitada a cada 10 minutos durante 1 h, e depois manteve-se em meio contendo adenovirus a 37 ° C numa atmosfera humidificada contendo 5% de CO

2. 24 h mais tarde, as células infectadas foram mudadas para meio normal sem adenovírus e, em seguida, cultivadas continuamente durante mais 48 h. Às 72 horas após a infecção, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em mm prato 60 a 5 x 10 5>

A análise estatística

A análise estatística foi feita usando

t

teste de Student. Os dados foram apresentados como a média ± SD, e

P

≤0.05 foi considerado significativo.

Resultados

Caracterização da sensibilidade TRAIL em um painel de mama e de células de cancro do ovário linhas

Para entender os mecanismos de resistência TRAIL, investigamos primeiro sensibilidade TRAIL em linhas de células de câncer de 14, incluindo 3 de mama e 11 linhas celulares de cancro do ovário. Estas linhas celulares foram tratadas com diferentes doses de TRAIL durante 24 h, e a proliferação das células foi medido pelo ensaio de MTT. FIG. 1 mostra que estas linhas celulares exibiram sensibilidade a TRAIL diferencial; MDA-231, DOV13, OV433 e OVCA420 células foram sensíveis a TRAIL enquanto o resto das linhas eram resistentes a TRAIL, exceto células MCF-7 que mostraram resistência modesto. Estes dados mostram que muitas linhas celulares de ovário e câncer de mama são resistentes a TRAIL.

linhas celulares de cancro da mama humano T47D, MDA231 e MCF7 e linhas celulares de cancro do ovário DOV13, E52, OV90, OV433, OVCA432, RMG- 1, TOV-21G, TOV-112D, CAOV3, OVCA420 e SKOV3 foram tratados com várias doses de TRAIL para 24 h. A proliferação celular foi determinada por ensaios MTT. dados de proliferação celular são expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes.

A via Akt /mTOR é ativado em linhas de células resistentes trilha

Uma vez que muitos de mama e linhas celulares de cancro do ovário são resistentes a TRAIL, é importante compreender o mecanismo subjacente de resistência TRAIL. Tem sido relatado que TRAIL pode activar várias vias pró-sobrevivência, incluindo ERK Akt, NF-kB e [19], [20], [21], [22]. Uma vez que a activação destes percursos modula a sobrevivência das células e quimiorresistência, é concebível que a activação destes percursos contribui para a resistência de TRAIL. Para testar esta possibilidade, foram tratados quatro linhas resistentes T47D, SKOV3, OVCA432 e OV90 com 100 TRAIL ng /ml durante diferentes períodos de tempo e analisou a activação das vias de Akt, NF-kB e ERK, bem como a expressão de Bcl -2 proteínas da família. Como mostrado na Fig. 2A-D, os níveis de ambos fosforilada Akt e proteína mTOR foram aumentadas tão cedo quanto 2 horas e durou até 6 horas após o tratamento com TRAIL, Também mostrou que essa activação não foi devido a um aumento no total das proteínas Akt e mTOR, que permaneceu constante (Fig. 2A-D). Além disso, mostramos que a p70S6K e elF4E, ambos são alvos a jusante de mTOR, são activados (fig. 2A e D). Estes dados indicam que TRAIL pode ativar a via Akt /mTOR em linhas de células resistentes a TRAIL. É importante notar, que mostrou que a AKT e mTOR não são activados em TRAIL sensíveis MCF-7 e OVCA420 células (Fig. 2E e F). Assim, os nossos resultados sugerem que a activação de Akt /mTOR é um evento comum em linhas de células de cancro resistentes a LIART e que esta via pode ser importante na resistência TRAIL. Além disso, verificou-se que TRAIL pode activar as vias de MEK /ERK e de NF-kB em células OV90, mas não em outras linhas de três células (dados não apresentados). Além disso, a inibição da ERK e vias de NF-kB pelos seus inibidores farmacológicos correspondentes não afecta a sensibilidade TRAIL em OV90 células (dados não mostrados), indicando que a activação de estas duas vias pode não ser importante para a resistência TRAIL nesta linha celular.

