Abstract

Evasão de apoptose está envolvida em quase todos os aspectos da progressão do câncer, bem como a resistência ao tratamento. Neste estudo, a resistência à apoptose foi identificada em células epiteliais de pulmão tumorigénico (A549) células como uma consequência de defeitos na função mitocondrial e autophagic. a função mitocondrial é determinada em parte pela morfologia mitocondrial, um processo regulado pela dinâmica mitocondrial pelo que a união das duas mitocôndrias, fusão, enquanto inibe a apoptose de fissão, a divisão de uma mitocôndria, inicia a apoptose. morfologia mitocondrial de células A549 exibida uma forma alongada células-imitando fenótipo deficientes em proteína fissão mitocondrial, proteína relacionada com Dynamin 1 (Drp1). As células A549 tinha prejudicado Drp1 recrutamento mitocondrial e diminuição da cisão dependente da Drp1. Citocromo c liberação e caspase-3 e PARP clivagem foram prejudicadas tanto basally e com estímulos apoptóticos em células A549. O aumento da massa mitocondrial foi observada em células A549, sugerindo defeitos de mitophagy mitocondrial (autophagy selectiva). As células A549 tinha diminuído LC3-II lipidação e inibição lisossomal sugerindo defeitos de autofagia ocorrer a montante da degradação lisossomal. A imunocoloração indicado mitocondrial localizada punctae LC3 em células A549 depois de aumento desacoplamento mitocondrial ou com uma combinação de despolarização mitocondrial e expressão ectópica Drp1. O aumento da inibição de apoptose em células A549 está correlacionada com a fissão mitocondrial e impedido mitophagy. Sugerimos defeitos de fissão mitocondriais contribuir para a resistência de apoptose em células A549

Citation:. Thomas KJ, Jacobson MR (2012) Defeitos em mitocondrial Cisão Protein proteína relacionada com Dynamin 1 estão ligados a resistência apoptose e autofagia em um câncer pulmonar Modelo. PLoS ONE 7 (9): e45319. doi: 10.1371 /journal.pone.0045319

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 10 Abril de 2012; Aceito: 20 de agosto de 2012; Publicado: 20 de Setembro, 2012 |

Direitos de autor: © Thomas, Jacobson. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. St. Hospital de Mary e Centro Médico Regional, Fundação Hospital de Santa Maria. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro é um problema de saúde pública em todo o mundo. As estratégias actuais na terapia do cancro (quimioterapia e radioterapia) dependem de matar células tumorais por mecanismos mediados por grande parte a activação da apoptose. A apoptose é um processo celular conservada que controla o desenvolvimento normal e a homeostase dos tecidos, eliminando as células danificadas. A inibição de apoptose contribui para a conversão tumorigénico de células normais, alargando a sua viabilidade, favorecendo a acumulação de mutações transformando [1]. Resistência à apoptose está ligado ao aumento potencial invasivo e metastático em células de câncer [2].

Uma característica marcante do câncer clássico é a resistência à apoptose [3]. Como as células tumorais escapar morte celular por apoptose é actualmente desconhecida, mas aumentando a sensibilidade do tumor a apoptose é um objetivo terapêutico. A ausência de apoptose espontânea e a apoptose induzida por tratamento do cancro do pulmão de células não pequenas (NSCLC) sugere que as deficiências no processo apoptótico podem ser responsáveis ​​pela sua resistência à terapia anti-cancro [4]. mutações genéticas e expressão alterada de reguladores de apoptose são detectados no câncer de pulmão. As diferenças na sensibilidade a agentes terapêuticos que induzem a apoptose podem ser relacionados com a expressão de reguladores de apoptose no cancro do pulmão. terapia anti-apoptótica de modulação está a ser investigado extensivamente [3].

