Sumário

A autofagia é um processo central na regulação da sobrevivência celular, a morte e proliferação celular e desempenha um papel importante na carcinogênese, incluindo o carcinoma da tiróide. A variação genética nos componentes autophagy foi demonstrada para influenciar a capacidade de executar autofagia e está associada a susceptibilidade à doença, a progressão e resultado. No presente estudo, avaliou-se a variação genética nos genes autofagia contribui para a susceptibilidade de desenvolver carcinoma de tireóide, a progressão da doença e /ou evolução de pacientes. Os resultados indicam que os pacientes portadores do

Atg5

individuais rs2245214 polimorfismos de nucleotídeo têm uma maior probabilidade de desenvolver carcinoma da tiróide (OR 1,85 (95% CI 1,04-3,23), P = 0,042). Por outro lado, poderiam ser observadas diferenças significativas para as outras variantes genéticas estudadas em termos de susceptibilidade carcinoma da tiróide. Além disso, nenhuma das variantes genéticas seleccionadas foram associados com os parâmetros clínicos de progressão da doença e do resultado. Em conclusão, a variação genética em

Atg5

, um jogador central no processo de autofagia, é encontrado para ser associado com um aumento da susceptibilidade para o carcinoma da tiróide, indicando um papel para a autofagia na carcinogênese de tireóide.

Citation : Plantinga TS, van de Vosse E, Huijbers A, Netea MG, Joosten LAB, Smit JWA, et al. (2014) Papel de variantes genéticas de genes Autophagy na susceptibilidade para o cancro de tiróide não-medular e pacientes Resultado. PLoS ONE 9 (4): e94086. doi: 10.1371 /journal.pone.0094086

Autor: David L. Boone, da Universidade de Chicago, Estados Unidos da América

Recebido: 13 de dezembro, 2013; Aceito: 10 de março de 2014; Publicação: 16 de abril de 2014

Direitos de autor: © 2014 Plantinga et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. TSP foi apoiado por uma bolsa Veni da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). MGN foi apoiado por uma bolsa Vici da Organização Holandesa para Pesquisa Científica (NWO). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

células epiteliais derivadas câncer de tireóide não-medular (NMTC) é a neoplasia maligna endócrina mais comum com uma incidência crescente nas últimas décadas dos quais carcinoma papilífero de tireóide (PTC) e carcinoma folicular (FTC) representam a grande maioria dos casos de [1] – [3]. Embora alguns eventos de iniciação do tumor e fatores de susceptibilidade foram identificados (exposição à radiação, vários fatores genéticos, tais como rearrarangements genéticos ou mutações no

RET

,

PTEN

e

APC

) [4], a patogênese da NMTC não é completamente compreendido. Uma melhor compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes envolvidas no desenvolvimento de NMTC poderia proporcionar ferramentas de diagnóstico e de prognóstico e poderia ser uma fonte potencial de novos alvos moleculares para a terapêutica.

Evidência crescente sugere que a autofagia desempenha um papel importante na fisiopatologia do processo maligno. Autophagy é um processo complexo de auto-digestão em condições de stress celular, hipóxia ou privação de energia. Após a activação, um autophagosome é formado que engole componentes celulares, tais como ribossomas, organelas e agregados de proteína, que são subsequentemente degradados por fusão do autophagosome com um lisossoma. Estes produtos de degradação podem ser reutilizados para a construção de macromoléculas e para o metabolismo da energia celular [5] – [7]. Além disso, a autofagia tem um papel importante na regulação da morte celular, a diferenciação celular, a indução de paragem do ciclo celular, e na modulação da inflamação [8]. Autophagy pode ter efeitos tanto preventivas e promocionais em tumorigénese, que é provavelmente dependente do tipo de início autofagia, tipo de células tumorais e a fase de desenvolvimento do tumor [9], [10]. Por isso, é importante identificar os mecanismos que regulam a autofagia em células transformadas malignas.

componentes essenciais do processo de autofagia são as proteínas altamente conservadas ATG evolutivos, dos quais mais de 30 foram actualmente sido identificados em leveduras [11 ], [12]. Variantes genéticas da linha germinal comuns dentro de genes que codificam para os componentes autophagy foram recentemente demonstrado estar associada com a doença humana, variando de doença inflamatória intestinal [13] – [15], para a neurodegeneração [16], doenças infecciosas [17], [18] e alergia [ ,,,0],19]. No entanto, apesar do seu papel central na iniciação e progressão do cancro, o papel da variação genética da linha germinativa comum dentro do sistema autofagia para susceptibilidade ao cancro, em particular NMTC, é largamente inexplorado. Recentemente, descreveu que uma variante genética no gene autofagia

ATG16L1

tem um impacto importante na suscetibilidade a NMTC [20]. No presente estudo, ampliou o objectivo da nossa investigação para avaliar a associação potencial de uma gama muito mais ampla de variantes genéticas em genes autofagia com susceptibilidade para NMTC, progressão e resultado.

