Abstract

β-catenina desempenha duplo papel na adesão a formação do complexo e a via de sinalização Wnt . Embora a expressão β-catenina parece estar regulada positivamente e via de sinalização Wnt é activado na maioria dos cancros, o seu nível de expressão parece ser perdida no cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC). Nós relatado anteriormente que o promotor de β-catenina foi hipermetilado em duas linhas celulares de NSCLC. No presente estudo, nós expandido nossa análise para o estado de metilação da região promotora β-catenina e a sua expressão da proteína em sete linhas de células NSCLC e uma série de 143 casos de cancro do pulmão humano primário com tecidos adjacentes não neoplásicas. metilação quantitativa análise de PCR específica (qMSP) mostrou metilação da região promotora β-catenina em cinco linhas celulares de NSCLC, com os níveis de proteína β-catenina aumentada após 5′-Aza-2′-desoxicitidina tratamento (5-aza-dC). O estado de metilação em SPC (metilado) e A549 (não metilado) foi confirmada por sequenciação de bissulfito de PCR. o tratamento com 5-aza-dC inibida invasividade de CCP, mas não A549. Análise por imunofluorescência mostrou membranosa expressão β-catenina foi perdido no CCP e poderia ser re-estabelecido pela 5-aza-dC, enquanto que o tratamento Wnt3a levou a translocação nuclear de β-catenina tanto SPC e A549. Os ensaios de luciferase dupla indicou que a 5-aza-dC tratamento não causou qualquer aumento significativo na actividade de sinalização Wnt em comparação com o tratamento Wnt3a. O efeito do agente de desmetilação no CCP pode ser revertida pela depleção β-catenina mas não depleção de E-caderina, que indicou que a metilação silenciamento mediado β-catenina pode melhorar NSCLC invasão e metástase de um modo independente de E-caderina. resultados de imunohistoquímica subsequentes confirmaram ainda que β-catenina promotor hipermetilação correlacionada com a perda de expressão imunorreativo proteínas, metástase linfonodal positivo, estágio de alta TNM e mau prognóstico. O presente estudo implica β-catenina hipermetilação do promotor no mecanismo de mudanças epigenética subjacentes NSCLC metástase e progressão, indicando, assim, o potencial de β-catenina como um novo alvo epigenética para o tratamento de doentes com NSCLC

citação:. Miao Y, Wang L, Zhang X, Xu X, Jiang G, C Fan, et ai. (2014) metilação do promotor-Mediated silenciamento de β-catenina Melhora Invasividade de Non-Small Cell Lung Cancer e prevê prognóstico adverso. PLoS ONE 9 (11): e112258. doi: 10.1371 /journal.pone.0112258

editor: Pier Giorgio Petronini, Universidade de Parma, Itália |

Recebido: 17 Abril, 2014; Aceito: 09 de outubro de 2014; Publicação: 14 de novembro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Miao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81.000.942 para Yuan Miao e No. 30.900.562 para Yang Liu) . Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O cancro do pulmão continua a ser um grande desafio clínica por causa de suas más opções de prognóstico e tratamento limitado [1]. A elevada taxa de mortalidade de cancro do pulmão é devido em grande parte a falha de um diagnóstico precoce e metástases frequentemente observada no momento do diagnóstico [2]. Análise das mudanças biológicos envolvidos na patogênese dessa doença maligna, a identificação nos estágios iniciais, e a prevenção de metástases, portanto, podem ser as principais opções para melhorar o prognóstico sombrio geral deste câncer.

A invasão tumoral e metástase ocorre quando as células tumorais adquirem a capacidade de separar a partir do tumor primário e entrar em canais circundantes ou tecidos linfovascular, um processo que é criticamente dependente da ruptura das junções de adesão entre as células tumorais [3]. β-catenina é especialmente interessante durante este processo, uma vez que não só participa neste complexo de adesão, mas também uma parte integrante da via de sinalização Wnt [4] – [6]. Uma grande maioria de cancros incluindo colo, hepatocelular, da tiróide, e cancros do ovário, porto mutações β-catenina e alterações em outros genes, tais como o gene de APC, o que leva à acumulação nuclear de β-catenina e a activação da via de sinalização Wnt [ ,,,0],4], [7], [8]. No entanto, as evidências indicam que a expressão nuclear de β-catenina é rara e atividade de sinalização Wnt é regulada negativamente no cancro do pulmão [5], [9] – [11]. Um número crescente de estudos têm descrito e analisado a associação entre a perda de expressão β-catenina e os parâmetros clínico em pacientes com câncer de pulmão [9], [11]. No entanto, os mecanismos subjacentes permanecem controversos. Um relatório recente mostrou que o nível de proteína β-catenina não foi afectada pela depleção de E-caderina [12]. Portanto, deve haver outros mecanismos responsáveis ​​pela expressão β-catenina regulados negativamente em NSCLC.

