Abstract

Fundo

A menor incidência de câncer de mama entre mulheres asiáticas em comparação com os países ocidentais tem sido parcialmente atribuído a soja na dieta asiática, levando a esforços para identificar os componentes bioativos que são responsáveis. Soy Bowman Birk Inhibitor Concentrate (BBIC) é um agente preventivo de câncer conhecido agora em ensaios clínicos humanos.

Metodologia /Principais Achados

Os objetivos deste trabalho são estabelecer a presença e delinear a em actividade in vitro de lunasin e BBI encontrado no BBIC, e estudar a sua biodisponibilidade após administração oral a ratinhos e ratos. Relatamos que a lunasin e BBI são os dois principais ingredientes bioactivos do BBIC com base na inibição da formação de focos, a lunasin sendo mais eficaz do que o BBI em uma base equimolar. BBI e soja Inibidor de Tripsina Kunitz proteger a lunasina de

in vitro

digestão com pancreatina. A administração oral de

lunasin marcado com 3H com resultados de soja enriquecido em lunasin em 30% do péptido atingir tecidos alvo numa forma intacta e bioactivo. Em um modelo de xenoenxerto de murganhos glabros transplantados com carcinoma da mama humano MDA-MB-231, injecções intraperitoneais de lunasin, a 20 mg /kg e 4 mg /kg de peso corporal, diminuição da incidência do tumor em 49% e 33%, respectivamente, comparado com o grupo tratado com veículo. Em contraste, a injecção com BBI a 20 mg /kg de peso do corpo não apresenta qualquer efeito sobre a incidência de tumores. geração do tumor é significativamente reduzida com as duas doses de lunasin, enquanto o BBI é ineficaz. Lunasin inibe a proliferação celular e induz a morte celular nas secções de tumor da mama.

Conclusões /Significado

Concluímos que a lunasin é, na verdade, o agente preventivo do cancro bioactivo no BBIC, e BBI simplesmente protege a lunasin de digestão quando a soja e outros alimentos de sementes são consumidos por seres humanos

Citation:. Hsieh CC, Hernández-Ledesma B, Jeong HJ, Parque JH, de Lumen BO (2010) papéis complementares na prevenção do câncer: Protease Inhibitor faz Câncer preventiva Peptide lunasina biodisponível. PLoS ONE 5 (1): e8890. doi: 10.1371 /journal.pone.0008890

editor: Syed A. Aziz, Health Canada, Canadá |

Recebido: 12 de novembro de 2009; Aceite: 16 de dezembro de 2009; Publicação: 26 de janeiro de 2010

Direitos de autor: © 2010 Hsieh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Número de projecto 05B087 concedido pelo Instituto americano para Pesquisa do Câncer (https://www.aicr.org/site/PageServer). número do projeto W81XWH-04-1-0128 concedido pelo United States Department of Defense Congressionally Medical Research Program Directed (https://cdmrp.org). Projeto LUNAMICE 039.241 concedido pela Comissão Europeia e pelo Conselho de Pesquisa Nacional Espanhola de pós-bolsa Marie-Curie de BHL. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:. BODL é co-fundador da FilGen BioSciences, Inc ,. que tem licença exclusiva para comercializar a tecnologia lunasina coberto por patentes de propriedade da Universidade da Califórnia, Berkeley. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas de dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores (https://www.plosone.org/static/policies.action#sharing).

Introdução

o cancro da mama é o tumor maligno mais comum entre as mulheres e as principais causas de morte de mulheres nos países ocidentais [1]. Em contraste, a incidência de câncer de mama, na maioria dos países asiáticos é de aproximadamente 10% que a da população geral dos EUA e da Europa [2]. De todos os factores ambientais que influenciam o cancro da mama, dieta parece ser um dos mais significativos. Ásia dietas são ricas em produtos de soja que contêm fatores que foram encontrados para fornecer proteção importante contra a iniciação, promoção e /ou progressão do câncer de mama em modelos animais [3]. Em 1980, Troll e colaboradores sugeriram a possibilidade de que a proteína de soja podem ter um papel na prevenção do cancro da mama em ratos irradiados [4]. Experiências com animais realizados durante a última década confirmaram o papel preventivo do cancro da mama da proteína de soja [2], [3]. Em particular, péptidos bioactivos isoladas de soja, tais como a lunasin e o inibidor de protease Bowman-Birk (BBI) está agora a ser estudado intensamente como agentes quimiopreventivos de cancro.

