Abstract

A exposição a agentes genotóxicos, tais como a irradiação produz danos ao DNA, a toxicidade de que é aumentada quando a reparação do ADN é prejudicada. Poly (ADP-ribose) polimerase (PARP) inibidores foram encontrados para ser “

letal sintética” em células deficientes em BRCA1 e BRCA2 que prejudicam a recombinação homóloga. No entanto, uma vez que muitos tumores, incluindo o cancro da próstata (CaP) raramente têm em tais mutações, existe um interesse considerável em encontrar alternativas determinantes de sensibilidade inibidor de PARP. Avaliou-se a eficácia da radiação em combinação com o inibidor de PARP, rucaparib em células APC. O índice de combinação para a sobrevivência clonogênica seguintes tratamentos de radiação e rucaparib revelou interacções sinérgicas em um painel de linhas celulares APC, sendo mais forte para células LNCaP e VCaP que expressam proteínas de fusão gene ETS. Estes resultados correlacionam com as interacções sinérgicas para activação senescência, como indicado pela β – galactosidase coloração. Ausência de PTEN e presença de fusão de genes ETS assim facilitada a ativação da senescência, o que contribuiu para diminuição da sobrevida clonogênica. O aumento da radiossensibilidade na presença de rucaparib foi associada com quebras de ADN persistentes, como determinado por χ-H2AX, p53BP1, e focos RAD51. VCaP células, que abrigam os

TMPRSS2-ERG

células de fusão de genes e PC3, que expressam de forma estável uma construção semelhante (fusão III) mostrou sensibilidade aumentada no sentido rucaparib, que, por sua vez, aumentou a resposta de radiação para uma intensidade semelhante à os ADN PKcs inibidor NU7441. Rucaparib radiosensitized células APC, com uma clara vantagem de radiação de taxa de dose baixa (LDR), administrada durante um longo período de tempo que causaram danos de DNA aumentada. LDR braquiterapia imitando, que é usada com sucesso na clínica, foi mais eficaz quando combinado com rucaparib através da indução de dano do ADN persistente e senescência, levando à diminuição da sobrevivência clonogénica. Esta combinação foi mais eficaz na presença do

TMPRSS2-ERG

e na ausência de

PTEN

, indicando potencial clínico para a braquiterapia em pacientes com CaP risco intermediário e alto.

Citation: Chatterjee P, Choudhary GS, Sharma A, Singh K, Heston WD, Ciezki J, et al. (2013) PARP Inibição sensibiliza para Low Dose-Rate radiação TMPRSS2-ERG fusão de genes que expressam e células PTEN com deficiência de câncer de próstata. PLoS ONE 8 (4): e60408. doi: 10.1371 /journal.pone.0060408

Autor: Philip J. Tofilon, National Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 31 de outubro de 2012; Aceito: 26 de fevereiro de 2013; Publicação: 02 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chatterjee et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado principalmente pela Pfizer RDG, com apoio adicional do Instituto Nacional do Câncer (CA127264 a AA) e Departamento de Defesa dos Estados Unidos Award formação pós-doutoramento (PC094405 para KS). Ele também foi apoiado em parte por Insitutes Nacionais de Saúde concessão CA43703 P30 para uso da facilidade de radiação Recursos Core, Case Western Reserve University eo caso Comprehensive Cancer Center. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Este trabalho foi apoiado principalmente pela Pfizer RDG. As soluções de reserva foram rucaparib fornecida pela Pfizer. colegas dos autores em Clovis Oncology fornecida sugestões e orientações. Não há mais patentes, produtos em desenvolvimento ou produtos comercializados a declarar. Isto não altera a adesão dos autores para todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento, como detalhado em linha no guia para os autores.