aberrante metilação do promotor poderia resultar no silenciamento de genes em vários tumores malignos, incluindo o cancro do pulmão [13], [14]. Embora a via de sinalização Wnt foi activado e expressão β-catenina foi regulada positivamente no carcinoma gástrico primário, Ebert

et ai.

Mostrou que o promotor de β-catenina foi hipermetilado o que levou a perda da expressão β-catenina na célula linha derivada de metástases hepáticas de câncer gástrico, mas não aqueles cancros primários [15]. Tomados em conjunto, especulamos que a metilação de promotores β-catenina pode desempenhar um papel na regulação da capacidade de invasão de células cancerosas. O nosso mais recente relatório constatou que a hipermetilação dos promotores de β-catenina foram vistos em duas linhas de células NSCLC primárias, que diferiam que no câncer gástrico [16]. Uma vez que as atividades da via de sinalização Wnt foi menor em NSCLC do que em outros tipos de câncer, a hipótese de que a hipermetilação dos promotores de β-catenina em NSCLC pode explicar a freqüência de metástase alto e mau prognóstico em pacientes com NSCLC.

Aqui, estudamos o impacto da progressão do tumor statuson metilação do promotor β-catenina e invasão, através da utilização de ambas as linhas de células de câncer de pulmão e amostras de pacientes como os nossos modelos experimentais.

Materiais e Métodos

amostras de tecido humano e linhas de células

Este estudo foi realizado com a aprovação do conselho de revisão institucional na China Medical University (Shenyang, China). consentimento escrito foi dada pelos participantes para informação a ser armazenada na base de dados do hospital para os espécimes para ser utilizado neste estudo. Toda a investigação clínica tem sido conduzido de acordo com os princípios expressos na Declaração de Helsinki. Cento e quarenta e três casos de cancro do pulmão humano primário com correspondentes tecidos adjacentes não neoplásicas que se submeteram à ressecção cirúrgica com intenção curativa, foram coletadas a partir do primeiro hospital afiliado da China Medical University, entre Outubro de 2004 e Julho de 2006. sobrevivência dos pacientes foi definida como o tempo desde o dia da cirurgia para o final do follow-up ou dia da morte por recidiva ou metástase. Nenhum dos doentes recebeu radioterapia ou quimioterapia antes da ressecção cirúrgica, e todos os pacientes receberam quimioterapia após a cirurgia de rotina. A população do estudo do paciente tem sido relatada na literatura nosso anterior [17]. O grau de diagnóstico e diferenciação histológica foram avaliadas em hematoxilina e eosina secções coradas, de acordo com as diretrizes de classificação da OMS de 2004 [18]. Todas as 143 amostras foram reavaliados em relação ao subtipo histológico, a diferenciação e a fase do tumor. O estadiamento do tumor foi determinada de acordo com a sétima edição da União Internacional contra o Sistema Câncer (UICC) TNM Staging para o câncer pulmonar [19]. As amostras incluiu 44 casos de carcinoma do pulmão de células escamosas e 99 casos de adenocarcinoma de pulmão. Cinquenta e um tumores eram bastante diferenciadas e 92 tumores foram moderadamente ou pouco diferenciados. As metástases linfonodais estavam presentes em 70 casos e ausente em 73 casos. Os tumores incluídos 81 casos de doença em estágio I-II e 62 casos de fase III

A-III

doença B.

