Abstract
O controle da radiorresistência e Induzidas por Radiação potencial metastático das células cancerosas sobreviventes é importante para melhorar a erradicação do câncer por radioterapia. O homeobox2 distal-menos (
Dlx2
) gene codifica um fator de transcrição homeobox envolvido na morfogênese e sua desregulamentação foi encontrado em tumores sólidos humanos e malignidades hematológicas. Aqui nós investigamos o papel de Dlx2 em associação com epitelial induzida por radiação para mesenquimal (EMT) e haste propriedades da célula-like e sua regulação por Smad2 de sinalização /3 em A549 irradiado e MDA-MB-231 linhas celulares de cancro humano. Em A549 irradiados e células MDA-MB-231, EMT foi induzida como demonstrado pela expressão EMT marcador, fosforilação de Smad2 /3, e a capacidade migratória e invasiva. Além disso, irradiadas A549 e células MDA-MB-231 mostraram aumento cancro de células estaminais marcador (CSCs). Curiosamente, Dlx2 foi sobre-expresso por irradiação. Portanto, nós examinamos o papel da Dlx2 na EMT induzida por radiação e radiorresistência. A superexpressão de Dlx2 sozinho induzida EMT, migração e invasão e expressão do marcador CSC. A redução da capacidade de formação de colónias em células irradiadas foi parcialmente restaurada por superexpressão Dlx2. Por outro lado, o empobrecimento de Dlx2 usando SI-ARN abolida EMT induzida por radiação, a expressão do marcador CSC, e fosforilação de Smad2 /3 em células A549 irradiado e MDA-MB-231. Além disso, a depleção de Dlx2 aumentou a sensibilidade à radiação em ambas as linhas celulares. Além disso, knockdown de Smad2 /3, um activador chave da via do TGF-β1, revogada a expressão Dlx2 induzida por radiação, indicando que a expressão Dlx2 induzida por radiação é dependente da sinalização de Smad2 /3. Estes resultados demonstraram que Dlx2 desempenha um papel crucial na radiorresistência, EMT induzida por radiação e expressão do marcador de CSC, e a expressão de Dlx2 é regulada por Smad2 /3 sinalização em A549 e linhas celulares de MDA-MB-231.
citação: Expressão Choi YJ, Baek GY, Parque HR, Jo SK, Jung U (2016) Smad2 /3-regulamentado de Dlx2 está associado com a radiação induzida por epitelial-mesenquimal Transição e radiorresistência de A549 e celular MDA-MB-231 Humano do Câncer linhas. PLoS ONE 11 (1): e0147343. doi: 10.1371 /journal.pone.0147343
editor: Aamir Ahmad, Escola de Medicina da Universidade Estadual Wayne, United States |
Recebido: 08 de abril de 2015; Aceite: 31 de dezembro de 2015; Publicação: 22 de janeiro de 2016
Direitos de autor: © 2016 Choi et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação
Financiamento:.. Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de Pesquisa da Coreia (NRF) de subvenção financiada pela Coreia do governo (MSIP) (No. 2013M2A2A7043663)
competir interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
a radioterapia é uma das terapias mais comuns para o câncer, mas uma de suas limitações é que alguns de câncer sobreviventes células pode ganhar radiorresistência [1] e a capacidade metastática [2] a seguir a radioterapia repetido. A presença de células epiteliais de transição mesenquimal (EMT) e cancro de células estaminais (CSCs) tem sido implicado como causa putativa de radiorresistência do tumor em pacientes [2]. CSCs são uma população distinta de células tumorais com propriedades de auto-renovação e regeneração, e foram identificadas em vários tumores malignos humanos [3, 4, 5]. CSCs mostram características típicas de EMT [6, 7], e EMT é novamente associada a radiorresistência [8, 9]. Por esta razão, a investigação e desenvolvimento de biomarcadores preditivos e estratégia terapêutica alvo de CSC e EMT são especialmente importantes para a avaliação do prognóstico e melhoria radiossensibilidade em terapia de radiação [10, 11]. marcadores CSC representativos incluem Oct4, Sox2, Slug /[12, 13, 14], e os relatórios recentes identificaram particularmente CD44 como um potencial biomarcador relacionado com o CSC para radioterapia em células de câncer de pulmão e da mama [15, 16, 17].