T47D (a), SKOV3 (B), OVCA432 (C), OV90 (D), MCF7 (e) e (F OVCA420 células) foram tratados com 100 de TRAIL ng /mL para 0, 2, 4 e 8 h (em células T47D, 6 h de tratamento foi incluído), e a proteína total foi extraída. Os níveis de Akt total e fosforilada (

p-AKT

), e mTOR fosforilado (

P-mTOR

) foram determinados por análise de Western blot. Em células T47D (A) e OV90 (d), os níveis de p-fosforilada e p70S6K elF4E fosforilado (p-elF4E) foram também examinados. β-actina foi utilizado como um controlo de carga. É de notar, havia duas bandas para Akt (Akt1 e Akt2) em ambos OVCA432 e OV90 células, enquanto apenas uma banda para Akt foi detectada em células T47D e SKOV3.

A inibição da ativação da Akt sensibiliza células resistentes a trilha

Uma vez que a Akt foi ativado em todas as linhas de células resistentes testados, nós nos perguntamos se a inibição da actividade Akt poderia aumentar a sua sensibilidade TRAIL em células resistentes. Para este fim, células T47D tratados com o inibidor de PI3K LY294002 e examinaram o efeito de inibição de Akt na apoptose induzida por TRAIL. Como mostrado na Fig. 3, o tratamento TRAIL aumentou Akt fosforilação em células T47D, que foi abolido pelo LY294002, mostrando que a activação da Akt é dependente PI3K. Da mesma forma, também mostraram que a activação de Akt é bloqueado por LY294002 em OVCA432 células (Fig. 3C). Importante, a inibição da fosforilação de Akt por LY294002 aumentou significativamente a clivagem de PARP induzida por TRAIL, em comparação com as células tratadas com TRAIL, sozinho ou LY294002 (Fig. 3A e C). Além disso, mostramos que o tratamento combinado de TRAIL e LY294002 inibe significativamente a proliferação celular em comparação com qualquer dos agentes sozinhos (Fig. 3B e D). Estes resultados sugerem fortemente que a activação de Akt desempenha um papel importante na resistência TRAIL em células cancerosas.

A e C, o efeito do inibidor de PI3K LY294002 sobre a apoptose induzida por TRAIL. de células do cancro da mama T47D (

A

) e OVCA432 de células de cancro do ovário (

C

) foram deixados sem tratamento ou pré-tratadas com 10 mM LY294002 (

LY) Compra de 30 min, e em seguida, tratadas com ou sem 100 TRAIL ng /mL, durante 6 h. A proteína total foi extraída, e PARP clivada e Akt total e fosforilada foram determinados por Western blotting.

B e D

, efeito de LY294002 na inibição do crescimento induzida por TRAIL. T47D (

B

) e OVCA432 células (

D

) foram deixadas não tratadas ou pré-tratadas com 10? M LY294002, durante 30 min, e depois tratou-se com ou sem 100 TRAIL ng /ml durante 24 h. A proliferação celular foi determinada por ensaios de MTT e expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes. **,

P Art 0,001, a significância estatística; *,

P

. 0,01, significância estatística

Knockdown de Akt sensibiliza células T47D cancro da mama a trilha

Embora o tratamento com o inibidor de PI3K LY294002 aumentou TRAIL apoptose induzida, os resultados podem não refletir totalmente o papel exclusivo de Akt na resistência TRAIL porque LY294002 pode inibir outras quinases. Para investigar o papel directo da activação de Akt na resistência TRAIL, foi utilizado siRNA para knockdown expressão Akt e, em seguida, determinar o efeito do knockdown Akt sobre a sensibilidade de TRAIL. Nós transfectadas T47D células com ARNsi contra Akt (Akt 1, 2 e 3) ou ARNsi de controlo e mostrou que a AKT foi eficientemente batidas abatido por Akt siRNA em células com ou sem tratamento com TRAIL, em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo (Fig. 4B ). É importante notar, que mostrou que knockdown de TRAIL induziu clivagem da PARP Akt sensibilizadas, em comparação com as mesmas células transfectadas com ARNsi de controlo (Fig. 4B). Além disso, o knockdown da Akt aumento da inibição do crescimento induzida por TRAIL, enquanto essas alterações foram mínimas em células transfectadas com ARNsi de controlo (Fig. 4A). Assim, nossos resultados indicam que, embora TRAIL pode causar apoptose, também ativa a via de sobrevivência Akt para neutralizar a apoptose induzida por TRAIL.

A

, efeito da Akt knockdown na proliferação celular. As células T47D foram plaqueadas a 6 x 10

5 por poço em placas de seis poços. No dia seguinte, as células foram transfectadas com ARNsi de controlo ou Akt usando Oligofectamine. Após dois d, as células foram deixadas não tratadas ou tratadas com TRAIL (100 ng /ml) durante 24 h, e a proliferação das células foi determinada por ensaios MTT. dados de proliferação celular são expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes. *,

P Art 0,01, significância estatística.