Materiais e Métodos

Ética declaração

o estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da Radboud University Medical Centre, Nijmegen, Holanda. Todos os indivíduos deram seu consentimento informado. O estudo foi realizado de acordo com a Declaração de Helsinki.

pacientes com carcinoma da tiróide

Todos os pacientes com diagnóstico histológico de células epiteliais não-medular derivado NMTC que visitou o ambulatório da Divisão de Endocrinologia do Departamento de Medicina interna da Universidade Radboud Medical Centre, Nijmegen, Holanda, foram convidados a participar de testes genéticos. O recrutamento dos pacientes ocorreu entre novembro de 2009 e junho de 2010. O tratamento primário dos pacientes consistiu de tireoidectomia total ou quase total em todos os pacientes, e dissecações de linfonodos radical modificada em pacientes com metástases ganglionares confirmados. Isto foi seguido por ablação com iodo radioactivo (I

131, RAI) de tecido residual da tiróide 4-6 semanas após a cirurgia. Se necessário, os pacientes foram tratados múltiplas vezes com RAI para atingir a remissão. cura inicial foi definida como indetectável hormônio estimulante da tireóide estimulado tireoglobulina (Tg) na ausência de anticorpos anti-Tg e sem evidência de doença loco-regional ou metástase à distância em varreduras integrais de iodo corpo (PEP) e /ou exames pescoço ultra-sonografia em seis a nove meses após a ablação com radioiodo. recorrência do tumor foi definida como nova evidência de doença loco-regional ou metástase distante após a terapia primária bem sucedida. Status atual da doença foi definida como “em remissão” em caso de Tg indetectável na ausência de anticorpos anti-Tg e sem evidência de doença loco-regional ou metástases à distância na última visita de acompanhamento. estado de doença persistente foi definido como detectável Tg e /ou evidência de doença loco-regional ou metástases à distância.

As características demográficas e clínicas (histologia do tumor e estadiamento TNM), tratamento (número de sessões de terapia da RAI, a dose cumulativa RAI ), o acompanhamento do tempo, o número de re-operações e radioterapia externa, se for o caso, foram recuperados a partir de registros médicos do paciente (Tabela 1). O grupo de controlo com base população holandesa consistiu de 189 controles saudáveis ​​(48% mulheres, com idade média de 61 ± 10 (DP) anos), tendo nenhuma evidência de câncer de tireóide ou outras doenças malignas.

A genotipagem

o sangue venoso foi retirado da veia cubital de todos os participantes em 10 ml tubos de EDTA (Monoject). O ADN foi isolado a partir de sangue total usando o kit de isolamento de Puregene (Gentra Sytems, MN, EUA), de acordo com o protocolo do fabricante. Codificação polimorfismos não sinónimas individuais (SNPs) e algumas SNPs em regiões não traduzidas dos genes analisados ​​foram seleccionados com base em associações previamente publicados com doenças humanas e /ou funcionais conhecidos efeitos sobre a função da proteína ou a expressão do gene. Um total de 10 SNPs no

ATG2B

,

Atg5

,

ATG10

,

IRGM

,

LAMP1

,

LAMP3

e

WIPI1

foram genotipados (Tabela 2) com a utilização de uma plataforma de genotipagem-espectrometria de massa. Todos os SNPs são em equilíbrio de Hardy-Weinberg em ambos os grupos de doentes e de controlo. O controle de qualidade foi realizado através da duplicação de amostras dentro e através de placas e pela incorporação de amostras de controlo positivas e negativas.

A análise estatística

A diferença de freqüências genotípicas entre os pacientes e o controle grupo foram analisados ​​em uma dosagem dominante, gene e modelo recessivo meio de regressão logística. O efeito dos genótipos sobre epitelial derivado susceptibilidade NMTC foi estimada pelo cálculo odds ratio (OR) e seus intervalos de confiança de 95% (IC 95%) usando os mesmos métodos estatísticos. Também realizamos χ

2 análise, e se regressão logística aplicável, para determinar se o tamanho do tumor, a dose RAI cumulativa, número de tratamentos RAI, o estado da doença após a tireoidectomia além de rádio-ablação (se aplicável) e o estado actual da doença foram associados com o genótipo dos genes autophagy analisados. Foram analisados ​​os seguintes parâmetros: 1) o tamanho do tumor no momento do diagnóstico foi classificada de acordo com a 6