No processo EMT de células cancerosas, as expressões dos genes epiteliais tais como e-caderina e Vinculina são inibidos, enquanto que as expressões dos genes mesenquimais, tais como N-caderina e vimentina são reforçadas [18, 19, 20 ]. Como resultado de EMT, as células adquirem propriedades metastáticas, incluindo a perda de inibição de contacto, o controlo do crescimento desordenado, e invasividade agressivo [18, 21]. EMT é regulado por fatores de transcrição, incluindo Caracol, Twist, e ZEB [7, 22, 23, 24]. As metaloproteinases de matriz (MMPs) são também mediadores importantes da EMT, que se decompõem ECM e permitem a migração e a invasão de células cancerosas para locais distantes, resultando em metástase tumoral [25].
numa condição normal, actos de TGF-p como um supressor de tumor, mas também é conhecido por aumentar EMT e para apoiar a angiogénese na fase tardia de tumorigénese [26]. Recentemente, vários relatórios demonstraram que a radiação ionizante promove EMT via de sinalização de TGF-β Smad-dependente em linhas celulares de cancro [6, 27, 28]. Na via de TGF-β, receptores de TGF-p reconhecem ligandos e desencadear a fosforilação de proteínas Smad associadas ao receptor (Smad2 /3) que se associam com Smad4. Smad2 /3/4 complexos se acumulam no núcleo e participar na regulação da expressão de genes-alvo [29].
Vertebrados homeobox2 distal-less (Dlx2) atua como um fator de transcrição homeo-box e tem um papel crucial em o desenvolvimento embrionário, desenvolvimento craniofacial, homeostase do tecido. De acordo com relatórios recentes, a desregulamentação dos Dlx2 foi encontrado em tumores sólidos humanos e malignidades hematológicas [30, 31, 32], e Dlx2 é especulado para ser envolvidos na progressão tumoral através da regulação da necrose induzida por estresse metabólico [33]. Além disso, a própria Dlx2 é um gene alvo de sinalização de TGF-β Smad-dependente e actua como um factor de feedback negativo de TGF-β sinalização [34]. Estes estudos nos fez focar o papel potencial da Dlx2 na aquisição da CSC e as características de EMT via de sinalização TGF-β Smad-dependente em células cancerosas tratadas com IR.
Neste estudo, nós investigamos o papel de Dlx2 em associação com propriedades semelhantes a células-tronco e epitelial para mesenquimal (EMT) e sua regulação pelo Smad2 sinalização /3 em células de câncer de pulmão A549 humanos irradiados e MDA-MB-231 células de cancro da mama humano. Relatamos aqui que IR induzida a expressão de Dlx2 através da ativação de Smad2 /3, e Dlx2 promovido a migração e invasão, e radiorresistência em A549 e linhas de células MDA-MB-231.
Materiais e Métodos
Anticorpos
Anticorpos contra Dlx2, Smad2 /3, CD44, β-catenina, N-caderina e e-caderina foram adquiridos a Thermo Scientific (Rockford, IL, EUA). Anti-Snail, anti-vimentina e anticorpos anti-vinculina foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, EUA). Um anticorpo anti-pSMAD2 /3 foi adquirido a Kerafast, Inc. (Boston, MA, EUA). O anticorpo anti-β-actina foi adquirido de Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, EUA).
cultura celular e irradiação
A549 (linha humano não-pequenas do pulmão de células de células de cancro) e MDA-MB-231 (linha celular de cancro da mama humano) foram adquiridos a coreana linha celular Banco (Seoul, Coreia). As células foram mantidas em RPMI1640 suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS; Hyclone, UT, EUA), 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO
2 atmosfera. As células foram descoladas da placa de cultura utilizando tripsina a 0,25% e diluiu-se para 1,5 x 10
5 células /mL. As células foram irradiadas com
137Cs raios-y usando um Gammacell 40 Exactor (MDS Nordion, Ontário, Canadá), ao KAERI e, em seguida, re-semeadas em placas de cultura ou câmaras.