Lunasin é um péptido novo, inicialmente identificado em soja [5] e, subsequentemente, isolado no trigo, cevada e outras sementes [6] – [9]. É um péptido de ácido 43-amino que a eficácia foi demonstrada em células de mamíferos contra carcinogénios químicos e oncogenes virais [10], [11]. O primeiro modelo do rato confirmou a atividade quimiopreventiva da lunasina contra o câncer de pele induzido por um químico cancerígeno [10]. Estes resultados sugerem que a lunasin pode exercer um papel promissor como agente de prevenção contra outros tipos de cancro, tais como cancro da mama.

BBI é um polipeptídeo de 71 aminoácidos com a capacidade para inibir as proteases de serina quimiotripsina e tripsina. O local inibidora de tripsina de BBI foi associada com efeitos negativos sobre a biodisponibilidade de proteínas alimentares, enquanto que o local de quimotripsina foi implicado no cancro efeitos quimiopreventivos [12], [13]. O elevado custo de processo de purificação do BBI tem tornado necessário o uso de uma forma impura de BBI chamado concentrado de BBI (BBIC), que foi reportado para exercer actividade quimiopreventivo contra diferentes tipos de cancro induzidos por carcinogénios químicos e radiações [14]. Estes estudos consideram que BBI é o principal componente responsável pela atividade quimiopreventiva do BBIC, sem avaliar a contribuição de outros peptídeos contidas no BBIC sobre a sua actividade de prevenção do câncer.

A administração oral tem sido reconhecido como um plausível e de baixo custo aproximar-se para reduzir a morbidade e mortalidade por câncer inibindo eventos pré-cancerosas antes da ocorrência da doença clínica [15]. Desde lunasina e BBI são peptídeos, é crucial para determinar se eles, uma vez ingerida oralmente, sobreviver a digestão e são absorvidas, alcançando os tecidos-alvo e órgãos em um estado intacto e bioativo. Park e colegas de trabalho realizado

in vitro

estudos demonstrando o papel do BBI em proteger a lunasina de digestão quando a proteína de soja foi consumido por via oral [16]. No entanto, não há nenhum

in vivo

estudos que examinam o papel do BBI em proteger a lunasina de digestão no trato gastrointestinal de animais.

Os objetivos deste trabalho são avaliar a presença e

actividade in vitro de lunasin e BBI contido no BBIC e estudar a sua biodisponibilidade após administração oral a ratinhos e ratos. Um modelo do rato do cancro da mama xenoenxerto foi escolhido para delinear e avaliar

in vivo

as propriedades quimiopreventivos de lunasina e BBI separadamente e para elucidar as vias de carcinogênese envolvidos no cancro da mama que são afectados por estes peptídeos.

resultados de

lunasina é um Bioactive Ingrediente de

BBIC

para determinar a composição do BBIC, esta preparação foi submetido a SDS-PAGE e Western-Blot para identificar lunasina e BBI. Os resultados mostram que ambos os péptidos estão presentes em BBIC em concentrações de 360 ​​e 74,4 ng de proteína /mg, respectivamente (Figura 1A). Os dois representam cerca de 44% da proteína total do BBIC, indicando que outras proteínas estão presentes e podem contribuir para as propriedades atribuídos a esta preparação

A:. De transferência de Western de BBIC, utilizando anticorpos específicos para o BBI e lunasin . (1) do marcador, (2) 6,25 ug de proteína, (3) 12 ug de proteína, (4) 25 ug de proteína, (5) o BBI padrão (3 ug) ou lunasin padrão (200 ng). B: actividade inibidora da formação de focos em células NIH3T3 induzida por DMBA. (A) As células tratadas com veículo (b) células de controlo positivo ou tratados por DMBA, (c) o BBIC (100 nM 1160 nM lunasin BBI), (d) o BBI (100 nM) a partir do BBIC, (e) A Lunasin (100 nM ) de BBIC, (f) o BBI padrão (100 nM), (g) a lunasin sintético (100 nM). Bares com diferentes designações letra minúscula são estatisticamente significativamente diferentes uns dos outros (

