Abstract

Fundo

Células-tronco mesenquimais (MSCs) promover o crescimento tumoral através da diferenciação em fibroblastos associados a carcinoma (FAC) e compondo o microambiente do tumor. No entanto, os mecanismos responsáveis ​​para a transição de MSCs para FAC não são bem compreendidos. Exossomos regular as atividades celulares por mediar a comunicação célula-célula. Neste estudo, o objetivo foi investigar se exossomos derivados de células cancerosas estavam envolvidos na regulação da diferenciação das MSCs derivadas de cordão umbilical humano (hucMSCs) para FAC.

Metodologia /Principais Achados

primeiro mostrou que exossomas derivadas de células de cancro gástrico induzida a expressão dos marcadores de CAF em hucMSCs. Em seguida, demonstrou que exossomos derivados de células de câncer gástrico estimulado a fosforilação de Smad-2 em hucMSCs. Nós ainda confirmado que o TGF-β receptor 1 inibidor da quinase atenuada Smad-2 fosforilação e expressão do marcador CAF em hucMSCs após a exposição a exossomos derivados de células de câncer gástrico.

Conclusão /Significado

Nossos resultados sugerem que as células cancerosas gástricas desencadeou a diferenciação de hucMSCs a FAC por transferência exosomes mediada por TGF-β e TGF-β /ativação da via Smad, o que pode representar um novo mecanismo para MSCs a transição FAC em câncer

Citation.: gu J, Qian H, Shen L, Zhang X, Zhu W, Huang L, et ai. (2012) câncer gástrico exossomas Gatilho Diferenciação de Cordão Umbilical Derivado Células-Tronco Mesenquimais para Carcinoma-associados fibroblastos através de TGF-β /Smad Caminho. PLoS ONE 7 (12): e52465. doi: 10.1371 /journal.pone.0052465

editor: Rajeev Samant, Universidade do Alabama em Birmingham, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de Junho de 2012; Aceito: 13 de novembro de 2012; Publicação: 20 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Gu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiada pelo Plano de Investigação principal do National Natural Science Foundation da China (Grant no. 91129718), o National Natural Science Foundation da China (Grant no. 81071421, 31140063), científica e Tecnológica Programa de Suporte da província de Jiangsu (Grant não. BE2010703 ), 333 Projeto da província de Jiangsu (Grant no. 2009055) ea Equipe de Sci-tech Inovação e talentos da Universidade de Jiangsu (Grant não. 2008-018-02). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

as células tumorais começar a moldar o seu microambiente na fase precoce da progressão maligna [1]. Relatórios extensivos demonstraram as interacções generalizadas entre microambiente do tumor e células cancerosas, que são críticas para a progressão do tumor tumorigénese e [2], [3]. Tumor microambiente poderia provocar alterações reversíveis no fenótipo das células cancerosas e facilitar a sua propagação metastática [4], e as mudanças de microambiente do tumor até mesmo afetar drasticamente a eficácia da terapia do câncer. microambiente tumoral é composto por diversos tipos de células incluindo fibroblastos, associada a carcinoma (FAC), infiltrando-se células imunitárias do sangue, e redes vasculares e linfáticas, as células estaminais mesenquimais (MSCs) [4], [5].

FAC são factores determinantes na progressão maligna de crescimento do câncer, vascularização e metástases. FAC que expressam proteína de activação de fibroblastos (FAP) e actina de músculo liso-α (α-SMA) poderia criar um nicho para células cancerosas e promover a sua motilidade [6], [7]. Com efeito, FAC passam por um processo de diferenciação induzida por células de tumor e desenvolver capacidades invasivas e migratórias [8], [9].

células estaminais mesenquimais são células multipotentes que podem ser isolados a partir de uma ampla variedade de tecidos, incluindo o osso medula, tecido adiposo, sinóvia, músculo esquelético, fígado, sangue do cordão umbilical, da placenta e do cordão umbilical [10] – [13]. MSCs podem ser induzidas a diferenciar-se em osteócitos, condrócitos, adipócitos e miócitos por causa da sua capacidade regenerativa e capacidade multipotentes [14]. MSCs casa para sobreviver e nos locais de inflamação e lesão, assim como tumores, contribuindo para a formação de estroma associado ao tumor [15]. Estudos confirmaram que as MSC podiam diferenciar-se em miofibroblastos, fibroblastos associada a carcinoma, fibrócitos ou pericitos sob as condições microambiente tumoral [6], [16], [17]. Nos nossos estudos anteriores, que têm demonstrado que as MSC de medula óssea e os seus derivados exossomas poderia promover o crescimento de tumores [18], [19]. No entanto, o mecanismo responsável por este efeito permanece em grande parte desconhecida.