Construção do vector Dlx2 superexpressão e transfecção
Uma inserção de Dlx2 humana foi amplificado a partir pCMV-sports6 /Dlx2 (Coreia do Human Gene Bank, Seoul, Coreia do Sul) por PCR usando os seguintes iniciadores:
EcoRI
(forward): 5 ‘-CGGAATTC ATGACTGGAGTCTTTGAC-3’ e
Xho
I (reverso): 5′-CTCTGAGT TTAGAAAATCGTCCCCG-3 ‘. inserções Dlx2 foi clonado no vector pcDNA3-myc, que permite a expressão da proteína de c-myc-marcado em células de mamífero. pcDNA3-myc /Dlx2 ou pcDNA3-myc foi então entregue a células (4 ug /2,5 × 10
5 células) utilizando HilyMax (Dojindo Molecular Technologies, Rockville, ML, EUA) o reagente de transfecção de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação durante 24 h, as células foram destacadas e irradiada.
pequeno-ARN interferente (siRNA) transfecção
O Dlx2 SI-ARN segmentação e Smad2 /3 foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology ( Santa Cruz, CA, EUA). Para a transfecção, as células foram plaqueadas e crescidas a 70-90% de confluência. Alvo si-RNA ou um controlo negativo si-Ct foi então entregue a células (si-Dlx2: 50 mm /2,5 × 10
5 células, si-Smad2 /3: 100 M /2,5 × 10
5 células) usando o reagente de transfecção HilyMax de acordo com as instruções do fabricante. Após incubação durante 24 h, as células foram destacadas e irradiada.
extracção de ARN e quantitativa PCR em tempo real
Após 24 h de irradiação, extractos totais de ARN (1 × 10
6 células ) foram isolados por Trizol Reagente (Ambion, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. A transcrição reversa foi realizada durante a síntese de ADNc, utilizando RT TOPscript DryMIX contendo a transcriptase reversa, tampão RT, mistura de dNTP, oligo dT (Enzynomics, Seul, Coreia do Sul). Quantitative PCR em tempo real foi realizada por um StepOne PCR em tempo real (Applied Biosystems, CA, EUA) com o reagente de SYBR Green (Enzynomics, Seul, Coreia do Sul). Os iniciadores foram concebidos utilizando o iniciador-BLAST (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/) e as sequências são apresentadas na Tabela 1. O volume total de reacção de mistura de PCR foi de 20 ul e a reação as condições eram de 15 min de desnaturação inicial a 95 ° C e 40 ciclos de 10 seg a 95 ° C, 15 seg a 60 ° C e 20 segundos a 72 ° C. O comparativo C
T método foi usado e o nível de expressão de ARNm relativa foi calculada com base na normalização para a p-actina. Todas as experiências foram repetidas três vezes em forma independente.
clonogénicas ensaio
separada células foram expostas a várias doses de irradiação e incubadas durante 7 dias (A549) e 10 dias (MDA-MB -231) a 37 ° C. O meio de todas as culturas foi renovada a cada 3 dias. As colónias foram fixadas com metanol a 60% e coradas com violeta de cristal a 0,5%. As colónias contendo 50 ou mais células foram contadas como células clonogénicas. Os valores da fração de sobrevivência relatados são a média de seis repetições de três experiências independentes.
A migração celular ensaio
Para medir a sua migração, irradiado A549 e células MDA-MB-231 foram semeadas em uma transpoço (Corning Incorporated, NY, EUA) a uma densidade de 2,5 x 10
4 células /poço em 200 ul de meio isento de soro e incubadas durante 7 h (A549) ou 3 h (MDA-MB-231) a 37 ° C. Após a incubação, o meio foi removido. As células foram fixadas por incubação com 100% de metanol e coradas com violeta de cristal a 0,5% durante 15 min. A membrana foi cortada a partir de cada câmara e as células migraram na superfície inferior do filtro foram contados por microscopia de filtro em aleatório arquivado com uma ampliação de 200 vezes (Leica, Heidelberg, Alemanha). Os valores relatados são a média de três experiências independentes.