P Art 0,05, n = 6)

atividade inibitória formação de focos de BBIC contendo 1,160 nM BBI. e 100 nM foi analisada a lunasin. BBIC suprimida a formação de focos por 80% em 7,12-dimetilbenz [a] antraceno (DMBA) induzida por células NIH3T3, em comparação com as células tratadas com o veículo (Figura 1B-C). A Lunasin BBI e foram purificadas individualmente a partir do BBIC e analisadas as suas actividades. 100 nM de lunasin puro isolado a partir de BBIC reduziu a formação de focos em 73% (Figura 1B-E), que é idêntica à observada com 100 nM de lunasin sintética (Figura 1B-G). BBI puro isolado a partir do BBIC na concentração de 100 nM diminui a formação de focos em 60% (Figura 1B-D). Assim, a lunasin foi mais eficaz do que o BBI por 18% em uma base equimolar, mas BBI também tem um efeito quimiopreventivo do seu próprio, provavelmente devido à inibição de processos proteolíticos envolvidos na carcinogénese.

Soja Inibidores da Protease Proteger Lunasin de

In Vitro

Digestão

a fim de estabelecer o papel dos diferentes inibidores da protease contidos na soja, como BBI e Inibidor de Tripsina Kunitz (KTI), lunasina sintética foi submetido a um

in vitro

processo de digestão com pancreatina. A Lunasin foi incubada com esta preparação na ausência e na presença de BBI e KTI e avaliada por Western-Blot. Os programas de teste padrão (Figura 2) que ambos os inibidores da protease a lunasin proteger da digestão, mesmo depois de terem sido desnaturadas por tratamento térmico. Aproximadamente 93% e 97% de lunasin permanecem intactas após o processo de digestão, na presença de não fervida BBI e KTI, respectivamente. percentagens similares de lunasin (98% e 84%) permaneceu intacta quando este péptido foi incubada com pancreatina na presença de BBI fervida e KTI, respectivamente. Lunasina resiste a tratamento térmico [17], e está presente em produtos de soja processados ​​diferentes que contêm também BBI [18]. Todos estes resultados indicam que a lunasina seria biodisponível após a ingestão destes produtos, devido ao papel protetor da BBI e outros inibidores de protease de soja.

As faixas superiores, mais leves são manchas de proteína Coomassie azul e as bandas mais baixas, mais escuras são As transferências de western. (M) Marcadores, (1) A Lunasin (600 ng) + pancreatina (600 ng) foram incubadas durante 0 h a 37 ° C, (2) A Lunasin (600 ng) + pancreatina (600 ng) foram incubadas durante 1 h a 37 ° C , (3) a Lunasin (600 ng) + BBI (18000 ng, não fervida) + pancreatina (600 ng) foram incubadas durante 1 h a 37 ° C, (4). A Lunasin (600 ng) + KTI (18000 ng, não fervida) + pancreatina (600 ng) foram incubadas durante 1 h a 37 ° C, (5) A Lunasin (600 ng) + BBI (18000 ng, fervida) + pancreatina (600 ng) incubou-se durante 1 h a 37 ° C, (6) a Lunasin (600 ng) + KTI (18000 ng, fervida) + pancreatina (600 ng) foram incubadas durante 1 h a 37 ° C, (7) o BBI (não fervido), (8 ) KTI (não fervido).

lunasina é biodisponível quando administrada por via oral para camundongos e ratos

ratos e ratos foram usados ​​para determinar se lunasina ingerida oralmente sobrevive a digestão, acaba nos tecidos e permanece intacta e bioativo como medido por um

in vivo

ensaio. No primeiro conjunto de experiências, CD-1 ratos receberam

marcado com 3H lunasina sintética misturada com soja enriquecido em lunasina (LES) por sonda gástrica. Lunasina é absorvida e distribuída em vários tecidos recolhidos, incluindo aqueles que são alvos para os cânceres mais comuns, tais como pulmão, glândula mamária e próstata (Figura 3A). É digno de nota que a lunasin é capaz de atravessar a barreira sangue-cérebro, chegar ao cérebro. Em 3 horas após a administração forçada, aproximadamente 30% da dose oral total de lunasin é absorvido (Figura S1)

A:. Distribuição de

actividade de 3H-lunasin em vários tecidos e conteúdo gastrointestinal de ratos depois () 3 h, () 6 h, () 9 h, () 12 horas e () 24 h de administração oral de LES. As barras de erro mostrada para 3H-resultados. B: actividade inibidora da formação de focos em células NIH3T3 induzida por DMBA. (A) As células tratadas com veículo, (b) células tratados por DMBA, (c) a lunasin sintéticos, (d) a lunasin extraiu-se a partir de fígado de ratos alimentados com a dieta de controlo, (e) a lunasin extraída a partir de fígado de ratos alimentados com dieta de LES. Bares com diferentes designações letra minúscula são estatisticamente significativamente diferentes uns dos outros (

P Art 0,05, n = 6).