As células tumorais interagir com microambiente do tumor por interacção célula-célula e mecanismos parácrinos, tais como a produção de uma variedade de factores de crescimento, quimiocinas e enzimas de degradação da matriz que melhoram a proliferação e invasão do tumor [20]. Para além dos mecanismos conhecidos, um mecanismo novo que as células tumorais podem libertar activamente exossomas está a emergir. Os exossomas tem uma composição particular, reflectindo a sua origem e pode transferir não só componentes de membrana, mas também de ácidos nucleicos entre diferentes células [21], [22], salientando o seu papel na comunicação intercelular [23]. evidências acumuladas mostrou a contribuição de exossomas a um modo de comunicação celular, levando a transferência de moléculas intercelular [24]. Embora o papel regulador do exossomos no sistema imunológico e sua aplicação como vacina em imunoterapia do cancro é promissor [25] – [28]., O resultado seguinte interação entre exosomes cancerosas e células estromais não é bem compreendido

Maligno células reverter MSCs a FAC que contribuem para promover a progressão do tumor tem incentivado investigação sobre os possíveis mecanismos para a sua transição. Estudos têm demonstrado que, pelo menos, 20% de FAC originam a partir de medula óssea e são derivadas de células estaminais mesenquimais em modelos de ratinho de cancro gástrico em induzida por inflamação [16]. Nossa hipótese é que as células cancerosas se comunicavam com MSCs através da liberação de exossomos e transferência de proteínas, portanto, induzir a diferenciação das MSCs para FAC. No presente estudo, foi demonstrado que as MSCs adquirido um fenótipo CAF após a exposição aos exossomas derivada-cancerosas e a diferenciação das MSCs de FAC foi associada com a activação de TGF-β /via de sinalização de Smad.

Materiais e Métodos

Cultura celular

Humanos MSCs do cordão umbilical foram obtidos como descrito anteriormente [12], [29]. cordões umbilicais frescas foram coletadas de informadas, mães consentindo e processados ​​dentro de 6 h. Os cabos foram lavadas duas vezes por solução salina tamponada com fosfato (PBS) em penicilina e estreptomicina e foram então removidos vasos do cordão. Os cabos de lavadas foram cortados em pedaços de 1-3 mm

2 de tamanho e flutuou em DMEM contendo FBS a 10% (Invitrogen, EUA), 1% de penicilina e estreptomicina. Os pedaços de fio foram subsequentemente incubadas a 37 ° C em ar húmido com 5% de CO

2 e o meio foi trocado a cada 3 dias após o plaqueamento inicial. Quando colónias bem desenvolvidas de células semelhantes a fibroblastos atingiu 80% de confluência, as culturas foram tripsinizadas e passadas para novos frascos para posterior expansão. As características de hucMSCs isolado incluindo aparência morfológica, antigénios de superfície, o potencial de diferenciação e de expressão de genes foram investigados como previamente descrito [12]. Todos os protocolos experimentais foram aprovados pelo Comitê de Jiangsu Universidade de Ética. Foram selecionados os hucMSCs de passagem 2 para os experimentos. células cancerosas gástricas humanas (SGC7901 e HGC27) foram adquiridos da Cell Bank, Type Culture Collection Comissão (Academia Chinesa de Ciências). células epiteliais gástricas (GES-1) foram adquiridos a Cwbiotech Companhia e mantidas em DMEM suplementado com FBS a 10%.