B

, efeito da Akt knockdown na apoptose induzida por TRAIL. As células T47D foram transfectadas com ARNsi de controlo ou Akt e depois tratou-se com ou sem TRAIL (100 ng /ml) durante 24 h como descrito em (

Um

). A proteína total foi extraída para ensaio Akt total e fosforilada (

p-AKT

) e PARP por análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

A perda de PTEN confere resistência TRAIL

Sabe-se que PTEN é um regulador negativo de Akt e que o aumento da actividade de Akt tem sido associada a inactivação de PTEN em vários cancros. Para entender o mecanismo de Akt mediada por activação resistência TRAIL, nós tratamos PTEN

+ /+, PTEN

+/- e PTEN

– /- ratos células epiteliais da próstata com TRAIL durante 48 horas e proliferação celular medido por ensaios MTT. FIG. 5A mostra que a inibição de crescimento de cerca de 32% induzida por TRAIL em PTEN

+ /+ células, enquanto que TRAIL não afetou a proliferação celular no PTEN

– /- células, enquanto PTEN

+/- células mostrou que cerca de 13% a inibição do crescimento após o tratamento TRAIL. Além disso, mostramos que a Akt é ativada em PTEN

– /- células, mas não no PTEN

+ +, enquanto a ativação mínima em PTEN

+/- células /. É importante ressaltar que o tratamento TRAIL causou clivagem PARP significativa no PTEN

+ /+ células, clivagem moderada em PTEN

+/- células e completa ausência de clivagem no PTEN

– /- células (Fig. 5B). Estes resultados sugerem que PTEN é necessária para a apoptose induzida por TRAIL em células epiteliais do rato da próstata.

células epiteliais da próstata mouse com tipo selvagem PTEN (PTEN

+ /+), PTEN knockout (PTEN

+/-

) e heterozigóticos (PTEN

– /-

) foram plaqueadas em placas de 96 poços, e depois tratou-se com 100 TRAIL ng /ml durante 48 h. proliferação de células foi determinada por ensaios de MTT e expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes. *,

P Art 0,01, significância estatística.

B

, efeito da perda de PTEN na apoptose induzida por TRAIL. PTEN

+ /+, PTEN

+/- e PTEN

– /- células foram tratadas com TRAIL 100 ng /ml durante 48 h, como descrito em (

Um

). A proteína total foi extraída para ensaio Akt total e fosforilada (

p-AKT

), PTEN e PARP por análise de Western blot. β-actina foi utilizado como um controlo de carga.

C

, expressão de PTEN restaurado sensibiliza PTEN

– /- células a TRAIL. PTEN

– /- células (5 × 10

5) foram infectadas com adenovírus expressando tipo selvagem PTEN (

Ad-PTEN em peso

) ou expressando LacZ (

Ad-lacZ

). Às 72 horas após a infecção, as células foram tripsinizadas e plaqueadas em mm prato 60 a 5 x 10 5>

Painel superior

) e análise de transferência de Western foi utilizada para detectar os níveis de PARP e proteínas PTEN (

painel inferior), respectivamente. dados de proliferação de células foram expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes. **,

P Art 0,001, significância estatística.

D,

inibição da função PTEN por uma forma dominante negativa de PTEN confere resistência TRAIL. PTEN

+ /+ e PTEN

+/- células foram infectadas com adenovírus expressando uma forma dominante negativa de PTEN durante 72 h e, em seguida, tratada com TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h. As células foram tanto utilizados para a inibição do crescimento por ensaios MTT (

painel superior) ou colhidas para detectar os níveis de PARP, PTEN, e Akt total e fosforilada por análise de mancha de Western (painel inferior). dados de proliferação de células foram expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes. *,

P Art 0,01, significância estatística. **,

P Art 0,001, a significância estatística

Desde PTEN

– /- células são resistentes a TRAIL, foi perguntado se a restauração da expressão de PTEN afeta sensibilidade TRAIL. no PTEN

– /- células. PTEN

– /- células foram infectadas com adenovírus expressando tipo selvagem PTEN ou LacZ. Como mostrado na Fig. 5C, a expressão de PTEN foi restabelecida nas células infectadas com adenovírus expressando PTEN, mas não em células infectadas com adenovírus que expressam LacZ. É importante ressaltar que fomos capazes de mostrar que a restauração da expressão de PTEN torna PTEN