Uma vez que o

3H-radioactividade não iria mostrar o tamanho molecular e bioactividade de lunasin nos tecidos, os ratos foram alimentados com dieta LES durante 4 semanas, o sangue e o fígado foram colhidos e lunasin foi extraído, purificado, e analisados ​​por Western-blot. A Lunasin está presente no sangue dos ratos alimentados com LES-como um monómero com uma concentração de 17,5 ng /ml. No entanto, a lunasin isolado a partir do fígado de ratos alimentados com LES-existe como um dímero numa concentração de 3,1 ug /g de fígado (Figura S2). A Lunasin (1? M) extraiu-se a partir do fígado de ratos alimentados com LES-suprime a formação de focos de forma tão eficaz como uma quantidade equimolar de lunasin sintética (Figura 3B). Em contraste, a banda de proteína de controle extraídos de ratos LES-em jejum é ineficaz na supressão da formação de focos.

lunasina Reduz Tumor Incidência e Geração

Para examinar o

in vivo

efeito de lunasin e BBI em células de cancro da mama, MDA-MB-231 foram implantadas subcutaneamente em ratinhos nus após 2 meses por via intraperitoneal (ip) de lunasin e BBI. Não foram observadas diferenças significativas no peso corporal entre os quatro grupos (Figura 4A), sugerindo que a lunasina ou tratamentos BBI não tem efeitos colaterais sobre o estado de saúde geral. Estes resultados são consistentes com estudos realizados por Johnson e colaboradores [19] que relataram nenhum efeito significativo sobre o peso corporal após gavagem diária de BBIC (500~2000 mg /kg /dia) por seis meses

A.: O peso corporal dos murganhos tratados com (♦) PBS (controlo), (□) 20 mg de BBI /kg de peso corporal, (▴) 20 mg lunasin /kg de peso corporal, e (x) 4 mg lunasin /kg de peso corporal, e injectado com 1 × 10

7 MDA-MB-231 células no flanco de ratinhos nus de 15 semanas de idade. Não foram observadas diferenças significativas entre os quatro grupos. B: a incidência de tumores em ratinhos tratados com PBS, o BBI e duas doses de lunasin. A Lunasin redução do número de ratos que apresentavam tumores e atrasaram o aparecimento destes tumores mamários. C: geração de tumores em ratinhos tratados com PBS, o BBI e duas doses de lunasin. Baixa dose de lunasina (4 mg /kg de peso corporal) geração de tumor significativamente reduzido em comparação com o grupo controle (*

P

= 0,029). Os dados são mostrados: média ± SEM (n = 8)

incidência do cancro da mama de ratinhos é mostrado na Figura 4B.. No pós-células de injeção, 75% e 88% dos ratos no controle e BBI-grupos de sete semanas, mostrou respectivamente tumores. Em contraste, a incidência tumoral foi de 38% e 50% em ratinhos tratados com 20 mg /kg e 4 mg /kg de lunasin, respectivamente. Assim, em comparação com o controlo, a incidência do tumor foi de 49% e 33% menores nos grupos tratados com, respectivamente lunasin. Em comparação com o grupo de BBI, a incidência do tumor foi de 57% mais baixa no 20 mg /kg e 43% mais baixa no /kg grupo tratado com 4 mg de lunasin. Os ratinhos tratados com a lunasin também apresentaram um atraso no aparecimento de tumores. Além disso, a geração do tumor, foi reduzida nos dois grupos de ratinhos tratados com a lunasin, sendo significativamente menores em ratinhos tratados com a dose mais baixa de lunasin, 70% e 69% mais baixa em relação ao controlo e grupo BBI, respectivamente, (

P

= 0,029 vs controlo) (Figura 4C).