exossomo Isolamento e Purificação

SGC7901, HGC27 e células epiteliais gástricas (1 GES- ) exossomas derivados foram isolados e purificados como descrito anteriormente [30], [31]. Resumidamente, as células foram cultivadas em DMEM suplementado com soro fetal bovino a 10% exossomo-empobrecido. exossomas fetal de bovino foram removidos por ultracentrifugação a 100.000 g durante a noite durante 16 h, usando um rotor tipo 90 Ti fixa-Angel (Optima L-90K, Beckman Coulter). Os sobrenadantes de culturas confluentes (3-5 dias) foram centrifugadas a 2000 g durante 20 min para remover as células e detritos. E o sobrenadante clarificado foi concentrado por ultrafiltração através de uma membrana de fibra oca 100 kDa MWCO (Millipore) a 1000 g durante 30 min. O sobrenadante concentrado foi carregado em tubos de centrifugação (Beckman) e underlayed com 30% de sacarose D

2O almofada /densidade (5 ml) a formação de uma interfase visível e ultracentrifugado a 100000 g e 4 ° C durante 1 h num SW-32Ti rotor de balde (Optima L-90K, Beckman Coulter). Em seguida, ambos os exossomas almofadas de sucrose densidade (fracção 3) recolhidas a partir dos tubos de ultracentrífuga inferior e as fracções nonbanded (fracção 6 e 7), que contêm complexos de proteína nonmembrane recolhidos para uso como controlo exossomas (E-controlo) foram reunidas e lavadas três vezes através de um cartucho de fibra oca miniatura 100 kDa (Millipore) a 1000 g durante 30 min como descrito acima. O teor de proteínas foi medida utilizando o kit de ensaio de BCA (Pierce). Os exossomas foram esterilizados através de um filtro de 0,22 um cápsula (Millipore) e armazenou-se a -70 ° C até à sua utilização [30].

Microscopia Electrónica

Uma gota de exossomas (cerca de 20 uL) obtido após ultracentrifugação diferencial foi pipetado para grelhas revestidas de Formvar de carbono e deixou-se repousar durante 1 min à temperatura ambiente. Depois de remover o excesso de fluido com uma peça de filtro, a amostra foi corada com 2% (w /v) de ácido fosfotúngstico (pH 6,8) durante 5 min e foi uma lâmpada incandescente eléctrico seco ao ar, e analisadas com um microscópio electrónico de transmissão (FEI Tecnai 12, Philips).

exossomas Labeling e Internalização

exosomes SGC7901 células derivadas e os exossomos controle foram rotulados com CM-Dil (vermelho) de acordo com o protocolo do fabricante (Invitrogen). Exossomos de células GES-1 foram utilizados como controle celular. A suspensão foi filtrada exossomo marcado com uma membrana de 100 kDa MWCO de fibra oca (Millipore) e o fluxo de passagem foi utilizada como o controlo de corante não ligado. HucMSCs (1 × 10

4 /po) foram semeadas em placas de 12 poços contendo lamelas e incubou-se a 37 ° C com exossomas marcados (800 ug /ml) durante 4 h antes da colheita.

A coloração imunofluorescente

HucMSCs foram fixadas em paraformaldeído a 4% durante 10 min. As células marcadas foram preparadas para microscopia de fluorescência pelo per-mobilização durante 3 min com 0,1% de Triton-X100, bloqueadas com 5% de BSA e incubadas com anticorpo monoclonal de coelho anti-β-actina durante a noite, seguida de incubação com IgG Cy2-anticorpos marcados anti-coelho anticorpo secundária a 37 ° C durante 45 min (Jackson ImmunoResearch). Os núcleos foram contrastadas com DAPI. imagens confocais foram adquiridos sequencialmente com sistema TCS SP5 II (Leica) [32].

CAF Diferenciação

HucMSCs foram semeadas em placas de 6 poços (5 x 10

3 /poço) . Doze horas após a sementeira, hucMSCs foram tratados com exossomas (800 ug /mL) para provocar a diferenciação CAF na presença ou ausência do receptor de um SD208 TGF-β inibidor de cinase (Sigma) ou TGF-β humana recombinante (5 ng /ml; Sigma). O meio foi trocado a cada 3 dias durante 14 dias. As células foram então recolhidas e preparadas para transferência de Western e análise de PCR quantitativo.