apoptose intrínseca é caracterizado por permeabilização das mitocôndrias, a libertação do citocromo c, e a activação da cascata de caspase [5]. controlo mitocondrial de apoptose ocorre a montante da activação de caspase e é mediada pela família Bcl-2 de proteínas [5]. Proteínas Bcl-2 também influenciar dinâmica mitocondrial, um processo que equilibra eventos de fissão e de fusão mitocondrial para regular a forma, estrutura e função da mitocôndria [5]. As mitocôndrias são organelos dinâmicas pelo que a sua forma corresponde ao estado metabólico [6], a saúde da célula [7] e o equilíbrio entre a fusão e cisão é necessária para a homeostase. Normalmente, mitocondriais fissão mediador Drp1 fragmentos mitocôndrias [5]. Drp1 é um grande GTPase que controla tubulation membrana e fissão em células [5] de mamíferos. As células submetidas a fissão mitocondrial terá um comprimento mais curto mitocondrial quando comparadas com células que são submetidos a fusão mitocondrial [8]. Embora esses eventos são transitórios, as células deficientes em uma proteína dinâmica mitocondrial ou sob estímulos manterá sua morfologia mitocondrial dependente do estado [6]. fissão mitocondrial excessiva (fragmentação) é essencial para a apoptose intrínseca-lo é necessária para a libertação de citocromo c e subsequente activação da caspase [5].

Inibição da prejudica fissão mitocondrial Drp1-dependentes e inibe parcialmente a apoptose intrínseca [7]. Concomitante com a permeabilização da membrana mitocondrial durante a apoptose, Drp1 forma oligómeros e é recrutada para a membrana mitocondrial externa para mediar a cisão de um modo dependente de GTP-[5]. eventos de fissão mediar a apoptose através da regulação da liberação de fatores pró-apoptóticos para o citosol. A inibição da Drp1 impede membrana mitocondrial libertação potencial colapso e citocromo c, e promove fenótipos morfológicas mitocondriais alongados [5]. A inibição da fissão mitocondrial proíbe morte celular citocromo c translocação e atrasos, proporcionando assim uma ligação entre a dinâmica mitocondrial e a indução de apoptose.

dinâmica mitocondrial não só afetam a apoptose intrínseca, mas também reorientar a degradação autofágica. Existe extensa conversa cruzada entre mitophagy e apoptose [9]. A inibição de mediadores de fissão tais como proteína relacionada com um dinamina (Drp1), o que prejudica a apoptose intrínseca [10], tem sido demonstrado para diminuir mitophagy [11]. Regulação negativa da autofagia durante a progressão do tumor foi observado em vários estudos [12]. O aumento da tumorigenicidade tem sido demonstrado diminuir a degradação de proteínas em células epiteliais do pulmão [13]. O regulador negativo de autofagia, mTOR (alvo da rapamicina em mamíferos), é frequentemente activada [14] e inibidores de mTOR têm sido mostrados para limitar a proliferação do tumor em modelos NSCLC [15].

resistência à apoptose está ligada a mitocôndria e proteínas envolvidos na dinâmica mitocondrial. No entanto, ainda se desconhece se células tumorais ganhar resistência à apoptose por alteração dinâmica mitocondrial. Neste estudo, caracteriza dinâmica mitocondrial e o processo a jusante da apoptose em células de câncer de pulmão. As diferenças na morfologia e função mitocondrial foram observados em células A549. Nós fornecemos provas em células de câncer de pulmão, sugerindo um desequilíbrio na dinâmica mitocondrial existe, em que defeitos de fissão mitocondrial dependente de Drp1 inibir o processo a jusante da autofagia e contribuir para a resistência apoptótica.

Materiais e Métodos

Cultura celular e plasmídeos

As linhas de células compradas na ATCC (Quadro I) foram cultivadas como anteriormente descrito [16]. imagens de células vivas foi realizada em fenol livre (PRF) OptiMEM vermelho (Invitrogen). Plasmídeos [16] para YFP mitocondrial (mito-YFP, Clontech), Drp1-YFP [17], Drp1-myc [18], Drp1 K38A-myc [18], e Drp1 RNAi [19] foram presentes de Dr. Richard Youle (NINDS, Bethesda, MD) e foram transfectadas em células utilizando lipofectamina 2000 (Invitrogen) como indicado pelo fabricante. células plaqueadas (10

4 células /cavidade) foram semeadas e cultivadas em OptiMEM completo durante 24 horas a 37 ° C, antes do tratamento e a leitura de intensidade fluorescente. Células tratamento incluíram: A incubação com 1 uM estaurosporina (STS, Sigma) e /ou 50 fiM zVAD-FMK (Sigma) durante 3 horas em OptiMEM sem soro PRF em ensaios de apoptose. As células foram privadas usando EBSS (Invitrogen) e /ou tratadas com 10 nM bafilomicina A1 (Sigma) por 24 horas em ensaios de autofagia.