taxa de crescimento e o tamanho final dos tumores diferiam entre os quatro grupos. tumores significativas apareceu nos ratos de controlo depois de injecção de células enquanto que os tamanhos dos tumores nos ratinhos tratados com 20 mg /kg e 4 mg /kg a lunasin foram reduzidos em 23% e 34%, respectivamente (Figura 5A). No final da experiência, o peso dos tumores foi também mais baixa nos ratinhos tratados com ambas as doses de lunasin comparado com o controlo do grupo (

P

= 0,2134, 0,1880, respectivamente) e o BBI-grupo (

P

= 0,0909, 0,0569, respectivamente) (Figura 5B)

a:. o volume do tumor (mm

3) de tumores mamários induzidos pela administração de (♦) PBS (controle), ( □) 20 mg de BBI /kg de peso corporal, (▴) 20 mg lunasin /kg de peso corporal e (x) 4 mg /kg de lunasin. B: Breast tumores de peso induzida pela PBS (controle), 20 mg BBI /kg de peso corporal, 20 mg lunasina /kg de peso corporal (

P

= 0,2134 vs grupo controle e 0,0909 vs grupo BBI) e 4 mg lunasina /kg de peso corporal (

P

= 0,1880 vs grupo controle e 0,0569 vs BBI-grupo). Os dados são apresentados a média ± SEM (n = 8).

tumores mamários palpáveis ​​e não-palpáveis ​​foram recolhidos e submetidos para análise histológica e imunocoloração. Depois de H E a coloração (Figura 6A), as secções de tumor de grupos tratados com lunasin mostrou áreas de destruição do tumor substituídas por células apoptóticas e necróticas que não eram aparentes no controlo e grupos tratados com BBI. Para estabelecer uma maior especificidade para a resposta antiproliferativa, secções de tumor foram analisados ​​por imuno-histoquímica para a expressão de Ki-67, um indicador de proliferação de células [20]. tratamento lunasina a 20 mg /kg e 4 mg /kg reduziu Ki-67 em 34% (

P

= 0,0062) e 30% (

P

= 0,0158), respectivamente, em comparação com o grupo controle (Figura 6B). No entanto, não houve diferença significativa entre a expressão de Ki-67 de controlo e BBI-grupos. In situ ensaio TUNEL foi realizado para avaliar o efeito apoptótico de lunasin e tratamentos BBI (Figura 6c). células apoptóticas TUNEL-positivas foram encontradas em tumores de animais tratados com ambas as doses de lunasin, revelando um aumento significativo da apoptose nestes grupos de tratamento comparativamente com o grupo de controlo (

P

= 0,0088, 0,0141, respectivamente). células positivas TUNEL-Poucos foram encontrados em tumores de animais do BBI-grupo. Estes sugerem que os tumores dos ratos tratados com lunasina têm taxa significativamente menor de proliferação e maior índice de apoptose em relação ao grupo controle e BBI

A:. Os tumores foram coletadas em sete semanas após a injeção de células de câncer de mama, e processados ​​para H E coloração. imagens representativos são mostrados para a H E-secções coradas (coluna superior), coloração imuno-histoquímica para o Ki-67 (coluna do meio) e em índices apoptóticos TUNEL situ (coluna inferior). B: Percentagem de expressão Ki-67 em tumores de camundongos. Ki-67 rotulagem revelaram níveis significativamente mais baixos de células em proliferação em grupos lunasina contra grupo de controlo (*

P

= 0,0062 no grupo de alto lunasina; *

P

= 0,0158 em baixa grupo lunasina). C: Percentagem de células em apoptose em tumores de ratos medidos com o ensaio de TUNEL. A coloração revelaram níveis significativamente mais elevados de células tumorais apoptóticas em grupos lunasin contra grupo de controlo. (*

P

= 0,0088 no grupo de alto lunasina; 0,0141 em baixa grupo lunasina). Os dados são apresentados média ± SEM.