linhas celulares Sete NSCLC, comumente usados ​​em nosso laboratório, foram selecionados para celular experimentos. As linhas celulares HBE, A549 e H1299 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). O PG-BE1 (BE1), PG-LH7 (LH7), linhas celulares SPC-A-1 (SPC) e LTEP-A-2 (LTE) foram obtidos a partir de Xangai Cell Bank (Xangai, China). Todas as células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) contendo 10% de soro fetal de vitelo (Invitrogen), 100 UI /ml de penicilina (Sigma, St. Louis, MO, EUA), e 100 ug /ml de estreptomicina ( Sigma). As células foram cultivadas em placas de cultura estéreis e passadas a cada 2 dias utilizando tripsina a 0,25% (Invitrogen).

extracção de ADN e em tempo real quantitativo metilação específicas de reacção em cadeia da polimerase

O ADN genómico foi extraído a partir de linhas de células e secções de 10 um de espessura de 10%, os blocos de tecido de tumor neutros fixadas em formalina e embebidas em parafina, utilizando o QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Alemanha). O ADN genómico foi tratada com bissulfito de sódio usando um kit de ADN metilação EZ (D5005, Zymo Research, Orange, CA, EUA). Os ensaios de metilação específicas de reacção em cadeia da polimerase em tempo real (PCR) foram realizadas no sistema de PCR ABI 7900HT rápido em tempo real (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os pares de iniciadores foram como se segue: β-catenina para a frente, 5′-GGAAAGGCGCGTCGAGT-3 ‘e inverso, 5′-TCCCCTATCCCAAACCCG-3′, com a sonda TaqMan 5’-6FAM- CGCGCGTTTCCCGAACCG-TAMRA-3 ‘; p-actina para a frente, 5’-TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT-3 ‘e inverso, 5′-AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA-3′, com a sonda TaqMan 5’-6FAM-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-TAMRA-3 ‘. O gene β-actina de limpeza (ACTB) foi utilizado para normalizar uma reacção de controlo independente metilação. Para a quantificação relativa, a quantidade de ADN metilado (percentagem de referência desnaturado) a uma região de promotor β-catenina foram normalizados para o valor de metilação do calibrador, o qual foi definido como 100%. Universal DNA metilado (QIAGEN) foi utilizado como o calibrador. A percentagem de referência metilado foi definida como 100 × 2

(sampleACTB (CT) – sampleβ-catenina (CT)) /2

(calibratorACTB (CT) – calibratorβ-catenina (CT)) [20]. Para discriminar entre níveis de metilação individuais, um valor de corte de 4% ou maior foi definida como “desnaturado” e um valor de corte inferior a 4% como “não metilado” com base em um estudo anterior [21].

Bissulfito sequenciamento PCR (BSP) de promotores β-catenina

Foi utilizado o software v1.0 metil Primer Express (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA) para analisar o

CTNNB1

região promotora do gene -1,124-11,114 pb. ADN a partir de células do cancro do pulmão foi extraído e depois foi tratada com bissulfito de sódio usando um kit de ADN metilação EZ (Zymo Research) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores específicos para o promotor β-catenina para sequenciação bissulfito foram construídos usando dados de sequência de promotor e software de desenho de primers (Primer Premier 5; Premier Biosoft International, Palo Alto, CA, EUA); as sequências de iniciadores são mostrados na Tabela 1. Os iniciadores foram concebidos para amplificar uma região rica em CpG do promotor abrangendo 189 locais CpG (19 locais CpGCpG). Os produtos de PCR foram purificados utilizando o kit de extracção de purificação de ADN multifuncional (DP1501, BioTeke Corporação, Pequim, China) e ligado ao vetor simples pum-T (DP6803, BioTeke Corporação, Pequim, China), e, pelo menos, cinco clones separados, cada um foram escolhido para a análise da sequência de BIQ Analyzer.

O tratamento com 5-aza-dC e Wnt3a

células de câncer de pulmão cultivadas foram tratadas com diferentes concentrações de 5-aza-2′-desoxicitidina (5-aza-dC) (Sigma) dissolvido em meio de cultura a cada 24 horas. Utilizando ensaios q-MSP e MTT, a concentração da droga necessária para promotor β-catenina CpG island desmetilação com nenhum efeito significativo sobre o crescimento celular foi seleccionado (7 uM) e as células foram recolhidas após cultura continuada durante 48 horas (Figura S1).