invasão celular ensaio
A capacidade de A549 e MDA MB irradiado-231 para passar através de filtros revestidos com Matrigel foi medida num Boyden ensaio de invasão de câmara. Matrigel foi aplicado ao topo de um filtro de policarbonato (tamanho de poro, 8 mm). Os ensaios de invasão celular foram realizadas utilizando um kit de ensaio de invasão de Matrigel (BD Biosciences, Bedford, MA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, as células foram semeadas na câmara superior a uma densidade de 2,5-5 × 10
4 células /poço em 500 ul de meio isento de soro e incubadas durante 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231 ) a 37 ° C. As células que invadiram a superfície inferior de cada membrana foram fixadas com metanol 100% e coradas com violeta de cristal a 0,5% durante 15 min. A membrana foi cortada a partir de cada câmara e as células invadidas na superfície inferior do filtro foram contados por microscopia de filtro em aleatório arquivado com uma ampliação de 100 vezes (Leica, Heidelberg, Alemanha). Os valores relatados são a média de três experiências independentes.
análise Western blot
Após 24 h de irradiação, os lisados celulares totais (2 × 10
6 células) foram preparadas utilizando tampão de lise RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA) contendo phenylmethanesulphonylfluoride 10 mM (PMSF), 10 mM de fluoreto de sódio (NaF), ortovanadato de sódio 1 mM (Na
3VO
4) e um cocktail de inibidor de protease completo (Sigma- Aldrich, St. Louis, MO, EUA) e o teor de proteínas foi medida utilizando o reagente de ensaio de proteína BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL, EUA), com albumina de soro de bovino como padrão. Quantidades iguais de proteínas foram resolvidas por 10% SDS-PAGE e transferidas para uma membrana de difluoreto de polivinilideno (Amersham Hybond, Freiburg, Alemanha). A membrana foi então lavada com solução salina tamponada com Tris (Tris 10 mM e NaCl 150 mM) contendo 0,1% de Tween 20 (TBST), e bloqueou-se com TBST contendo 5% de leite em pó desnatado em pó. A membrana foi incubada durante a noite com anticorpo primário e a mancha foi exposta a um anticorpo secundário conjugado com peroxidase de rábano e desenvolvido utilizando ECL ocidentais reagentes de detecção blot (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA).
imunofluorescência (IF) de coloração
Para analisar a localização intracelular de proteínas F-actina e marcador, A549 e MDA-MB-231 foram de sementes no Lab-Tek slides câmara de 8 bem lâmina de vidro (Nunc, NY, EUA) e transfecção com si -Ct ou Si-Dlx2 durante 24 h e depois a incubação durante 24 h depois de IV. As células fixadas em 4% de formaldeído foram corados através de incubação com o anticorpo primário (anti-caderina N-anticorpo policlonal de coelho /vimentina /E-caderina /Vinculina, diluído 1: 100) durante a noite a 4 ° C. Eles foram então lavadas com PBS, incubadas com tampão de bloqueio, e tratados com um anticorpo conjugado com Alexa 546-anti-coelho (Molecular Probes, CA, EUA) durante 3 h à temperatura ambiente. Finalmente, intracelular de F-actina foi corado com Alexa-faloidina-488 (diluído a 1: 300, Molecular Probes, CA, EUA) durante 1 h. O núcleo da célula foi corado com TO-PRO-3 (Molecular Probes, Eugene, EUA). As células coradas foram montados e fotografada utilizando um microscópio de varrimento laser confocal (Leica, Heidelberg, Alemanha).
Determinação de TGF-β1 em sobrenadantes de cultura de células
A549 e MDA-MB-231 (5 × 10
5 células /poço) as células foram expostas ao IR em 8Gy, 4Gy e incubadas a 37 ° C durante 24 h. O nível de proteína de TGF-β1 em sobrenadantes de cultura foi medido utilizando um kit de ELISA de TGF-β1 (BD Biosciences, San Diego, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A absorvância a 450 nm foi medida utilizando um leitor de microplacas (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Os níveis de proteína TGF-β1 foram determinados a partir de três experiências diferentes e são expressos como pg /ml.
A análise estatística
Todos os experimentos foram realizados três vezes. Diferenças estatisticamente significativas foram identificadas utilizando o teste t de Student. probabilidade estatística de P 0,05 foi considerado significativo. Os dados representam a média ± S.E.M. das três experiências, cada uma realizada em triplicado.