Discussão

A alta prevalência de câncer de mama tem proporcionado uma forte razão para a identificação de novos compostos para uso como preventivo e /ou agentes terapêuticos. Estudos epidemiológicos, experiências com animais e testes em humanos têm mostrado evidências de que pessoas que consomem uma dieta rica em soja tem menor incidência e mortalidade por câncer de mama, levando a investigações sobre diferentes compostos de soja que assegurem uma protecção contra o cancro da mama [21], [22]. A ingestão diária destes compostos antineoplásicos pode ser comparado a uma versão preventiva, não-tóxicos da quimioterapia que é inofensivo para a fisiologia do tecido normal e pára microtumours [23], [24]. Para avaliar os riscos e benefícios potenciais de fitoquímicos para a saúde humana, a compreensão do comportamento fisiológico destes compostos a seguir à ingestão oral, bem como da sua absorção, distribuição, metabolismo e excreção é necessário [15].

A BBIC soja é em grande parte uma preparação contendo o inibidor de protease BBI que tem sido utilizado para demonstrar as propriedades quimiopreventivas da presente péptido evitar o alto custo da sua purificação. Vários estudos têm relatado o papel quimiopreventivo do BBIC contra diferentes tipos de câncer induzido por carcinógenos químicos e radiações [14], [25]. Estes estudos têm assumido que BBI é o principal composto bioativo responsável pela atividade quimiopreventiva do BBIC, sem avaliar a contribuição de outros peptídeos menores. Os nossos resultados mostram que a lunasin do BBIC contém tanto o BBI e representando 44% da proteína total. O

Ensaio in vitro

focos actividade inibidora na formação mostra que a lunasin exerce uma actividade de 18% mais elevada em células NIH3T3 induzida pelo DMBA do que o BBI em uma base equimolar. No entanto, é evidente que as actividades inibidoras de protease de BBI e KTI são essenciais na protecção de lunasin

In vitro

digestão com pancreatina.

In vivo

experimentos, realizados com camundongos e ratos alimentados com LES, demonstraram que a lunasina, ingerida oralmente, resiste a digestão, é absorvido e atinge os tecidos-alvo e órgãos em um estado intacto e bioativo. Recentemente, tem sido demonstrado que a lunasin é biodisponível em seres humanos alimentados com produtos de proteínas de soja, um requisito importante para o seu potencial anti-cancro [26]. Assim, as funções de protecção do BBI e KTI e, talvez, outras proteases que ocorrem naturalmente têm um papel importante em tornar disponível a lunasin em proteína de soja para exercer as suas propriedades quimiopreventivos. Biodisponibilidade após a administração oral de um agente quimiopreventivo é crucial para entender os vários

in vivo

mecanismos responsáveis ​​pela sua actividade de prevenção do câncer [27].

A fim de delinear o indivíduo

in vivo

propriedades preventivas contra o câncer de mama de lunasina e BBI, cada um peptídeo foi injetado separadamente em ratos nu antes e após a injeção de células MDA-MB-231. No nosso estudo, uma dose de BBI e duas doses de lunasin foram avaliadas. A dose baixa (4 mg /kg de peso corporal) de lunasin corresponde à ingestão diária de proteína de soja considerado pela FDA para reduzir doenças cardiovasculares, e também em conformidade com os resultados do nosso estudo presente mostrando que 30% de lunasin ingerido atinge o alvo tecidos. A utilização de uma dose mais elevada (20 mg /kg de peso corporal) é baseado na constatação de que i.p. administração do BBI suprime a esta dose significativamente efeito em 3-metilcolantreno induzida por tumores de pulmão em ratinhos A /J [28]. Ambas as doses destes péptidos parecem ser bem tolerada pelos ratos, tal como evidenciado pela ausência de alteração do peso corporal durante o período de tratamento de 15 semanas. Os ratinhos tratados com redução lunasin mostra na incidência de tumores da mama e demora no aparecimento de tumores. geração de tumor também é significativamente inibida na dose mais baixa de lunasin. Além disso, o volume e peso dos tumores gerados em grupos tratados com lunasin são mais baixos em comparação com o controlo e BBI-grupos. não se observam efeitos sobre o desenvolvimento do tumor de mama quando BBI foi usado em ratos de xenotransplante MDA-MB-231.

A fim de compreender melhor os mecanismos específicos pelos quais lunasina exerce seus efeitos sobre MDA-MB-231 tumores de mama, biomarcadores da proliferação celular e da apoptose, que são bons indicadores de tamanho do tumor no modelo de xenoenxerto foram avaliados [29], [30]. coloração histológica de secções obtidas a partir de tumores tratados com lunasin mostra que as áreas de destruição do tumor são substituídas por células apoptóticas e necróticas. A Lunasin tratamento também resulta numa redução significativa da proliferação das células e indução de apoptose em tumores MDA-MB-231. Esses efeitos não são observados em tumores de camundongos tratados com BBI.