Introdução

O câncer de próstata (PCA) é o mais freqüentemente diagnosticado tumor em homens, representando sozinho por 29% dos casos incidentes [1]. É a segunda causa mais comum de morte por câncer em homens depois do câncer de pulmão. A irradiação é uma importante modalidade de tratamento para APC, com uma resposta clínica conseguida de -85%. É utilizado principalmente para a doença na fase inicial, como um adjuvante para a cirurgia, e em combinação com quimio-terapêuticas que permitem a sua utilização em doses mais baixas, com maior eficiência e com menos efeitos citotóxicos para os tecidos normais adjacentes.

poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) é representada por uma família de proteínas que são expressas abundantemente, são localizadas principalmente no núcleo, e estão envolvidos em muitos processos celulares importantes, tais como a resposta a danos no ADN, a sua reparação, e quando o dano é grave, morte celular por apoptose ou necrose [2]. A PARP-1 e -2 são conhecidos por terem um papel em vários mecanismos de reparação do ADN, tais como a base de reparação da excisão, a recombinação homóloga (RH) [3], e não homóloga-extremidade de união (NHEJ) [4]. Após a detecção de danos no DNA, com a ajuda do seu domínio de ligação de ADN, a PARP-1 activada desencadeia ribosilação de poli-ADP de histonas e PARP-1 em si. Importante, PARP-1 garante regulação da progressão forquilha de replicação do DNA por HR em DNA danificado [5]. A PARP-1 está envolvido principalmente na reparação de quebras de cadeia simples, o qual, se não reparados são convertidos em quebras de cadeia dupla (DSB) de ADN durante a replicação. Os inibidores de PARP (PARPi) representam uma nova classe de agentes que impedem a síntese de poli-ADP ribose por colidir com os processos de reparação de ADN a jusante, e como resultado o dano do ADN persiste [2]. PARPi, portanto, pode atuar como um agente único em tumores HR-deficiente (por exemplo BRCA1 /2-defeituoso) através de “

letalidade sintética

” [6]. Desactivar NHEJ em células deficientes em RH através da inibição de ADN-PKcs pode reverter o efeito de letalidade mediada PARPi [7]. A radiação induz a actividade da PARP e a sua inibição aumenta a morte celular e melhora o retardamento do crescimento tumoral em modelos irradiados com cancro do pulmão [8]. Níveis de PARP-1 são também aumentou em avançado, castrar resistentes CaP [9], [10], portanto, a sua utilização em combinação com radiação para melhorar a radioterapia é atraente.

O “

letalidade sintética

“conceito tem sido eficaz em células de mamífero em modelos de tumor com o BRCA1 ou BRCA2 defeituoso, o que, como uma consequência têm RH defeituoso [3] e são assim passíveis de utilização de PARPi como uma monoterapia [11]. No entanto, para os tumores onde tais mutações são raras, tais como APC, há uma necessidade urgente de identificar danos ao DNA e reparação de defeitos adicionais que podem fornecer um “

letal

sintético” combinação com PARPi. Assim, estendendo-se o uso de PARPi além tumores com BRCA1 defeituoso /2 é de grande interesse.

Na fase tardia APC, eliminação bi-alélicas do

PTEN

gene (fosfatase e homólogo angiotensina) é uma ocorrência comum que tem sido sugerido para impactar a reparação do ADN de RH. PTEN antagoniza a via de sobrevivência de PI3K /AKT pela sua actividade 3-fosfatase fosfolípido, que, por sua vez, regula a proliferação, a migração e a apoptose. perda completa da

PTEN

também estimula uma forte resposta de senescência, que atua como um mecanismo adicional para a supressão de tumor. A senescência foi proposto para funcionar como um mecanismo anti-tumor, em resposta ao dano no DNA, induzindo uma paragem do crescimento irreversível e restringindo o tempo de vida replicativo de células [12]. Semelhante a células de tumor BRCA1 /2-defeituosos,

PTEN

células CaP -null têm sido relatados para ser sensível à PARPi.