Resultados
Radiação ionizante induz EMT e aumenta a CD44 e Dlx2 expressão
Em primeiro lugar, analisamos a sensibilidade à radiação de carcinoma de pulmão humano A549 e células de adenocarcinoma da mama MDA-MB-231 por ensaio clonogénico. Neste ensaio, a sobrevivência das células foi dependente da dose diminuiu IR (0, 2, 4, 6, 8Gy) em ambas as linhas de células, mas as células MDA-MB-231 foram mais sensíveis aos IV do que as células A549 (Figura 1A). As mudanças morfológicas de células após exposição a IR foram verificados em células A549 em células irradiadas 8Gy e MDA-MB-231 em 4Gy. O A549 irradiado e MDA-MB-231cells mostraram morfologias fusiformes e alongadas, que são típicos de fenótipos morfológicas EMT quando comparado com as células de controlo (Fig 1B).
(A) células isolada (1 × 10
5cells /ml) foram expostas a várias doses de irradiação e incubadas durante 7 dias (A549) e 10 dias (MDA-MB-231) a 37 ° C. As colónias contendo 50 ou mais células foram contadas como células clonogénicas. A fracção de sobreviventes foi calculada dividindo a eficiência de plaqueamento da amostra tratada com a eficiência de revestimento de controlo. eficiência de plaqueamento foi calculado dividindo-se o número de colónias com o número de células plaqueadas. Os valores relatados são a média de seis réplicas de três experiências independentes. (B) IR induz alterações morfológicas em células A549 e MDA-MB-231 após 24 h de exposição (A549-8Gy, MDA-MB-231-4Gy). A ampliação da imagem é × 100. Ct, controlar celular; IR, as células irradiadas.
A seguir, investigou as mudanças dose e tempo-dependente de CSC- e expressão do marcador relacionadas com a EMT. Em coerência com os estudos anteriores, IR aumentou a expressão do fator de sinalização TGF-β pSMAD2 /3, um marcador CSC (CD44), marcadores de EMT positivos (N-caderina, Vimentin), e fatores de transcrição que regulam EMT (Caracol, β-catenina ), e diminuiu a expressão de marcadores negativos EMT (e-caderina, Vinculina) dependentemente da dose IV ou tempo em ambas as linhas celulares (Fig 2A e 2B). Curiosamente, a expressão de Dlx2 também foi aumentada por IV em ambas as linhas celulares. experiências de dose-resposta revelaram que a indução Dlx2 foi observada em 8Gy em A549 e no 4Gy ou superior em MDA-MB-231 (Fig 2A e S1 Figura), e experiências de tempo-curso mostraram que os níveis de proteína Dlx2 foram dramaticamente aumentada às 24 h após irradiação em ambas as linhas celulares (Fig 2B e S2 FIG). Além disso, IR desencadeada a regulação positiva dos níveis de mRNA de marcadores stemness (OCT4, SOX2, LIF), factores de transcrição (torção, caracol), e marcadores de metástases (MMP2, MMP7) em ambas as linhas de células, decorridas 24 horas após a irradiação com uma dose única de 8Gy para células A549 ou 4Gy para células MDA-MB-231 (fig 2C e 2D).
(a) A549 e células MDA-MB-231 foram expostas ao IR em 0-8Gy e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Os lisados foram sujeitos a análise de Western blot com os anticorpos marcados. Dois experimentos independentes obtiveram resultados semelhantes. (B) A549 e células MDA-MB-231 foram colhidas em 0/3/6/24 h após 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231). Os lisados foram sujeitos a análise de Western blot com os anticorpos marcados. Dois experimentos independentes obtiveram resultados semelhantes. (C), (D) A549 e células MDA-MB-231 foram expostas ao IR em 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 24 h. Subsequentemente, as células foram isoladas por Trizol e sujeito a análise por PCR em tempo real com os iniciadores marcados. Todos os resultados foram obtidos a partir de três experiências independentes (*** p 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 contra CT). Ct, controlar celular; IR, as células irradiadas.