– /- (Fig. 5C) células sensíveis a TRAIL induziu apoptose e inibição do crescimento que tais efeitos não foram observados em células infectadas com os vírus controle. Desde PTEN

células + /+ são sensíveis a TRAIL, foi perguntado se a inibição da função PTEN afeta apoptose induzida por TRAIL em PTEN

células + /+. Para este fim, nós infectado PTEN

+ /+ e PTEN

+/- células com adenovírus expressando uma forma dominante negativa de PTEN ou LacZ e células infectadas tratadas com TRAIL para 48 h. FIG. 5D mostra que a introdução de forma negativa dominante da PTEN aumento do nível P-Akt no PTEN

células + /+. É importante ressaltar que a introdução de uma forma negativa dominadora de PTEN torna PTEN

+ /+ e PTEN

+/- células mais resistentes a TRAIL (Fig. 5D). Consistente com o papel de Akt em inibir a apoptose, TRAIL clivagem PARP induzida foi reduzida drasticamente em PTEN

+ /+ e PTEN

+/- células depois que eles foram infectados com vírus expressando uma forma dominante negativa de PTEN. Além disso, mostramos que a inibição do crescimento induzida por TRAIL em PTEN

+ /+ células infectadas com um adenovirus expressando uma forma dominante negativa de PTEN foi cerca de 5%, mas cerca de 27% nas mesmas células infectadas com adenovirus de controlo (Fig. 5D ). Também mostrou que em PTEN

+/- células infectadas com forma negativa dominante de PTEN, a proliferação de células era de cerca de 102%, em comparação com as mesmas células infectadas com vírus de controlo em que a proliferação de células foi cerca de 81% após tratamento de TRAIL (Fig . 5D, painel superior).

O papel da PTEN na sensibilidade TRAIL em células de cancro da mama T47D

uma vez que as células T47D cancro da mama com um tipo selvagem PTEN foram resistentes a TRAIL (Fig. 1 ), foi perguntado se a modulação da função PTEN afetaria sensibilidade TRAIL em células T47D. Para este fim, células T47D infectadas com adenovírus expressando uma forma dominante negativa de PTEN ou vírus de controlo e, em seguida, as células infectadas tratadas com TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h, e o efeito de tal tratamento de sensibilidade de TRAIL foi determinada. FIG. 6 mostra que as células infectadas com adenovírus expressando uma forma dominante negativa de PTEN expressar um maior nível de P-Akt, enquanto um tal aumento não foi observado em células infectadas com adenovírus que expressam LacZ, o que sugere que a função de PTEN foi inibida por uma forma dominante negativa de PTEN (Fig. 6B). Consistente com o papel de Akt na inibição da apoptose, PARP clivada foi significativamente reduzida em células que expressam uma forma dominante negativa de PTEN em comparação com células que expressam os vírus de controlo (Fig. 6B). Além disso, a sobre-expressão de uma forma negativa dominante de PTEN torna as células T47D mais resistentes a TRAIL, em comparação com as mesmas células infectadas com vírus que expressam LacZ (Fig. 6). Portanto, estes dados sugerem que o aumento da activação de Akt, devido à inactivação de PTEN poderia conferir resistência TRAIL em células cancerosas.

Um

, efeito da inibição da função de PTEN sobre a proliferação celular. As células T47D (8 × 10

5) foram infectadas com adenovírus expressando uma forma dominante negativa de PTEN ou adenovírus expressando LacZ durante 72 h e, em seguida, tratada com TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h. A proliferação celular foi determinada por ensaios MTT. dados de proliferação celular são expressos como percentagem de células não tratadas. Representativos de três experiências independentes. *,

P Art 0,01, significância estatística.

B

, efeito de inibição da função PTEN na apoptose. células T47D infectadas com adenovírus, tal como descrito em A, foram tratados com TRAIL (100 ng /ml) durante 48 h e, em seguida, colhidas para análise dos níveis de PARP, PTEN, proteínas Akt no total e fosforilada por análise de Western blot (

painel inferior

). β-actina foi usado como um controle de carga.