As células foram tratadas com 500 ng /ml recombinante Wnt3a (R D Systems, Minneapolis, MN, EUA).., durante 48 horas

pequeno ARN interferente tratamento

linhas celulares foram plaqueadas em placas de seis poços com meio fresco sem antibióticos durante 24 h antes da transfecção. As células foram transfectadas com β-catenina siRNA (SC-29209, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA), a caderina-E siRNA (SC-35242, Santa Cruz) e ARNsi de controlo (SC-37007, Santa Cruz Biotechnology), utilizando Lipofectamine-2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Todos os ARNic eram compostas por um conjunto de duas específica do alvo 19-25 nt siRNAs, As células foram colhidas 48 horas após a transfecção.

análise de Western blot.

A proteína total a partir de células extraiu-se em tampão de lise (Pierce) e quantificada através do método de Bradford. Em seguida, as proteínas (50 ug) foram separadas por SDS-PAGE (12%) e transferida para o fluoreto de polivinilideno (PVDF) de membrana (Millipore, Billerica, MA, EUA). Subsequentemente, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com anticorpos monoclonais contra a E-caderina (SC-8426, 1: 200; Santa Cruz Biotechnology), β-catenina (610154, 1: 500; BD Transduction Laboratories, Lexington, KY, EUA ) ou GAPDH (SC-365062, 1: 500, Santa Cruz Biotechnology). Após incubação com peroxidase acoplada de ratinho anti-IgG (Santa Cruz Biotechnology) a 37 ° C durante 2 h, as proteínas ligadas foram visualizadas utilizando ECL (Pierce) e detectados utilizando sistemas bioimaging (UVP Inc., Upland, CA, USA). Os níveis de proteína relativos foram calculados com base na proteína de GAPDH como um controlo de carga.

ensaio de invasão de Matrigel.

Os ensaios de invasão celular foram realizadas utilizando um Transwell-24 bem câmara com um tamanho de poro de 8 um (Corning Costar Transwell, Cambridge, MA, EUA), e as pastilhas foram revestidas com 20 ul de Matrigel (01:03 diluição, BD Biosciences). Em seguida, 48 h após a transfecção, as células foram tripsinizadas e transferidas para a câmara superior de Matrigel em 100 ul de meio isento de soro contendo 3 × 10

5 células e incubou-se durante 16 horas. Meio suplementado com FBS a 10% foi adicionada à câmara inferior, como o quimioatractor. Os números de células invasoras foram contadas em 10 campos de microscópio de alta potência seleccionados aleatoriamente. As experiências foram realizadas em triplicado

imunofluorescente coloração.

As células foram fixadas com paraformaldeído a 4%, bloquearam-se com BSA a 1% e depois incubadas com o anticorpo monoclonal β-catenina (610154, 1. : 400; BD Transduction Laboratories) durante a noite a 4 ° C, seguido por incubação com anticorpos secundários conjugados com isotiocianato de fluoresceína (FITC) (1: 200, Zhongshan ponte golden, Pequim, China), a 37 ° C. Os núcleos foram contrastadas com 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI). microscopia de epifluorescência foi realizada utilizando um microscópio Nikon TE300 invertido (Melville, Nova Iorque, EUA) e microscopia confocal foi realizada utilizando um radiante 2000 varrimento a laser microscópio confocal (Carl Zeiss, Thornwood, NY, EUA).

Dual-luciferase ensaios.

as transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As células foram plaqueadas em placas de 24 poços durante 24 h antes da transfecção com plasmídeos de gene repórter pGL3-OT ou pGL3-DOS (0,5 mg), em conjunto com o plasmídeo de controlo de pRL-TK (50 ng). Após incubação durante 30 h a 37 ° C, a expressão do gene repórter foi detectado pela Dual-Luciferase Assay System (Promega, Madison, WI, EUA). actividade de transcrição de genes mediada por TCF foi determinada pela razão de pGL3-OT para pGL3-de actividade de luciferase, que foi normalizada para a actividade da luciferase de Renilla a partir do plasmídeo de controlo de pRL-TK. Todas as experiências foram realizadas, em duplicado, um mínimo de três vezes. Para analisar os efeitos de 5-aza-dC e β-catenina siARN sobre a sinalização de Wnt, foi adicionado 5-aza-dC e β-catenina siARN foi co-transfectado com pGL3-OT ou pGL3-por ensaios de luciferase.

a imuno-histoquímica (IHC)

análise imunohistoquímica da expressão β-catenina foi realizada utilizando um anticorpo específico β-catenina-monoclonal (610154, 1: 200; BD Transduction Laboratories) tal como descrito anteriormente e foi avaliada de acordo com a nosso relatório anterior [17], [22].

a análise estatística.