ª edição da classificação UICC TNM [21]; 2) o número de tratamentos RAI (incluindo RAI ablação) como 0-1 tratamentos (por exemplo, sem ablação RAI ou exclusivamente ablação de remanescentes tireoideanos após (perto) tireoidectomia total) ou ≥ 2 tratamentos; 3) a dose cumulativa RAI como 0-3.7 GBq (0-100 mCi), 3.8-7.4 GBq (101-200 mCi) ou 7,4 GBq ( 200 mCi); 4) o estatuto da doença após a ablação como remissão ou persistente e 5) o estado actual da doença, como a remissão, persistente ou recorrente (após a remissão documentado).

Para testar as diferenças entre os três grupos de genótipos diferentes (wild homozigoto -tipo (antiga), heterozigotos, variante homozigoto (derivado)) na média de idade no momento do diagnóstico, distribuição por sexo ou histologia do tumor (potenciais fatores de confusão), foram utilizados ANOVA one-way e Pearson χ

2 análise, quando apropriado. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o pacote de software SPSS (versão 20.0). No geral, os testes estatísticos foram um valor de p frente e verso e menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

susceptibilidade genética análise

De todos os pacientes com NMTC que visitaram ambulatório do Centro Universidade Radboud Medical, Nijmegen, Holanda, entre Novembro de 2009 e Junho de 2010, 139 pacientes (104 mulheres, com idade média de 38,9 ± 12,8 (SD) anos no momento da coleta de sangue) concordaram em participar do estudo. As características clínicas e demográficas dos pacientes NMTC estão resumidos na Tabela 1. Foram encontradas diferenças estatisticamente significativas entre os pacientes com genótipos diferentes autofagia variante genética em relação à média de idade no momento do diagnóstico, sexo ou histologia do tumor (dados não mostrados).

a análise estatística de variantes genéticas autofagia para susceptibilidade NMTC revelou uma assocation estatisticamente significativa com o em> Atg5

rs2245214 polimorfismo

genótipo – associações fenótipo

Dentro da coorte NMTC paciente, as associações entre o genótipo e o tamanho do tumor (estádio T), número de I

131 tratamentos, cumulativos I

131 doses, o estado da doença após ablação eo estado actual da doença foram avaliados através de Pearson χ

2 análise. Para o

Atg5

single nucleotide polymorphism rs2245214 os resultados são apresentados na Tabela 4. Não houve diferenças estatisticamente significativas entre os pacientes nos diferentes grupos de genótipos com relação ao estadiamento TNM, número de tratamentos RAI, a dose RAI cumulativos e estado actual da doença (Tabela 4). Além disso, nenhuma associação foi observada para qualquer uma das outras variantes genéticas autofagia investigado com estes parâmetros clínicos (dados não mostrados).

Discussão

O presente estudo foi realizado para investigar se comum variantes genéticas nos genes autophagy humanas estão associados com a susceptibilidade NMTC, severidade e /ou o resultado clínico. Descobrimos que uma das variantes genéticas selecionadas, o

Atg5

single nucleotide polymorphism rs2245214, está significativamente associado à susceptibilidade NMTC, mas não com severidade NMTC ou resultado. Além disso, nenhum dos outros SNPs autophagy seleccionados foram associados com a susceptibilidade quer para NMTC, gravidade da doença ou do resultado clínico.

Todas as proteínas investigados estão envolvidas na maquinaria autofagia, alguns na fase precoce da autophagosome formação (ATG2B, Atg5, ATG10, IRGM e WIPI1), os outros na fase final da fusão autophagosome-lisossoma (LAMP1 e LAMP3) [22], [23]. No processo de formação autophagosome, Atg5 é recrutado para fazer parte de um grande complexo de proteínas, juntamente com ATG12 e ATG16L1 para montar a dupla membrana que envolve a carga autofágica [24], [25]. Autofagia está ativo em níveis basais em todos os tipos de células, onde acredita-se para desempenhar um papel de limpeza na reciclagem de componentes intracelulares.

Em termos de carcinogênese, o papel da autofagia é complexo e depende do tipo de câncer e o estágio da doença. Defeitos na autofagia pode mediar carcinogênese através da acumulação de agregados de proteínas e organelas danificadas. Por outro lado, em células apoptóticas-competente autofagia é citoprotectora, uma vez que estas células dependem autofagia para cobrir a sua maior gasto de energia [9]. Apesar do importante papel da autofagia para a patogênese do câncer, surpreendentemente pouco se sabe sobre a variação genética nos genes autofagia e sua influência na carcinogênese. No presente estudo, avaliou-se o efeito de uma ampla gama de variantes genéticas em genes autofagia para susceptibilidade e resultado do tratamento de células epiteliais diferenciadas derivadas NMTC.