Análise de mitocondrial Morfologia e Conectividade

morfologia mitocondrial foi analisada como descrito anteriormente [16], utilizando imagens de células vivas com um microscópio invertido confocal (disco CARV fiação, DMI 6000B, Leica) e software Metamorph. análise de comprimento mitocondrial foi realizada em imagens usando ImageJ após o processamento para encontrar bordas. O comprimento mitocondrial média foi determinada depois de usar a ferramenta de seleção de linha à mão livre para medir comprimento (micrômetros) de mitocôndrias individuais obtidos em um campo selecionado aleatoriamente de 100 × 100 pixels e 10-15 células por linha de células foram examinadas. metadados associados foram exibidos e a escala da imagem (distância em pixels: 1; Distância Conhecido: Valor de Metadados; Proporções de pixel: 1; Unidade de Duração: micrómetro; global: verificada) foi criado para a consistência de análise de imagem. de transfecção celular transiente e Drp1 RNAi knockdown experiências foram realizadas como descrito [16]. imaging mitocondrial com 0,5 ug transfectadas mito-YFP ou mito-DsRED, as estimativas de comprimento mitocondrial e ensaios de FRAP mitocondriais foram descritos [16], [20].

Imagiologia Celular e Fluorimetria

massa mitocondrial foi estimada utilizando um leitor de placas fluorescente após coloração das células com 200 nM Mitotracker verde durante 30 minutos a 37 ° C, e a lavagem uma vez com OptiMEM PRF-[21]. as medições da intensidade de fluorescência relatados são subtraídos do fundo (495/515 nm).

potencial de membrana mitocondrial foi estimado em uma placa de 96 poços utilizando um leitor de placas fluorescente (Tecan). As células (10

4 por poço) foram carregadas com 10 nM TMRE durante 30 minutos a 37 ° C em meio de crescimento normal. O meio de carregamento TMRE foi removido e as culturas foram colocadas no sem vermelho de fenol, meio isento de soro e incubadas durante um período adicional de 15 minutos para permitir o sinal fluorescente TMRE para atingir o estado estacionário. A intensidade de fluorescência foi então capturado 1 /min durante 5 minutos para estabelecer uma linha de base. Após 5 minutos, adicionou-se 6 uM oligomicina (Cell Signaling) para induzir a hiperpolarização de Δψ

m. Na presença de oligomicina, 10 uM de CCCP foi adicionado a 18 minutos para as células para causar a despolarização do ΔΨ

m. TMRE expressão é representado como uma razão relativa Af /F

0 mostrando média e SEM, em que F indica a intensidade de fluorescência e F

0 indica os valores da linha de base antes da estimulação. Todas as linhas celulares analisadas exibida oligomicina induzida por hiperpolarização do potencial da membrana mitocondrial. intensidades de fluorescência são de fundo subtraído (554/576 nm).

Mitophagy foi medida usando microscopia confocal para detectar co-localização de mito-YFP transfectadas células positivas com imunocoloração contra monoclonal anti-LC3B (Novus Biologicals) com AlexaFluor® 594 anticorpo secundário anti-IgG de ratinho (Invitrogen). As células (5 × 10

4 por poço) foram transfectadas em suspensão com 0,5 ug MITO-YFP usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) e semeadas em câmaras de vidro de borosilicato LabTekII (Nunc) durante 24 h. Após fixação com paraformaldeído a 4%, as células foram imunocoradas com anticorpo policlonal de coelho anti-LC3B (Novus Biologicals) e visualizada com AlexaFluor® IgG anti-coelho de cabra 594 (590/617 nm). O número de mitocôndrias distintos localizados punctae LC3-positivo por células foi contado. formação Autophagosome foi observado por LC3 punctae.

Todas as medições de fluorescência tem unidades de fluorescência relativas (RFU).