Western Blotting

As células foram recolhidas e lisadas com tampão RIPA (Tris 10 mM, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 1 mM EGTA, 0,1% de SDS, 1 mM de NaF, 1 mM de Na

3VO

4, 1 mM de PMSF, 1 mg /ml de aprotinina, 1 mg /ml leupeptina). As aliquotas contendo quantidades iguais de proteína foram fraccionadas e, em seguida, transferido para metanol pré-activado membranas de PVDF (Millipore, EUA). Após incubação sequencial com anticorpo primário e secundário, o sinal foi visualizada utilizando o substrato de HRP (Millipore, EUA) e analisadas por software MD Imagem Quant. Fontes e factores de diluição de anticorpos primários foram: policlonal de coelho anti-CD9 (1:1000; Bioworld), anti-CD81 (1:1000; Epitomics), anti-TGF-β (1:1000; Bioworld), anti-FAP ( 1:1000, Abcam), anticorpo monoclonal de ratinho anti-α-SMA (1:1000; Santa Cruz), anti-VEGF (1:1000; Santa Cruz) e anti-vimentina (1:2000; Santa Cruz), anti-N -cadherin (1:1,000; Bioworld), anti-e-caderina (1:500; SAB) e monoclonal anti-GAPDH. (1:5000; Kangcheng)

RT-PCR quantitativo

o ARN total foi extraído com o reagente de Trizol (Invitrogen) e o ADNc foi sintetizado utilizando um kit de transcrição reversa (Toyobo, Japão) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores foram produzidos por Invitrogen Company (Xangai, China). Em tempo real de RT-PCR foi realizada para detectar a alteração de FAP, a-SMA, N-caderina e IL-6, a expressão do gene (Rotor Gene 6000, Austrália). Para compensar as variações de ARN de entrada e a eficiência da transcrição reversa, um gene endógeno “arrumação” (β-actina) também foi quantificada para normalizar os resultados. Todas as amostras foram realizadas em triplicado, e todas as reacções foram repetidas 3 vezes, independentemente, para assegurar a reprodutibilidade.

Migração Ensaio

HucMSCs (8 × 10

4 em 200 uL) em suspensão em soro forma -livre foram carregados para dentro do compartimento superior e meio isento de soro de 500 uL (SFM) contendo 800 ug /ml de exossomas, na presença ou ausência de um receptor de quinase SD208 inibidor de TGF-β (2 uM) foi adicionado para a parte inferior do Transwell (Corning). Após cultura a 37 ° C durante 6 horas, as células superior da membrana foram esfregadas com uma mecha de algodão. As células que migraram através da membrana foram fixadas com paraformaldeído a 4% e coradas com violeta de cristal. As células foram observadas ao microscópio e pelo menos 10 campos de células foram ensaiados para cada grupo.

TGF-β Neutralização

HucMSCs foram tratados com exossomas tumorais (800 ug /ml) para desencadear a CAF diferenciação na presença ou ausência de anticorpo de TGF-β (R D). Antes das experiências, o anticorpo anti-TGF-β (20 ug /ml) foi incubada com exossomas a 37 ° C durante 2 horas.

Análise estatística

Todos os dados foram expressos como média ± SD. SPSS foi usado para analisar os dados. Os meios de diferentes grupos de tratamento foram comparados pela bidireccional teste ANOVA ou o teste t de Student. P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo

Resultados

exossomas Caracterização e Internalização

Nós isolados e identificados os exossomos base em seu tamanho original e densidade.. Como mostrado na Fig. 1A-A, os exossomas tinha uma forma de disco, como característica limitada por uma bicamada lipídica com um diâmetro variava entre 40 e 100 nm. Confirmou-se a expressão abundante de marcadores exosomal CD9 e CD81 nos exossomas isoladas por transferência de Western (Fig. 1A-b). Seguindo os nossos estudos anteriores, as MSC derivadas de cordão umbilical humano foram preparados e caracterizados (dados não mostrados). Para investigar a internalização de exossomos por hucMSCs, nós rotulados os exossomos com CM-Dil. Como mostrado na Figura 1B, SGC7901 células derivadas exossomas foram internalizados e acumulada em hucMSCs após incubação durante 4 horas enquanto o controle exossomas mostrou um efeito mínimo. Comparado com o grupo SGC7901, menos GES-1 exossomos derivados foram ocupados por hucMSCs.