SPSS versão 13.0 para Windows (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA) foi utilizado para todas as análises. Os testes qui-quadrado e correlação de Spearman foram utilizados para examinar possíveis correlações de estado de metilação β-catenina em NSCLC com o seu estado de metilação no tecido pulmonar normal adjacente e fatores clínico-patológicas. O U-teste de Mann-Whitney foi utilizado para analisar os resultados do q-MSP, Western blot, ensaios de invasoras Matrigel e ensaios Dual-luciferase. O método de Kaplan-Meier foi utilizado para estimar a probabilidade de sobrevida do paciente, e as diferenças na sobrevivência dos subgrupos de pacientes foram comparadas pelo teste de log-rank de Mantel. Os dados foram apresentados como a média de experiências realizadas em triplicado.

P

. 0,05 foi considerado para indicar diferenças estatisticamente significativas

Resultados

Análise do estado de metilação da região promotora do gene da β-catenina em células de câncer de pulmão

Os níveis de metilação do promotor β-catenina foram testados em linhas celulares de cancro do pulmão. Como mostrado na Figura 1A, cinco linhas celulares (LH7, BE1, SPC, LTE e H1299) exibiram elevados níveis de metilação, enquanto duas linhas de células (HBE e A549) foram não metilado. Análise da região promotora do gene CTNNB1 -1124 – 11114 pb em linhas celulares de NSCLC, revelou a presença de duas ilhas de CpG nas posições -1,124 – 876 e 10.676 – 11.114, respectivamente. Estas sequências continha 189 únicos locais CG, dos quais 19 eram CG-dinucle�idos. Utilizando o método de sequenciamento genômico bissulfito de sódio, nós projetamos primers para analisar as primeiras ilhas CpG em uma região par 1.331 de base (-614-717) contendo parte da região do promotor de β-catenina em toda a sua local de início da transcrição no RCM e linhas de células A549 . Múltiplos sítios de metilação foram identificados em células de CCP, enquanto que apenas alguns resíduos de 5-metilcitosina foram observadas em clones sequenciados vários derivados a partir de células A549 (Fig. 1B e 1C).

(A) análise quantitativa do MSP β região do promotor -catenina em linhas celulares de NSCLC. (B) a região promotora do gene β-catenina: Posição de ilhas de CpG e desenho de primers são indicadas por linhas e setas. (C) metilação de um dos 19 CG-dinucleótidos na região -614 pb para -270 pb de ambos A549 e SPC. círculos preenchidos representam locais CG metilados, círculos não preenchidos representam locais CG não metiladas.

células Tratar com 5-aza-CC Restaurado expressão β-catenina e capacidade de invasão das células do cancro do pulmão inibida através de re-estabelecer membranoso β-catenina expressão em vez de através da activação da via de sinalização Wnt