Neste estudo, foi examinada a resposta a um potente inibidor de PARP, rucaparib sozinho ou em combinação com radiação de um painel de linhas de células APC. Nossos dados confirmam a eficácia da rucaparib como um PARPi potente para radiossensibilizadora células APC, de forma mais eficaz quando usado em doses baixas taxas em células que abrigam o

TMPRSS2-ERG

gene de fusão ou são

PTEN

-deficient

Materiais e Métodos

Cultura de células

CaP humano linhas celulares PC3, LNCaP, DU145 e VCaP foram obtidas de ATCC (Manassas, VA).; C4-2 foi descrito anteriormente [13]. As células foram cultivadas em meio RPMI-1640, excepto DU145 (DMEM) e VCaP (DMEM modificado) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (Atlanta Biologicals), L-glutamina (Invitrogen), e 100 unidades /ml de penicilina-estreptomicina (Invitrogen) numa incubadora humidificada a 37 ° C e 5% de CO

2. As soluções de reserva de rucaparib, fornecida pela Pfizer, foram feitas em DMSO (Sigma Aldrich).

Para a transfecção, as células foram semeadas a ~ 80% de confluência num meio isento de antibiótico.

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fusão III (o mais comum) isoforma [14] generosamente fornecida pelo Dr. Michael Ittmann foi transfectadas utilizando Lipofectamine 2000, seguido de selecção para resistência à neomicina com 1 mg /ml de G418 (Invitrogen). A eficiência de transfecção foi verificada por Western blot (Fig. S1A).

tratamento de radiação

A radiação ionizante foi entregue usando um convencional césio-137 χ-irradiador (JL pastor Associates, San Fernando, CA), a uma taxa de dose de 146 cGy /min, [15]. experiências de dose-alíquota foram realizada através da alteração da posição das placas ou com o uso de um atenuador. Uma fonte de Ir-192 da radiação, que emite partículas beta, empregou um irradiador de células fabricadas sob medida, com o design do dispositivo como descrito [16].

Os ensaios para Formação de Colónias e senescência

para o ensaio de formação de colónia, 500 células /60 mm de prato (ou 750 células /60 mm de prato de LNCaP) foram plaqueadas no dia antes do tratamento. Rucaparib foi administrado nas doses indicadas de forma contínua. Duas semanas após o tratamento com radiação e /ou rucaparib, as células foram coradas com 0,1% de violeta de cristal, e as colónias celulares com 50 células foram pontuadas por um analisador de imagem alfa (Alpha Innotech Corp). O ensaio de senescência foi realizada como descrito [17]. Depois de seis ou doze dias, as células foram fixadas e a percentagem de células β-galactosidase-positivas foi determinada por contagem ≥five campos diferentes (~ 70 células /amostra).

Imunofluorescência

Células eram plaqueadas em lamelas de cobertura em pratos de cultura de 35 mm. Após o tratamento, as células foram fixadas com 2,0% de paraformaldeído durante 20 min à temperatura ambiente, lavadas 3 × durante 5 minutos com solução salina tamponada com fosfato (PBS), permeabilizadas com 0,2% de Triton X-100 em PBS durante 10 min, e bloqueado em 3 % de FBS em PBS contendo 0,1% de Triton X-100 durante 1 h. As lamelas foram então imunocoradas utilizando os anticorpos contra χ-H2AX (Millipore), 53BP1 (Abcam), ou Rad51 (Santa Cruz Biotechnology), seguido por um anticorpo secundário conjugado com fluorescência (Invitrogen), tal como descrito [17]. A quantificação foi baseada em dados obtidos com a ≥70 células.