ELISA, Fosfoproteína Purificação e Western Blot

Os métodos gerais para transferência Western e fraccionamento subcelular têm sido descritos [20]. Anticorpos utilizados: Sigma (β-actina, GAPDH), Cell Signaling (caspase-3, a HSP60, HTRA2, PARP), BD Translabs (Drp1, p53, TIM23), Calbiochem (VDAC), Novus (LC3-II), Abcam ( vimentina, fibronectina) e MitoSciences (Mitobiogenesis Ensaio, IV subunidade do complexo I, frataxin). O anticorpo contra Drp1 pS637 foi uma oferta generosa do Dr. Craig Blackstone (NINDS, Bethesda, MD). purificação Fosfoproteína foi realizada como descrito anteriormente [16]

Estatísticas

Os testes de análise são indicados na legenda da figura eo significado é indicado da seguinte forma:. NS, não significativo

P

0,05; *

P Art 0,05; **

P Art 0,01; ***

P

. 0,001

Resultados

mitocondrial Alongamento em células A549

A disfunção mitocondrial tem sido observada em muitos tipos de linhas celulares de cancro [22]. Um determinante importante da função mitocondrial é morfologia mitocondrial. morfologia mitocondrial foi examinada em cada uma das linhas celulares de cancro do pulmão normal e (Tabela I), utilizando um MITO-YFP para rotular fluorescência na matriz mitocondrial de células (Figura 1A). comprimento mitocondrial também foi determinada para cada linha celular (Figura 1B). Observaram-se diferenças distintas na morfologia, incluindo o comprimento das mitocôndrias, entre as linhas de células epiteliais de pulmão que variam em potencial tumorigénico (Tabela I) e o potencial tumorigénico relativa de cada linha celular foi validado após a realização de experiências de migração celular (Figura S1) [23] . O NL20 não e fracamente tumorigénico e células NL20TA tinha um fenótipo heterogêneo mas as células Calu1 e A549 tumorigênicos exibido predominantemente a forma alongada da mitocôndria. Uma tendência foi notada pelo qual as células não tumorigénicas (NL20) tinha o comprimento mais curto mitocondrial média (média ± SEM; 5,2 ± 0,4 uM) e o maior comprimento mitocondrial significativo foi observado em células A549 (média ± SEM; 8,0 ± 0,8 uM) (Figura 1).

(a) expressão representativas MITO-YFP em células. caixas numeradas (1-4) são ampliações (10 ×) das correspondentes regiões em caixas numeradas nas imagens originais de NL20, NL20TA, Calu1 e A549. barra de escala é de 2 mm. medidas (n = 35-50) a partir de três experiências independentes para NL20, NL20TA, Calu1, e células A549; (B) comprimento mitocondrial médio (± SEM eixo y). 1-way análise ANOVA com pós-teste de Tukey (

P Art 0,0001).

O aumento mitocondrial missa em células A549

massa mitocondrial foi estimado em directo Mitotracker células utilizando verde de FM, que se acumula nas mitocôndrias independentemente do potencial de membrana mitocondrial [24]. Após a normalização para o volume de células, observou-se que células A549 tinha um aumento da massa mitocondrial em comparação com as outras linhas de células epiteliais de pulmão (Figura 2A). Para validar melhor esta relação, a expressão de uma proteína codificada mitocondrial, subunidade IV complexo mitocondrial I (o enzima terminal da cadeia respiratória) foi comparada com proteínas associadas a mitocondriais codificados nucleares, TIM23 (translocase da membrana mitocondrial interna 23) e frataxin por dois métodos independentes, imunotransferência e ELISA (Figura 2B, D; respectivamente). As células A549 tinham aumentado os níveis de proteínas do complexo IV subunidade I, quando comparados a células NL20 (Figura 2B-E). A acumulação selectiva de mitocôndrias em células A549 não foi mimetizado por outros organelos na análise da expressão da proteína (ER, calnexina; Golgi, sintaxina 6; citosol, GAPDH) por western blot (dados não mostrados). Além disso, marcadores mitocondrial biogenesis TFAM (factor de transcrição mitocondrial A) e PGC1α (peroxissoma activado pelo proliferador do receptor gama coactivador-1 alfa) foram examinados para investigar mais profundamente a massa mitocondrial nas linhas celulares. A análise destes marcadores ao nível da expressão de genes não sugere que o aumento da massa mitocondrial observada em células A549 são atribuídos ao aumento da biogénese mitocondrial. diferenças de mudança Gene expressão dobra não foram significativas em ambas as avaliações genéticas (