a química 5-aza-dC foi usado tanto in vitro e in vivo para inibir a metilação de DNA. Neste estudo, todas as sete linhas de células (HBE, LH7, BE1, SPC, A549, H1299 e LTE) foram tratadas com 5-aza-dC (Fig. 2A, 2B). Expressão de β-catenina foi restaurado em cinco linhas de células (LH7, BE1, SPC, LTE e H1299) em que β-catenina metilação do promotor tinha sido previamente confirmadas. No entanto, não houve mudanças significativas foram observadas nas linhas celulares HBE e A549 (não metiladas). Foi investigada mais profundamente os efeitos de 5-aza-dC tratamento sobre a capacidade de invasão de linhas celulares de pulmão. Como mostrado nas Figuras 2C e 2D, o tratamento com 5-aza-dC resultou na inibição marcada da capacidade de invasão de células de CCP, enquanto não houve qualquer efeito mensurável nas células A549 (Ver Figura S2 para matrigel resultados em outras linhas de células). Subsequentemente, a capacidade de 5-aza-dC para activar a via de sinalização Wnt foi investigada usando células simuladas-proteína Wnt3a como um controlo positivo. Em comparação com as células tratadas com Wnt3a, os ensaios de luciferase dupla revelou que a 5-aza-dC tratamento resultou em nenhuma alteração significativa nas actividades de sinalização de Wnt (Fig. 2E). Análise por imunofluorescência revelou que o tratamento com 5-aza-dC restaurado membranosa expressão β-catenina em SPC, mas não as células A549. Além disso, a expressão β-catenina foi detectado no núcleo em células tratadas com Wnt3a, enquanto que, uma distribuição membranoso foi observada em células não tratadas (Fig. 2F). Tomados em conjunto, estes dados sugerem que, ao contrário de outros carcinomas, metilação do promotor de β-catenina era um fenómeno comum em NSCLC, e pode ser responsável pela regulação negativa da expressão β-catenina melhorar a capacidade de invasão de células de cancro de pulmão.

os níveis de (a), proteína de β-catenina após o tratamento com 5-aza-dC (7 uM) em linhas celulares de NSCLC. (B) Quantificação da expressão da proteína após o tratamento com 5-aza-dC. (C) Imagens representativas de células na parte inferior das membranas Transwell mostram as alterações no número de células invasivas (400 ×, barra de escala = 50 uM). (D) Número de células invasoras sobre a superfície inferior do filtro foi contada, cada um realizado em triplicado. (As barras representam SD *

P

. 0,05, em comparação com o controle). (E) Dual-luciferase resultados do ensaio mostram que a 5-aza-dC tratamento não resultou em alterações significativas nas actividades de sinalização de Wnt em comparação com as células tratadas Wnt3a. Cada uma das experiências foi repetida em triplicado. (D) A coloração por imunofluorescência mostrando que β-catenina está localizada principalmente na membrana em linhas de células A549 e SPC. O tratamento com 5-aza-dC alteradas as quantidades de expressão β-catenina membranoso. No entanto, β-catenina foi translocada para o núcleo após tratamento Wnt3a (Barra de escala = 20 um, anticorpo β-catenina foi substituído por IgG normal de rato como controlo negativo).

5-aza-dC tratamento restaurado expressão β-catenina em um e-caderina forma independente

de modo a confirmar ainda mais a função de metilação do promotor de β-catenina, siARN β-catenina específico, foi introduzido dentro do SPC e células A549. Em comparação com células transfectadas com ARNsi de controlo scrambled, as células transfectadas com ARNsi β-catenina exibiram reduzida β-catenina e expressão de E-caderina, que não podem ser recuperadas por tratamento com 5-aza-dC (Fig. 3A, B). A seguir, derrubado E-caderina com ARNsi de E-caderina específicos de nestas duas linhas celulares. A expressão da E-caderina foi reduzida em ambas as células A549 e SPC, ao passo que, a expressão β-catenina não estava visivelmente diminuído pela depleção de E-caderina em comparação com o controlo. Com 5-aza-dC tratamento, expressão β-catenina foi significativamente regulada positivamente em células de CCP, independentemente da expressão de E-caderina (Fig. 3C e D). Foi investigada mais profundamente os efeitos de 5-aza-dC tratamento quando introduzido com β-catenina-siRNA e E-caderina-siARN da capacidade de invasão de linhas celulares de pulmão. Como mostrado nas Figuras 3E e 3F, quer β-catenina ou depleção de E-caderina conduziu a um aumento significativo na capacidade invasiva de ambas as células A549 e SPC. Por 5-aza-dC tratamento, o número de células migratórias foi significativamente reduzida em células de CCP E-empobrecido-caderina, que não foi observada em células A549. No entanto, as capacidades invasivas das células A549 e SPC β-catenina-empobrecido não foram, obviamente, inibida por tratamento com 5-aza-dC. Além disso, os ensaios de luciferase dupla revelou que nenhum 5-aza-dC tratamento nem β-catenina depleção resultaram em mudanças significativas na actividade de sinalização Wnt comparado com células tratadas com Wnt3a (Fig. 3G). Por conseguinte, a inibição da expressão de β-catenina por sua metilação do promotor parece regular negativamente a capacidade de invasão de células de cancro de pulmão de um modo independente de E-caderina. coloração de imunofluorescência mostrou que o membranosa β-catenina é aumentada por tratamento com 5-aza-dC apenas na linha de células de CCP, mas não na linha celular A549. Depleção de β-catenina atenua membranosa β-catenina em ambas as linhas celulares de CCP e A549, mas depleção de E-caderina não tem qualquer efeito na expressão do membranoso β-catenina em qualquer SPC ou linha celular A549. O tratamento com 5-aza-dC alterou ligeiramente as quantidades de expressão β-catenina membranoso após β-catenina ou depleção de E-caderina em linhas celulares SPC mas não em linha de células A549.