Propriedades quimioprevenção dos lunasina foram demonstradas

in vivo

em estudos anteriores. No primeiro modelo animal, a lunasin aplicado topicamente a 250 mg /semana suprime a formação de papiloma da pele em ratos tratados com DMBA SENCAR e tetradecanoilforbol-13-acetato em 70% em comparação com o controlo. Tumor multiplicidade também é reduzida e o aparecimento é retardado por 2 semanas em murganhos tratados com a lunasin em relação ao controlo [10]. Isto é consistente com outra observação que lunasina diminui a proliferação de células epidérmicas na pele do rato na ausência e presença de DMBA usando um método

2 H

2O rotulagem para medir a proliferação das células

in vivo

[31] . Todos estes apoiar nossas conclusões que lunasina atua como um agente preventivo do câncer

in vivo

.

Kennedy demonstrou que BBI tem uma actividade significativa quimiopreventivo de câncer em ambos

in vitro

e

in vivo

sistemas de bioensaios [25]. Embora BBI tem um amplo espectro de actividades cancerosas-protector, os seus efeitos sobre o cancro da mama permanece limitada. BBI foi previamente analisadas para a sua bioactividade contra outros tipos de câncer, como a mucosa oral, cólon e cancro do pulmão [28], [32], [33]. No entanto, nenhum

in vivo

estudos relatando o efeito da BBI como o cancro da mama peptídeo preventiva foram publicados. No entanto, existem alguns

in vitro

estudos que mostram que BBI diminuição do crescimento estrogênio dependentes humana de células de câncer de mama [34] – [36]. Wan e colaboradores [37] demonstraram as propriedades inibidoras de crescimento do BBI em xenoenxertos de cancro da próstata humanas em ratinhos nus. Os nossos resultados usando o modelo de xenotransplante onde lunasina e BBI foram avaliadas separadamente mostram que BBI apresenta muito pouco efeito quimiopreventivo contra o câncer de mama. Mais estudos são necessários para determinar se o tipo de células tumorais e suas vias de carcinogênese específicos podem ser determinantes das propriedades quimiopreventivos do câncer de BBI.

Em resumo, os nossos resultados mostram que a lunasina e BBI são os dois principais ingredientes bioactivos de BBIC . No ensaio de formação de focos, lunasina é cerca de 18% mais eficaz do que BBI. No entanto, o

in vivo

modelo de xenotransplante mostra que, enquanto lunasina exibem quimiopreventivo substancial e efeitos terapêuticos, BBI mostra muito pouco. Propomos que, para explicar as propriedades observadas quimiopreventivos de soja e de outras sementes contendo a lunasin, que ocorre naturalmente, tais como os inibidores de protease BBI e KTI, principalmente proteger a lunasin a partir da digestão, o que torna biodisponível. Este tema da complementaridade de ocorrência natural moléculas em trazer benefícios de saúde para os seres humanos é provável bastante comum na natureza e fala por comer alimentos integrais em vez de componentes isolados.

Materiais e Métodos

Purificação de lunasina e o BBI a partir de BBIC

para preparar o BBIC, 50 g de soja finamente trituradas foram extraiu-se com 1250 ml de hexano a 4 ° C durante 24 horas e, em seguida, re-extraída com 1250 ml de etanol a 60% em 55~ 60 ° C durante 1 h. Após a extracção, o pH da solução foi ajustado para 5,3, e o BBIC foi precipitado com 2500 ml de acetona durante 15 min. O precipitado foi dissolvido em 100 ml de água destilada, dialisado a 4 ° C durante 24 horas, e liofilizou-se.