O presente estudo de associação genética revelou que o alelo G do

Atg5

rs2245214 SNP está associada com aumento da susceptibilidade para o desenvolvimento de NMTC. Em contraste, este

Atg5

SNP não foi associada com a gravidade da NMTC e os resultados que se reflecte estadiamento TNM, a dose cumulativa RAI e persistência da doença. O fato de que as variantes genéticas nos outros genes autofagia selecionadas não estão associados com a susceptibilidade NMTC e gravidade em nossa coorte de pacientes NMTC poderia indicar que quer estas proteínas não têm papel de destaque na carcinogênese NMTC ou as consequências das variantes genéticas para a função de as respectivas proteínas é relativamente limitada. No entanto, estudos de replicação em outras coortes NMTC devem ser realizados para demonstrar firmeza a falta de associação destas variantes genéticas com susceptibilidade NMTC e gravidade.

A variação genética em

Atg5

foi previamente ligado ao sistêmica lúpus eritematoso (mesmo SNP) [26], [27], asma [19] e doenças neurodegenerativas [28], indicando o importante papel de Atg5 na saúde humana e doenças. No entanto, as consequências destas variantes genéticas de

Atg5

para a função da proteína são ainda desconhecidas e garante uma investigação mais aprofundada que deveria incluir também relatado anteriormente funções não autofágicos de Atg5 [29], [30].

o nosso relatório anterior da associação genética do

ATG16L1

polimorfismo T300A (rs2241880) com a susceptibilidade NMTC e gravidade [20] é agora alargada pela associação demonstrada pelo

Atg5

polimorfismo rs2245214 com a susceptibilidade NMTC no presente estudo, confirmando o papel da autofagia na patogênese NMTC. De nota, não há efeitos aditivos dos dois SNPs em

Atg5

e

ATG16L1

foram observados, indicando que os dois SNPs agem de forma independente. Curiosamente, tanto o papel da autofagia em NMTC e o potencial terapêutico de alvejar autofagia para o tratamento NMTC são confirmados por outros estudos [10], [31] – [33].

Vários estudos têm demonstrado a importância do papel autofagia na patogênese NMTC, o que representa uma das vias a jusante mais proeminentes da freqüência aberrante regulamentado RAS /RAF /MEK /ERK e PI3K /Akt /mTOR vias em NMTC, levando a inativação da máquina autofagia [34], [35]. De acordo com estes estudos, a reactivação de autofagia por inibição dos resultados da mTOR quinase em ressensibilização de NMTC à quimioterapia e à radioterapia [33]. Em contraste, tem sido descrita também efeitos opostos de sinalização através destes oncogenes que activam autofagia basal, indicando os efeitos complexos e dependente do contexto destas vias de sinalização dos autofagia [36] – [38]. variantes genéticas de genes autofagia levando a quer menos ou mais máquinas autofagia funcional pode, posteriormente, resultar em sensibilidade terapia abolida e aumentou carcinogênese, proporcionando um potencial mecanismo subjacente às associações genéticas observadas. Estudos adicionais são necessários para dissecar o papel da autofagia em qualquer promoção ou inibição da carcinogênese e sensibilidade terapêutica no contexto da subtipos NMTC para identificar as terapias específicas mais eficazes.

Um ponto importante a ser considerado é o de correcção para testes múltiplos neste estudo. Tem que ser tido em conta que, ao aplicar a correção para testes múltiplos, a significância estatística do

Atg5

rs2245214 associação SNP com a susceptibilidade NMTC está perdido. Outra limitação que tem de ser levado em conta é os pontos de dados em falta para a avaliação clínica da TNM stageing, o que diminuiu o poder estatístico para demonstrar diferenças significativas. Os resultados obtidos no presente estudo, portanto, precisam ser confirmados em maiores coortes prospectivas, a fim de tirar conclusões definitivas sobre o papel definitivo dos polimorfismos genéticos descritos aqui. Apesar disso, é no entanto importante observar que a associação anterior entre

ATG16L1 Comprar e NMTC fornece apoio indireto para os resultados do presente estudo.

Em conclusão, nós identificamos o

Atg5

variante genética rs2245214 como um fator de susceptibilidade genética na carcinogênese de tireóide. Estes achados enfatizam o potencial terapêutico da modulação da Atg5 e ATG16L1, muito provavelmente como parte do mecanismo de autofagia, como uma nova modalidade terapêutica em pacientes NMTC.