TFAM

,

P Art 0,142;

PGC1α

,

P Art 0,119 ) (dados não mostrados). Estes dados mostram células A549 aumentaram em massa mitocondrial

(A) Mitotracker fluorescência verde unidades de fluorescência relativa (eixo y, RFU) representa massa mitocondrial (média e SEM).; medidas (n = 8 poços) a partir de três experiências independentes. 1-way análise ANOVA com pós-teste de Tukey (

P Art 0,0001). (B) imunoblots representativos demonstrando a expressão de proteínas endógenas complexo subunidade IV I, TIM23, frataxin, e VDAC em NL20 (pista 1), NL20TA (pista 2), Calu1 (pista 3), e A549 (pista 4) células. β-actina é mostrado para o carregamento. Marcadores em kilodaltons (kDa). (C) As imunotransferências de duas experiências independentes foram quantificadas para mostrar subunidade IV expressão de proteínas do complexo I relativo normalizado para TIM23. Média e SEM mostrado. 1-way análise de variância com Tukey pós-testes em comparação com NL20. (D) Representante mitocondrial biogênese vareta ensaio ELISA mostrando frataxin e expressão complexa IV. (E) Três ensaios ELISA biogênese mitocondrial independentes foram quantificados para mostrar a expressão da proteína em relação codificado-mitocondrial complexo IV normalizada para a proteína frataxina nuclear-codificado. Média e SEM mostrado. 1-way análise ANOVA com pós-teste de Tukey em comparação com NL20.

Resistência à induzida por CCCP mitocondrial despolarização em células A549

desacoplamento mitocondrial por CCCP (carbonil cianeto m-cloro fenil hidrazona) interrompe potencial de membrana mitocondrial (Δψ

m) e de gradiente de pH mitocondrial (ΔpH

m) [20]. TMRE expressão é representado como uma razão relativa, Af /F

0, em que F indica a intensidade de fluorescência e F

0 indica os valores da linha de base antes da estimulação. Todas as linhas celulares analisadas exibida oligomicina induzida por hiperpolarização do potencial da membrana mitocondrial. Na presença de oligomicina, 10 uM de CCCP foi então adicionado às células para causar a despolarização do Δψ

m.

Os nossos dados sugerem que as linhas de células A549 não despolarizar ao nível das outras linhas celulares após o tratamento com CCCP. Diferenças significativas (P 0,001; 2-way ANOVA) em Af /F

0 são observadas a partir de 23-30 minutos ( 4 minutos após a adição de CCCP) entre A549 e as outras linhas celulares. Isto sugere que as células A549 altamente tumorigénicas exibir uma resistência à despolarização da membrana mitocondrial (Figura 3). Coloração

TMRE a partir de duas experiências independentes (n = 8). TMRE expressão é representado como uma razão relativa Af /F

0 mostrando média e SEM, em que F indica a intensidade de fluorescência e F

0 indica os valores da linha de base antes do estímulo seguintes subtracção do fundo. As linhas celulares NL20 (azul), NL20 (laranja), Calu1 (pink1) e A549 (verde) foram tratados com oligomicina (6 mM; 0 minutos) e CCCP (10 mM; 18 minutos) para induzir a hiperpolarização e despolarização, respectivamente. 2 vias de análise ANOVA com Bonferroni pós-testes.

Como as linhas de células de tumor ter sido previamente demonstrado que ser influenciado por transportadores de resistência a múltiplas drogas (MDR), as células foram pré-tratadas com 50? M de verapamil para bloquear actividade MDR durante TMRE carregamento para determinar se as proteínas de MDR na membrana do plasma teve um efeito sobre TMRE afluxo. Seguindo oligomicina /CCCP tratamento de células tratadas verapamil, MDR não influenciou a acumulação intracelular de TMRE quando em comparação com células não tratadas verapamil (dados não mostrados); como este substrato fluorescente rodamina não se acumula nas células resistentes aos medicamentos. Neste estudo, as células A549 teve menos alteração na Δψ

m conforme medido por fluorescência após o tratamento TMRE CCCP e actividade MDR não influencia esta actividade. Estes dados são consistentes com outros relatórios que sugerem que as células cancerosas demonstram resistência a despolarização da membrana mitocondrial [25].