A superexpressão de Dlx2 aumenta EMT e radiorresistência
Para examinar se Dlx2 pode upregulate resistência à radiação e potencial metastático, A549 e células MDA-MB-231 foram transfectadas transitoriamente com pcDNA3-myc vector expressando Dlx2 ou vector de controlo pcDNA3-myc, e foi examinada a expressão de marcadores de CSC e EMT por análise western blot. A sobre-expressão de Dlx2 aumentou a expressão de um marcador de CSC (CD44) e os marcadores positivos EMT (N-caderina, Vimentina) e diminuiu a expressão de marcadores negativos EMT (E-caderina, Vinculina) em ambas as linhas celulares. Irradiação induziu alterações semelhantes desses marcadores como superexpressão Dlx2. No entanto, a fosforilação de Smad2 /3 foi ligeiramente reduzida (A549) ou não alterado (MDA-MB-231) por Dlx2 sobre-expressa, mas aumentada por irradiação em ambas as linhas celulares. A sobre-expressão de Dlx2 aumento da expressão de Snail em A549, mas não em células MDA-MB-231. A expressão de β-catenina não foi alterada pela sobreexpressão Dlx2 em ambas as linhas celulares (Fig 3A).
(A) células foram transf ectadas com 4 ug pcDNA-myc /Dlx2 ou pcDNA-myc e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 24 h. Subsequentemente, as células foram lisadas e os lisados foram submetidos a análise de Western blot. Dois experimentos independentes obtiveram resultados semelhantes. (B) As células foram transfectadas com 4 ug pcDNA-myc /Dlx2 ou pcDNA-myc e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 6 h (A549), 3 H (MDA-MB-231), em Transwell ( ensaio de migração). As fotografias são campos representativos de células que migraram na membrana. O gráfico indica média do número de células migradas a partir de três experiências independentes ± SE (*** P 0,001 versus as células de controlo do vector). (C) As células foram transfectadas com 4 ug pcDNA-myc /Dlx2 ou pcDNA-myc e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231), em matrigel ( ensaio de invasão). As fotografias são campos representativos de células invadidas na membrana. O gráfico indica média do número de células invadido a partir de três experimentos independentes ± SE (*** P 0,001 vs. as células de controle de vetores)
Para investigar o efeito metastático Dlx2 e IR em A549. e células MDA-MB-231, migração e invasão ensaios foram realizados. A549 overexpressed-Dlx2 e células MDA-MB-231 exibiram reforçada a capacidade de migração, 3 e 4 dobras, respectivamente, em comparação com o controlo de vector (Fig 3B). Além disso, a exposição ao IV (8Gy para A549, 4Gy para MDA-MB-231) aumentou o número de células por migração 3.2 dobras em ambas as linhas celulares (Fig 3B). Estes resultados mostraram que a superexpressão Dlx2 e IV aumentou significativamente a motilidade celular de A549 e células MDA-MB-231. Para examinar se a capacidade de invasão de células foi semelhante ou melhorada por IV Dlx2 sobreexpressão, A549 e células MDA-MB-231 foram aplicadas a invasão e câmaras de números de células adesivas foram contadas. A549 overexpressed-Dlx2 e células MDA-MB-231 exibiram capacidade invasiva aumentada por 3 e 5.3 dobras, respectivamente (Fig 3C). Além disso, a exposição a IR aumentou os números de células invasora de células A549 e MDA-MB-231 de 2,5 e 3,6 dobras, respectivamente (Fig 3C). Estes resultados demonstram que a sobre-expressão de Dlx2 ou IR aumentou significativamente a capacidade migratória e invasivo, bem como as mudanças de expressão de genes relacionados com a EMT CSC e em células A549 e MDA-MB-231.
Nós determinamos a seguir, se Dlx2 proporcionaria a sobrevivência de células de cancro aumentada após irradiação. Dlx2 que sobre-expressam A549 e células MDA-MB-231 foram irradiadas com 8Gy e 4Gy, respectivamente, e, em seguida, foi realizado ensaio clonogénico. A fracção sobrevivente de células transfectadas com vector de controlo diminuiu após irradiação em comparação com as células não-irradiadas. No entanto, as células que sobre-expressam Dlx2 mostraram significativamente maior taxa de sobrevivência em comparação com células transfectadas com vector após irradiação (Fig 4A e 4B). Em células não irradiadas, a formação de colónias não foi afectada por Dlx2-sobre-expressão (Fig 4A e 4B). Estes resultados indicam que a sobre-expressão Dlx2-contribui, pelo menos, parcialmente a radiorresistência em células A549 e MDA-MB-231.