A. A morfologia do exossomos e expressão do marcador exosomal. (A) Análise morfológica de câncer derivado exosomes gástricas. Barra de escala = 100 nm. (B) CD9 e expressão CD81 em exossomos. B. exossomas foram captados por hucMSCs. Os exossomas marcadas com CM-Dil (vermelho) a 37 ° C durante 1 h, foram adicionados em hucMSCs e incubados durante 4 h. O efluente a partir de uma suspensão filtrada de exossomas CM-Dil-marcados (de controlo) e a fracção de exossomas retirado CM-Dil-marcado (e-exos) foram utilizados como controlos. As células foram fixadas e coradas para o citoplasma (Cy2-actina, verde) e núcleos (DAPI, azul). Barra de escala = 20 mm.

exossomos-tumorais Promover hucMSCs Diferenciação de FAC

A hipótese que exossomos derivados do tumor pode induzir a diferenciação de hucMSCs a FAC

in vitro

. FAC foram definidos como o aumento da expressão de FAP e proteínas α-SMA. HucMSCs monocamada foi cultivado em meio contendo 800 ug exossomas SGC7901 /ml e 1 GES-exossomas. As análises RT-PCR quantitativa mostrou que SGC7901 exossomas mas não GES-1-exossomas promovida a expressão dos marcadores de CAF em MSCs em 36 h (Fig. 2A) e 14 d (Fig. 2B) após a indução, respectivamente. Em comparação com o grupo não tratado, tumor exossomas tratamento resultou em aumentos de FAP, α-SMA, N-caderina, e os níveis de proteína de vimentina (Fig. 2C). Colectivamente, estes resultados indicam que hucMSCs sofrer diferenciação CAF em resposta à exposição do tumor exossomas.

A.Quantitative análises da expressão FAP, IL-6 e α SMA-ARNm em hucMSCs. HucMSCs foram tratados com várias concentrações de SGC7901 exossomas ou GES-1 exossomas durante 36 horas. B. As análises quantitativas da expressão FAP, IL-6 e N-caderina em hucMSCs. HucMSCs foram tratados com várias concentrações de SGC7901 exossomas ou GES-1 exossomas para 14 dias. blotting C. Ocidental análises da expressão da proteína FAP, α-SMA, N-caderina e vimentina em hucMSCs tratados com SGC7901 exossomas (800 ug /mL) durante tempos diferentes. (A-d) análise da densidade das bandas de Western blotting. * P 0,05 e # P 0,01, em comparação com o grupo de controlo relativo (n = 3)

exossomos-tumorais Promover hucMSCs Migração

Para analisar se a capacidade migratória. de hucMSCs foi afectada por exossomas tumorais, hucMSCs foram cultivadas na Transwell e induzidas a migrar por exossomas tumorais. Como mostrado nas Figuras 3A e 3B, a 6 horas após a incubação, os exossomas tumorais promoveu a migração de hucMSCs mais eficientemente do que os exossomas derivadas de células normais. Também mostrou que o aumento da migração de hucMSCs por exossomas tumorais foi bloqueado pelo tratamento simultâneo com o inibidor de TGF-β R1, SD208. Além disso, examinou-se o efeito de SGC7901 exossomas sobre a migração de hucMSCs usando ensaio de zero. Os resultados foram consistentes com a de Transwell ensaio de migração, que mostra uma distância de folga reduzida no grupo tratado com tumor exossomo (Fig. S1). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que exossomos tumor pode promover a migração de hucMSCs

in vitro

.

A. HucMSCs foram tratados com células do cancro gástrico ou derivada de células epiteliais gástricas exossomas normal (800 ug /ml) na presença ou ausência de SD208 (2