Diminuição da cisão dependente da Drp1 em células A549

despolarização mitocondrial e fissão são um pré-requisito para intrínseco apoptose [5]. Com o aumento do comprimento mitocondrial, temos a hipótese de que as células A549 teria diminuído a fissão mitocondrial, o que diminuiria tanto a iniciação de apoptose eo processo catabólico jusante da autofagia.

Drp1 e seus antagonistas de fusão mitocondrial OPA1 (Optic atrofia 1), Bax /Bak e Mfn1 /2 (Mitofusin 1/2), em parte, regular a forma, estrutura e função da mitocôndria por dinâmica mitocondrial [8]. O exame da morfologia mitocondrial (Figura 1A; Figura 4A, basal) mostra mitocôndrias principalmente alongado em células A549 (Figura 4A2: comprimento mitocondrial, média ± SEM; 8,3 ± 0,8 uM). Este fenótipo sugere defeitos de cisão ou uma sobre-regulação de fusão. Os níveis de proteína Drp1 estado estacionário foram analisadas por imunotransferência (Figura 4B, C). A análise quantitativa mostra que a expressão da proteína Drp1 basal em células A549 foi no máximo de 44% que a observada em células NL20 (Figura 4D).

(A) morfologia mitocondrial de NL20 (esquerda) e A549 (direita) células seguinte Mito transfecção -DsRED. Imagens representativas mostrados: basal (superior) e seguindo Drp1 RNAi (meio) ou Drp1-YFP transfecção (inferior). A barra de escala indica 2 m. caixas numeradas (1-6) são ampliações (10 ×) das correspondentes regiões em caixas numeradas nas imagens originais. (B) de imunotransferência da expressão endógena Drp1 antes (pistas 1,3) e depois (pistas 2,4) Drp1 ARNi de transfecção em células A549 e NL20. (C) immunoblot de endógena (pistas 1,2; seta) e ectópicas (pistas 3,4; cabeça de seta) expressão Drp1 antes e depois Drp1-YFP transfecção na NL20 e células A549. (B, C) β-actina retestará para mostrar o carregamento; marcadores em kDa. (D) A expressão relativa de proteína Drp1 normalizada para p-actina antes e depois Drp1 RNAi transfecção em NL20 (barra branca) e as células A549 (barra preta) (dois experimentos independentes). 2-way análise ANOVA com pós-teste de Bonferroni. (E) Imagens representativas de análise FRAP de NL20 (esquerda) e A549 células (à direita) transfectadas com mito-YFP. Células fotografada sob basal (em cima), Drp1 K38A-myc downregulation de Drp1 (meio) e superexpressão condições (em baixo) Drp1-myc. caixas numeradas (1-6) são ampliações (10 ×) das correspondentes regiões em caixas numeradas nas imagens originais. barra de escala é de 1 mm. (F-H) fração Móvel de valores mito-YFP que ocorrem dentro de uma única região subcelular de interesse (n = 60 células). Média e SEM mostrado a partir de dois experimentos independentes. 1-way análise de variância com Tukey pós-testes. Estatísticas adicionais FRAP são mostrados na Figura S2.

Para manipular ainda mais a morfologia mitocondrial, Drp1 foi derrubado usando RNAi [16], [19] (Figura 4A, B + Drp1 RNAi), que se espera para alongar as mitocôndrias. Após Drp1 RNAi mediada knock down em células NL20 e A549, houve uma diminuição robusto em níveis de proteína Drp1 (Figura 4B, D). comprimento mitocondrial aumentada, como esperado, em células NL20 após o tratamento Drp1 RNAi (Figura 4A: média ± SEM; basal (A1), 4,9 ± 0,5 uM; Drp1 RNAi (A3), 7,8 ± 0,6 m; 1-way ANOVA, teste de Tukey pós -test,