Depois de knockdown de β-catenina ( a) ou e-caderina (C), a expressão da proteína de SPC e linhas de células A549 foram examinados 48 horas após o tratamento com 5-aza-dC usando os anticorpos indicados. (B, D) Os gráficos mostram a quantificação da expressão da proteína após o tratamento com 5-aza-dC e siRNA transfecção. GAPDH foi usada como um controlo. (E) Imagens representativas de células na parte inferior das membranas Transwell mostram as alterações no número de células invasivas (400 ×, barra de escala = 50 uM). (F) Número de células invasoras sobre a superfície inferior do filtro foi contada, cada um realizado em triplicado. (As barras representam SD *

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. 0,05, em comparação com o controle). (G) os resultados de ensaio de luciferase dupla demonstram que tanto o tratamento e β-catenina depleção de 5-aza-dC, não resultou em alterações significativas nas actividades de sinalização de Wnt em comparação com as células tratadas Wnt3a. Cada uma das experiências foi repetida em triplicado. coloração (H) imunofluorescência mostrando que o membranosa β-catenina é reforçada por 5-aza-dC tratamento apenas na linha de células de CCP, mas não na linha celular A549. Depleção de β-catenina atenua membranosa β-catenina em ambas as linhas celulares de CCP e A549, mas depleção de E-caderina não tem qualquer efeito na expressão do membranoso β-catenina em qualquer SPC ou linha celular A549. O tratamento com 5-aza-dC alterou ligeiramente as quantidades de expressão β-catenina membranoso após β-catenina ou depleção de E-caderina em linhas celulares SPC mas não em linha de células A549. (Barra de escala = 20 um, anticorpo β-catenina foi substituído por IgG normal de rato como controlo negativo).

hipermetilação do promotor β-catenina correlacionada com a sua perda de expressão em membranosa amostra NSCLC

a seguir, investigou o estado de metilação do promotor de β-catenina em amostras de tecido clínicos. p-catenina foi expressa predominantemente na membrana celular em amostras de tecido de pulmão normal (83,9%, 120/143; A Fig. 4A), com uma expressão reduzida em tecidos membranosa NSCLC (18,9%; 27/143; A Fig. 4B, C). Subsequentemente, os níveis de metilação do promotor β-catenina foram quantificados por PCR específicos de metilação em tempo real. Utilizando um valor de hipermetilação maior do que 4%, como um ponto de corte, a hipermetilação do β-catenina (média ± DP, 8,60% ± 11,41%; gama, 0-100%) foi encontrada em 74 (51,7%) dos espécimes NSCLC 143, que foi significativamente mais elevado do que em tecido pulmonar normal adjacente (13,3%, 19/143; média ± DP, 2,66% ± 2,63%; gama, 0-100%;

P

0,001; Fig. 4D ). Tomados em conjunto, o nosso estudo sugere que β-catenina metilação significativamente correlacionada com a perda de expressão β-catenina membranoso (

P

= 0,001).

(A) expressão β-catenina no epitélio pulmonar normal com forte coloração membranoso. expressão β-catenina membranoso foi perdido no carcinoma do pulmão de células escamosas (B) e adenocarcinoma do pulmão (C). Barra de escala = 20 mm. (D) os resultados de metilação quantitativos de q-MSP. Os dados representam SD ± média. O teste U de Mann-Whitney foi utilizado para determinar a significância estatística. **

P Art 0,001. curvas (E) de sobrevivência de pacientes com ou sem β-catenina promotor metilação. teste de log-rank de Mantel foi utilizado para determinar a significância estatística.