As células foram transfectadas com 4 ug pcDNA-myc /Dlx2 ou pcDNA-myc e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 7 dias (A549), 10 dias (MDA-MB-231) e clonogenicidade de células medidos por ensaio clonogénico em A549 (a) e MDA-MB-231 (B). As fotografias são placa representativa de células de sobrevivência. O gráfico representa a média de três experimentos independentes ± SE (*** P 0,001 vs. as células IR expostos).
O silenciamento de Dlx2 inibe EMT induzida por IR e radiorresistência
Em seguida, examinamos se Dlx2 silenciamento iria suprimir potencial metastático e radiorresistência conferida pelo IR. A549 e MDA-MB-231cells foram transitoriamente transfectadas com 50? M de siARN de Dlx2 (Si-Dlx2) ou controlo SI-ARN (Si-CT) durante 24 h antes da irradiação (8Gy para A549, 4Gy para MDA-MB-231) . Em seguida, analisou-se a expressão de genes relacionados com a CSC e EMT, migrar e invadir capacidades, e capacidade de formação de colónia. Silenciamento de Dlx2 por siRNA EMT impedido como demonstrado por níveis de proteína reduzidos de marcadores EMT positivos (N-caderina, Vimentin) (Fig 5A, S3 figo e S4 FIG) e aumento do nível de marcadores negativos EMT (E-caderina, Vinculina) em irradiado As células A549 e MDA-MB-231 (Fig 5A, S5 figo e S6 FIG). A inibição da Dlx2 também impediu a indução de factores de transcrição críticos para EMT (caracol e β-catenina), e um marcador de CSC (CD44) em células A549 irradiado e MDA-MB-231. Curiosamente, factor de activação de sinalização de TGF-β, Smad2 /3, não foi afectada pela SI-Dlx2 em células irradiadas (Fig 5A).
(A) células foram transfectadas com 50 ^ M-Si Dlx2 ou Si- Ct e incubou-se a 37 ° C durante 24 h, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 24 h. Subsequentemente, as células foram lisadas e os lisados foram submetidos a análise de Western blot. Dois experimentos independentes obtiveram resultados semelhantes. (B) As células foram transfectadas com 50 ^ M-Si Dlx2 ou Si-CT e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 6 h (A549), 3 H (MDA-MB-231), em Transwell ( ensaio de migração). As fotografias são campos representativos de células que migraram na membrana. O gráfico indica média do número de células migradas a partir de três experiências independentes ± SE (*** P 0,001). (C) As células foram transfectadas com 50 ^ M-Si Dlx2 ou Si-CT e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 48 h (A549), 24 h (MDA-MB-231), em matrigel ( ensaio de invasão). As fotografias são campos representativos de células invadidas na membrana. O gráfico indica média do número de células invadido a partir de três experimentos independentes ± SE (*** P 0,001).
Para investigar o efeito anti-metastático de si-Dlx2 em células irradiadas, migração e Os ensaios foram realizados de invasão. Dlx2-silenciamento em células MDA-MB-231 ligeiramente reduzida capacidade de migração comparar com as células si-Ct. Além disso, em A549 e irradiado células MDA-MB-231, a transfecção de Si-Dlx2 diminuiu o número de células que migram em 1,7 dobras comparado com Si-Ct transfecção (Figura 5B). Estes resultados mostram que o silenciamento de ARNsi por Dlx2 motilidade celular significativamente inibida de células A549 e MDA-MB-231. Para examinar se a capacidade de invasão de células foi reduzido de forma semelhante por silenciamento Dlx2, células irradiadas foram aplicados às câmaras invasão e os números de células adesivas foram contadas. Em células não irradiadas, Dlx2-silenciamento inibiu a capacidade invasiva de células A549 de 1,4 dobras, mas nenhuma alteração significativa foi observada em células MDA-MB-231. Em A549 irradiados e células MDA-MB-231, a transfecção de Si-Dlx2 invadindo diminuiu o número de células de células A549 e MDA-MB-231 de 2,3 e 2,2 dobras, respectivamente (Fig 5C). Estes resultados demonstraram que o silenciamento de Dlx2 em A549 irradiados e células MDA-MB-231 inibiu significativamente a expressão de genes associados com a CSC e EMT, e capacidade migratória e invasiva que foram induzidos por IV.