P Art 0,001). O fenótipo mitocondrial após o tratamento Drp1 RNAi em células A549 foi inchada e bulbosa (Figura 4A4); uma morfologia causada por hiperfusão do mitocôndrias devido a uma falta de equilíbrio que é normalmente fornecida por fissão [26]. Para determinar se a expressão da proteína reduzida Drp1 contribui para o fenótipo mitocondrial alongado normalmente observada em células A549, linhas de células foram transfectadas com o plasmídeo Drp1-YFP para sobre-expressar a proteína de fusão Drp1-YFP, que é funcionalmente capaz de induzir a fissão [16]. Como mostrado na Figura 4A (+ Drp1-YFP), Drp1 superexpressão resgatou o fenótipo mitocondrial em células A549, diminuindo comprimentos mitocondriais aos observados em células NL20 basais (Figura 4A: média ± SEM; + Drp1-YFP (A6), 5,1 ± 0,7 m; 1-way ANOVA, Tukey pós-teste,

P Art 0,05). A morfologia mitocondrial de células A549 seguintes Drp1 superexpressão semelhante, assemelhava-se de células basais NL20 (Figura 4A1). comprimento mitocondrial em células NL20 (Figura 4A: média ± SEM; basal (A1), 4,9 ± 0,5 uM) também diminuiu após Drp1 superexpressão (Figura 4A: média ± SEM; + Drp1-YFP (A5), 2,1 ± 0,3 m; 1 -way ANOVA, Tukey pós-teste,

P

. 0,001)

Estes dados sugerem que uma deficiência nos níveis de proteína Drp1 contribui para a redução de eventos de fissão mitocondriais em células A549. FRAP (recuperação de fluorescência após a fotodegradação) foi utilizado para quantificar a conectividade mitocondrial, que infere acontecimentos mitocondriais fissão [16], em células vivas NL20 e A549 (Figura 4E-H). FRAP curvas foram sintetizadas através do cálculo da fracção celular de proteína fluorescente amarela dirigida-mitocondrial (MITO-YFP), que calcula a conectividade mitocondrial [16]. FRAP experiências confirmam que a fissão mitocondrial células A549 diminuíram (Figura 4F-H). valores da fração móveis mostram que as mitocôndrias nas células NL20 tem conectividade significativamente menor funcional (mais de fissão) quando comparado com células A549 basal (Figura 4F). Regulação negativa do Drp1 por sobre-expressão de uma versão dominante negativo de Drp1 (Drp1 K38A) equilibrada a conectividade mitocondrial entre as duas linhas de células (Figura 4H). Seguindo Drp1 superexpressão (+ Drp1-myc), fissão mitocondrial é reforçada em células A549 tal que valores da fração móveis são mais comparáveis ​​às células NL20 basais (Figura S2). Estes resultados FRAP imitar as observações morfológicas mitocondriais que mostram diminuição da cisão dependente da Drp1 em células A549 quando comparado com células NL20 e que a fissão reprimidos em células A549 pode ser resgatado por superexpressão de Drp1.

Drp1 localização em células A549

Para examinar ainda mais reduzida de fissão-dependente Drp1 em células A549, olhamos para Drp1 localização seguinte fracionamento subcelular via immunoblot. Mitocondrial e fracções citosólicas foram examinadas para os níveis de proteínas endógenas Drp1 (Figura 5A, B). Drp1 proteína não foi observada na fracção mitocondrial das células A549, sugerindo que Drp1 não é recrutado de forma activa para a mitocôndria para a cisão. Em contraste, as células mostraram NL20 recrutamento de Drp1 para a fracção mitocondrial, que infere a fissão mitocondrial ocorre em células NL20 como sugerido pelas análises morfológicas mitocondriais (Figura 1A, 4A) e confirmada por dados FRAP (Figura 4F-H). Em células de mamíferos, Drp1 é recrutada para a membrana mitocondrial externa após a indução de apoptose [5]. Para examinar esta translocação, Drp1 localização foi visualizada por immunoblot seguinte fracção subcelular após o tratamento estaurosporina (STS). STS é um inibidor da proteína-quinase que se sabe induzir a apoptose [27]. Após a indução de apoptose por STS, recrutamento de proteínas Drp1 do citosólico para a fracção mitocondrial foi observada em ambos NL20 e as células A549 (Figura 5B). A partir desta observação, inferiu-se que as células A549 diminuíram Drp1 recrutamento mitocondrial que pode ser melhorada por estimulação apoptótica. Isto sugere que Drp1 podem ser recrutadas para a mitocôndria em células A549, mas o processo de fissão mitocondrial é impedido nesta linha celular.