Discussão

Neste estudo, mostramos que TRAIL ativa a via de sobrevivência Akt em linhas celulares de cancro TRAIL-resistente. Também mostram que o mecanismo subjacente pode ser devido à perda de PTEN funcional porque as células epiteliais da próstata do rato knockout PTEN são resistentes a TRAIL, enquanto as células com PTEN intactos são sensíveis a TRAIL. Restaurando a expressão de PTEN prestados PTEN

– /- células sensíveis a TRAIL. Além disso, a inactivação de PTEN aumenta o nível de resistência TRAIL em células T47D. Estas descobertas sugerem que a activação da via de sobrevivência de Akt desempenha um papel crítico na resistência TRAIL e que a Akt é um alvo terapêutico potencial para aumentar a terapia à base de TRAIL.

A activação da via de Akt tem sido implicada em protegendo as células por muitos estímulos de morte, conferindo assim a sobrevivência celular [10], [13]. Estudos anteriores sugeriram que a superexpressão de Akt e seu regulador a montante PI3K aumento da resistência TRAIL na mama e cancro do ovário células [23], [24]. No entanto, o mecanismo subjacente à sua resistência não é totalmente compreendido. Neste estudo, mostrou que, embora TRAIL induz apoptose em células cancerosas, que também activa vários percursos de sobrevivência, o que pode contrariar a apoptose induzida por TRAIL, conduzindo à resistência. Em muitos mama resistentes TRAIL e linhas celulares de cancro de ovário, mas não as linhas de células sensíveis, a Akt estava activado (Fig. 2), sugerindo que a activação da via de Akt pode ser um evento comum em células resistentes a TRAIL. Consistente com esta noção, verificou-se que a inibição da activação de Akt pelo seu inibidor farmacológico LY294002 ou knockdown da sua expressão por siARN sensibiliza células resistentes a TRAIL-TRAIL. Colectivamente, estes dados sugerem fortemente que a activação da via de sobrevivência de Akt desempenha um papel crítico na resistência TRAIL em células do ovário e do cancro da mama e implica que a inibição deste percurso de sobrevivência pode superar a resistência de TRAIL.

Também mostrou que a inibição de PI3K atividade bloqueada ativação da Akt em linhas de células resistentes a TRAIL. Uma vez que a PI3K pode servir como um regulador positivo a montante da Akt, estes resultados sugerem que o aumento da activação de Akt é, pelo menos, em parte através do aumento da activação de actividade de PI3K. Ao nível a jusante, é bem conhecido que a AKT exerce as suas funções biológicas por fosforilar os seus substratos a jusante incluindo mTOR. A activação de mTOR pode aumentar a tradução da proteína, que resulta em sobrevivência de células [13]. Coerente com isso, descobrimos que o tratamento TRAIL pode causar a fosforilação mTOR ea ativação subsequente. Os nossos dados sugerem que TRAIL pode activar a via de PI3K /Akt /mTOR para neutralizar a apoptose induzida por TRAIL, conduzindo à resistência TRAIL.

em células de cancro, a via de sobrevivência de Akt pode ser activado por diversos mecanismos, incluindo a inactivação de seu regulador negativo a montante PTEN. Por desfosforilando e conversando PIP3 para PIP2, PTEN inibe a ativação da Akt e, posteriormente, sensibiliza as células à morte [10], [13]. Consistente com o papel da via PI3K /Akt na resistência TRAIL, verificou-se que a perda de PTEN em células epiteliais da próstata do rato confere resistência TRAIL enquanto que as mesmas células com PTEN intactos são sensíveis a TRAIL, enquanto PTEN

+/- células mostram intermediário resistência. Estes dados sugerem que, de facto PTEN desempenha um papel importante na sensibilidade TRAIL. Além disso, mostramos que a reintrodução de uma forma mutante de PTEN em células T47D resistentes a TRAIL aumenta ainda mais a resistência de TRAIL. Colectivamente, estes dados indicam que, em células resistentes a TRAIL, perda de PTEN contribui para a resistência TRAIL. Sabe-se que a diminuição ou perda de expressão de PTEN ocorre em pelo menos 50% dos cancros da mama e do ovário [25]. É possível que mama resistentes TRAIL e as células de câncer de ovário têm níveis reduzidos de PTEN, que necessitam de uma investigação mais aprofundada. Além disso, um estudo recente mostrou que a sobre-expressão de miR-221 222 regula para baixo PTEN, que conduz a um aumento da activação de Akt e subsequente resistência TRAIL [26]. Além disso, as células de leucemia resistente TRAIL expressa um nível mais elevado da forma inactiva fosforilada de PTEN, que resultou em um aumento na activação de Akt e resistência LIART [27].