Foram analisados a seguir, se Dlx2-silenciamento influencia a sobrevivência de células cancerosas após a irradiação. A549 e MDA-MB-231 transfectadas com Si-Si-Dlx2 ou Ct foram irradiadas a 4Gy e 2 Gy, respectivamente, e, em seguida, a formação de colónias foi analisada. Em células não irradiadas, Dlx2 silenciamento resultou numa ligeira diminuição da fracção sobrevivente em ambas as linhas celulares. Em células irradiadas, Dlx2 silenciamentos com chumbo a uma diminuição adicional da sobrevivência das células de forma significativa (redução de 1,5 vezes para o A549 e decréscimo de 1,6 vezes para MDA-MB-231) (Fig 6A e 6B). Estes resultados indicaram que o silenciamento de Dlx2 suprimida EMT-IR induzida potencial e o aumento da sensibilidade de radiação.
As células foram transfectadas com 50 ^ M-Si Dlx2 ou Si-CT e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Após separação celular, as células foram expostas a IR no 4Gy (A549) ou 2 Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 7 dias (A549), 10 dias (MDA-MB-231) e clonogenicidade de células medidos por ensaio clonogénico em A549 (a) e MDA-MB-231 (B). As fotografias são placa representativa de células de sobrevivência. O gráfico representa a média de três experimentos independentes ± SE (*** P 0,001).
expressão Dlx2 induzida IR é regulada por Smad2 /3
IR promove EMT via de sinalização de TGF-β Smad-dependente em linhas celulares de cancro [6, 27, 28], e Dlx2 é um gene alvo de Smad-dependente sinalização de TGF-β e factor de feedback negativo [34]. Portanto, foi examinada a associação do TGF-β sinalização com expressão Dlx2 induzida por IR. A irradiação de células A549 (8Gy) e MDA-MB-231cells (4Gy) aumentou a quantidade de TGF-β1 segregada para o meio de cultura (Fig 7A). Além disso, a fosforilação de RI promovido do factor de sinalização de TGF-β Smad2 /3 (Figuras 2A, 2B, 3A, 5A e 7C, S1 e S2 Fig FIG). No entanto, a sobre-expressão de Dlx2 diminuíram, em vez ligeiramente fosforilação de Smad2 /3 (Figura 3A). A fosforilação de Smad2 /3 não foi afectada nem pela SI-Dlx2 em A549 irradiados e células MDA-MB-231 (Figura 5A). Portanto, o próximo examinou se a indução de Dlx2 por IR é regulada por Smad2 /3 de sinalização. Smad2 /3 silenciamento por ARNsi revogada a expressão induzida por IR ARNm Dlx2 (figura 7B) e a expressão da proteína Dlx2 (Figura 7C e 7D). Estes resultados indicam que a expressão induzida por Dlx2 IR é dependente da sinalização de Smad2 /3.
(A) Os níveis de TGF-β1 imunorreactivo foram quantificadas a partir do meio de cultura celular por ELISA, como descrito nos Materiais e métodos (*** P 0,001, ** P 0,01 versus Ct). Ct, controlar celular; IV, células irradiadas. (B) As células foram transfectadas com 100 | iM Si-Smad2 /3 ou Si-Ct, incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Em seguida, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 24 h. O ARN total foi isolado a partir das células e submeteu-se a análise por PCR em tempo real. O gráfico representa a média de três experiências independentes ± SE (*** P 0,001). (C) As células foram transfectadas com 100 | iM Si-Smad2 /3 ou Si-CT e incubou-se a 37 ° C durante 24 h. Em seguida, as células foram expostas a IR no 8Gy (A549) ou 4Gy (MDA-MB-231) e incubados a 37 ° C durante 24 h. Subsequentemente, os lisados celulares foram sujeitos a análise de Western blot. Três experimentos independentes obtiveram resultados semelhantes. (D) Os níveis de proteína foram quantificadas por densitometria. Os dados são representados como valores relativos aos de Si-TC após normalização com β-actina (*** P 0,001, ** P 0,01, * P 0,05 contra Si-CT):
Discussão
a radioterapia é um componente crítico da gestão de câncer, mas algumas das células cancerosas sobreviventes ganhar radiorresistência [1] e capacidade metastática [2] sobre a radioterapia repetido.