(A, B, E) imunoblots representativos de três experiências independentes de (A) não tratada , (B) 1 uM STS tratamento durante 3 horas para induzir a apoptose, e (e) O tratamento de 1 uM STS por 3 h após a transfecção Drp1-myc em células A549 e NL20. Endógena Drp1 e expressão da proteína citocromo c foram avaliados no total (pistas 1,2), mitocondriais (pistas 3,4) e citosólica (pistas 5,6) frações. Mitocondrial (VDAC), citosol (GAPDH) e β-actina (total) estão incluídas como controlos de fraccionamento e de carregamento. Myc expressão após a transfecção Drp1-myc é apresentado em (E). Marcadores em kDa. (C, D, F) expressão do citocromo C de proteína normalizada para p-actina em NL20 (barras brancas) e A549 (barras pretas) fracções de células sob condições não tratados (C), o tratamento de 1 uM STS por 3 h (D) ou 1 uM tratamento STS por 3 h com a expressão ectópica de Drp1-myc (F). Média e SEM mostrado a partir de dois experimentos independentes. 2-way análise ANOVA com pós-teste de Bonferroni. morfologia mitocondrial nestas condições é mostrado na Figura S3C e S5.

prejudicada citocromo C lançamento em células A549

A inibição de fissão mitocondrial atrasa a libertação do citocromo c para o citoplasma [28] ; portanto, nós examinamos o citocromo c translocação em células A549 (Figura 5, Figura S3). Mitocondrial e fracções citosólicas foram examinadas para a libertação de citocromo c em NL20, NL20TA, Calu1 e células A549 com e sem dissociação induzida por CCCP (Figura S3A, B). Especificamente, A549, a linha celular mais tumorigénicas neste painel (Figura S1), apresentado em insuficiência libertação de citocromo c a seguir ao tratamento de CCCP (Figura S3B, C). As células A549 STS-tratados mostraram uma ausência semelhante de libertação de citocromo c, quando em comparação com células NL20 (Figura 5b, Figura S3C). As imunotransferências foram quantificadas para mostrar os níveis de proteína do citocromo c em experiências de fraccionamento sem e com STS-tratamento (Figura 5C, D). Em condições basais e STS, células A549 tinham aumentado os níveis de proteínas do citocromo c na fracção mitocondrial quando comparado com as células NL20. Estes dados sugerem células A549 diminuíram fissão mitocondrial dependente de Drp1 eo processo a jusante da libertação de citocromo c é prejudicada. Para apoiar ainda mais essa idéia, superexpressão de Drp1 em células A549 resgatado STS-tratamento induziu a libertação de citocromo c nesta linha celular (Figura 5E, F; Figura S3C) demonstrando que o citocromo prejudicada liberação c observada em células A549 é devido a uma deficiência em Drp1 . fenótipos morfológicas mitocondriais esperados foram observados após STS-tratamento e em combinação com superexpressão Drp1-myc (Figura S5), apoiando os dados immunoblot citocromo c libertação na NL20 e células A549.

Resistência apoptose em células A549

Uma vez que os defeitos de fissão mitocondriais atrasar citocromo c liberação [28] e ativação caspase [5], examinamos eventos pró-apoptóticos jusante após a libertação do citocromo c. A clivagem de caspase-3, um mediador chave de apoptose de mamíferos [29], foi observado após STS e doxorubicina-tratamento (Figura 6A, Figura S4A, C) em NL20, NL20TA, e células Calu1. Em contraste, a clivagem de caspase-3 foi encontrada em apoptose estimulada células A549 (Figura 6A; Figura S4A). clivagem de PARP, um componente a jusante da apoptose que é causado em parte pela activação da caspase-3 [30], foi também examinada após a indução de apoptose (Figura 6B, Figura S4B, D). clivagem de PARP foi observada em células NL20 seguintes estímulos apoptóticos, mas estava ausente em células A549. Observou-se a inibição da clivagem de PARP induzida por STS em células NL20 após tratamento concomitante com zVAD-FMK (Figura 6C), um inibidor da caspase conhecido, demonstrando que este é um processo mediado por caspase em células NL20. clivagem de PARP completa foi observada em células NL20 STS-tratados que sobre-expressam a proteína Drp1 (Figura 6C). STS-tratamento PARP induzida clivagem foi restaurado em células A549 com superexpressão Drp1 (Figura 6C).