A correlação entre a metilação do promotor β-catenina e fatores clínico-patológicos

As características clínicas e patológicas de pacientes com NSCLC foram analisados ​​de acordo com a o seu estado de metilação. Como mostrado na Tabela 2, β-catenina hipermetilação positivamente correlacionada com metástases nos linfonodos e fase TNM em 143 casos de NSCLC (

P

= 0,001 e

P

= 0,046, respectivamente). Não houve associação significativa entre a metilação do β-catenina e sexo, idade, tipo histológico, ou diferenciação em NSCLC. O teste de Kaplan-Meier revelou que o tempo de sobrevivência global dos doentes com NSCLC foi menor em pacientes com tumores β-catenina-metilado do que naqueles com os tumores de β-catenina não metilado (

P Art 0,001, Fig. 4E).

Discussão

β-catenina, como um componente importante de ambos adherens cruzamentos e via de sinalização Wnt, foi acreditado para ser translocado para o núcleo por sua mutação exão e /ou mutação APC em vários tipos de tumor, exceto câncer de pulmão [4], [7], [8]. No entanto, as evidências acumuladas indicam que, no cancro do pulmão, β-catenina é perdido e a actividade de sinalização de Wnt é regulada negativamente. O mecanismo subjacente permanece unelucidated [5], [9] – [11]. O nosso estudo mais recente mostrou que o promotor do gene β-catenina foi sempre metilada em linhagens de células de cancro do pulmão [16]. A fim de esclarecer as funções de β-catenina em NSCLC, ampliamos nossa investigação do estado promotor metilação em sete linhas celulares de cancro do pulmão. Verificou-se que o agente de desmetilação 5-aza-dC restaurados os níveis de proteína β-catenina em cinco de sete linhas de células que tinha sido confirmado para ser metilado no presente estudo. Entre estes, o estado de metilação de SPC e A549 foi ainda confirmada por sequenciamento genômico bissulfito. É bem reconhecido que a entrada de β-catenina para o núcleo pode aumentar a actividade de sinalização de Wnt, promovendo, assim, a capacidade de invasão de vários cancros humanos. No entanto, a expressão β-catenina foi perdida nas metástases distantes de carcinoma gástrico e a perda de expressão β-catenina pode ser devida a hipermetilação do promotor de β-catenina, apesar de que a expressão β-catenina foi regulada positivamente e a via de sinalização Wnt foi activado em a maior parte do cancro gástrico primário [15]. Especulamos que a perda de β-catenina pode desencadear outra cascata (s) de sinalização mais forte do que a sinalização de Wnt no controlo da activação de invasão das células cancerosas. Uma vez que o cancro do pulmão mostra inferior da linha de base da actividade de sinalização de Wnt que o cancro gástrico, o principal mecanismo na regulação da capacidade de invasão pode ser independente da via de sinalização Wnt. a activação da via de sinalização de Wnt, a capacidade de invasão, e a distribuição de subcelluar β-catenina em linhas celulares de pulmão. Os resultados indicaram que a desmetilação por 5-aza-dC poderia restaurado expressão β-catenina e invasividade de células de cancro do pulmão inibidas através membranosa expressão β-catenina restabelecimento, em vez de através da activação da via de sinalização Wnt. O presente estudo ofereceu uma nova explicação para o porquê expressão β-catenina foi regulada negativamente em NSCLC e indicou que a metilação do promotor de β-catenina pode regular a invasão através de um independente via de sinalização Wnt em células de câncer de pulmão. Como cateninas em conjunto com as caderinas e junções aderentes formados, os nossos resultados indicaram que a perda de expressão β-catenina pode destruir junções aderentes por sua expressão membranosa reduzida.

E-caderina desempenha um papel crucial em junções aderentes. Através do seu domínio intracelular, E-caderina foi conectado com β-catenina. Embora a metilação de metilação do gene da E-caderina foi encontrado em vários tipos de câncer, permanece controverso como no câncer de pulmão [23] – [25]. Russo

et al

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