Separação de lunasin e BBI a partir do BBIC foi realizada por cromatografia de permuta iónica. A coluna (AG MP-1 M, 5,0 x 50 cm Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA) foi equilibrada com tampão de fosfato de sódio 0,1 M, solução salina (PBS, pH 7,0). Quinhentos mg de BBIC dissolvido em 0,1 M de PBS foram aplicadas na coluna e separações cromatográficas foram realizadas com várias concentrações de NaCl em PBS a 4 ° C a uma velocidade de fluxo de 30 ml /h. Diferentes das fracções recolhidas foram submetidas a transferência de Western para detecção de lunasin e BBI como descrito anteriormente [8]. Resumidamente, a SDS-PAGE foi realizada utilizando 16,5% de gel de Tris-tricina (Bio-Rad). As proteínas foram transblotted para uma membrana de nitrocelulose e bloqueadas em 5% de leite em pó magro dissolvido em Tris-tamponada salina de 1% de Tween 20 (TBS-1T). A membrana foi lavada com TBS-1T e incubadas com anticorpo policlonal de lunasin (Zymed, Inc., South San Francisco, CA, EUA), ou anticorpo monoclonal de BBI, gentilmente fornecido pelo Dr. David Brandon (USDA, WRRL, Albany, CA, EUA). Após a lavagem, a membrana foi incubada durante 1 h com peroxidase de rábano anticorpos secundários conjugados (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA). A membrana foi detectado usando o agente de detecção (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, EUA) e desenvolvido utilizando 667 imediatamente películas Polaroid. As intensidades das bandas foram quantificados utilizando o software

Un-SCAN-IT gel

versão 5.1 (Silk Scientific, Inc. Orem, UT, EUA). conteúdo lunasin e BBI foram calculados pela comparação das intensidades das bandas com os padrões de lunasin conhecido e BBI executado sob as mesmas condições.

Formação de focos Ensaio

O ensaio de formação de focos foi efectuado de acordo com Reznikoff et al [38]. As células NIH3T3 foram obtidas da American Type Culture Collection (ATCC) e cultivadas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). As células foram colocadas em placas a uma densidade de 500 células /poço em placas de 12 poços, incubadas durante a noite a 37 ° C e tratada com a lunasin BBI ou durante 4 horas. Em seguida, as células foram tratadas com 1,5 ug /ml de DMBA durante 20 horas. Após lavagem com PBS, foi adicionado meio fresco. Os péptidos foram adicionados e o meio foi trocado a cada semana, durante 6 semanas. No final da experiência, as células foram lavadas com NaCl a 0,9%, fixadas com metanol, coradas com Giemsa, e teve de focos transformados. O controlo negativo foi um conjunto de células que não receberam DMBA, enquanto que o controlo positivo consistiu em células induzidas por DMBA, mas sem tratamento.

In Vitro

e

In Vivo

Biodisponibilidade estudos

In vitro

digestão de lunasina foi realizada seguindo o método publicado na United States Pharmacopeia [39]. lunasin sintético (American Peptide Company, Inc., Sunnyvale, CA, EUA) (5 ug) foi incubada com o BBI inibidores da protease ou KTI (Sigma, St. Louis, MO, EUA) durante 30 min a 25 ° C. A pancreatina de porcino pâncreas (Sigma) foi adicionado (enzyme:protein razão de 1:10) e solução foi incubada a 37 ° C durante 1 h. de tampão de amostra tris-tricina foi adicionado no final da reacção e imediatamente interrompida colocando os tubos num banho de água em ebulição durante 5 min. As digestões foram analisadas através de SDS-PAGE e Western-Blot seguindo o protocolo descrito anteriormente.

Biodisponibilidade estudos em ratinhos foram feitos no North Ver Pacífico Laboratories (Hercules, CA, EUA), de acordo com o Animal Care e Use Committee (ACUC) orientações humanos. Ratinhos CD-1 (3-5 semanas de idade) foram adquiridos à Jackson Laboratories (Bar Harbor, ME, EUA) e condicionando a dieta AIN76A durante uma semana. Quarenta ratos (20 do sexo masculino e 20 do sexo feminino) foram mantidos em jejum por 8 horas antes da administração oral por sonda gástrica. Os ratinhos foram separados em dois grupos, um grupo de controlo que recebeu 240 mg de formulação de LES e um grupo de tratamento recebe 240 mg de formulação les plus 8 uCi de

3H-lunasin (SibTech, Inc. Brookfield, CT, EUA) em 0,1 ml de solução de sacarose a 10%. Quatro ratinhos de cada grupo foram sacrificados a 3, 6, 9, 12 e 24 horas após a administração oral. As amostras de tecido foram recolhidas e preparadas para contagem de cintilação por solubilização em TS-2 solubilizador de tecido (Research Products International Corp., Chicago, IL, EUA) e adição de 15% de peróxido de benzoílo.