Análises Estatísticas

Para a análise de sinergia, as células foram tratadas com irradiação rucaparib e, isoladamente ou em combinações em uma proporção igualando a proporção da sua mediana -Efeito doses, com cada dose em cada experiência plaqueadas em triplicado e cada experiência realizada três vezes. A interacção entre os dois tratamentos em ensaios de sobrevivência celular e senescência clonogénicas foi então determinada com base no método isobolographic de Chou e Talalay, como descrito anteriormente [18], [19]. Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando ANOVA de duas vias e a significância estatística atribuída a p . 0,05

Análises de Western Blot

As células foram lisadas e submetidas a immunoblotting, como descrito [17], [ ,,,0],20] e sondados com anticorpos contra o marcador V5 (Thermo Scientific), para detectar o

TMPRSS2-ERG

gene de fusão III e β-actina (Sigma Aldrich) como um controlo de carga.

resultados

maior sensibilidade da ACP celular Lines à radiação quando combinado com Rucaparib

a radiação ionizante e agentes que danificam o DNA induz significativamente PARP-1 e níveis de PARP são mais elevados em tumores [9], [10 ], por conseguinte, PARPi poderia ser utilizada para sensibilizar a quimio-danificam o ADN ou a radioterapia. O sucesso clínico de PARPi em uma coorte de pacientes [21], que incluiu alguns com CaP solicitado o nosso interesse em explorar o potencial de uso rucaparib (CO-338; anteriormente conhecido como AG014699 e PF-01367338) como radiossensibilizador. Rucaparib, o primeiro PARPi que foi desenvolvido [22], [23], e é actualmente testado em ensaios clínicos não tem sido utilizado para –previously células APC. Examinando o seu efeito a longo prazo sobre a sobrevivência da célula indicou uma resposta à dose para a radiação e rucaparib para células CaP diferentes (Fig. 1a). VCaP e LNCaP (concentração rucaparib: 0,25, 0,5, e 0,75 uM) mostrou sensibilidade máxima no sentido rucaparib, seguido por PC3 e células C4-2. Em combinação com 1,5 Gy χ-irradiação, as células LNCaP expostas a maior sensibilidade para valores tão baixos como 0,75 uM de rucaparib (Fig. 1B). cálculos de sinergia por análise de isobolograma (ver Materiais e Métodos) foram realizadas para as quatro doses de radiação, variando de 1-5 Gy em associação com rucaparib (intervalo de concentração de 0,6-3,12 M). Para PC3, uma concentração de rucaparib tão baixa como 1,25 ^ M mostrou uma diminuição significativa no número de colónias com um efeito de radiossensibilização potente. células DU145 foram as menos sensíveis às radiações e rucaparib, sozinho e em combinação, com um efeito limitado obtido apenas com as doses mais altas. VCaP células, no entanto, ao mesmo tempo que mostraram uma resposta semelhante à radiação como DU145, para a combinação com rucaparib exibiu uma interacção sinérgica (Fig. 1B e a Fig. S2A). O índice de combinação revelaram a sinergia mais forte (IC 0,2) em células LNCaP após a combinação de radiação e rucaparib, com doses de radiação tão baixas como 0,5 Gy e 0,25 uM de rucaparib sendo eficaz. células PC3 exibiu uma sinergia moderada (IC = 0,7) após radiação 4 Gy e 2,5 uM de rucaparib, enquanto que as células C4-2 mostrou um efeito aditivo (IC = 0,9) (Fig. 1B e a Fig. S2).

a, radiação e resposta à dose rucaparib em células PC3, C4-2, DU145, VCaP e LNCaP foi estabelecida por ensaios de sobrevivência de células clonogénicas. painéis da esquerda indicam a resposta à radiação, os da direita para rucaparib. B, efeito sinérgico da combinação de radiação e rucaparib sobre a sobrevivência clonogénica em LNCaP, PC3, C4-2, e células VCaP, onde CI 1 representa sinergia e CI 1 uma interacção antagónica entre os dois tratamentos. As barras de erro representam SD da média (n = 3).

Rucaparib e Radiação induzindo a senescência em PTEN com deficiência e TMPRSS2-ERG Fusion-expressando células

A senescência é conhecido por representar uma resposta importante tanto a radiação e PARPi que os impactos sobre a proliferação celular e sobrevivência clonogénica em última análise. As células tratadas mostraram marcadores característicos de senescência após seis dias. Estes morfologia celular achatada incluídos com a acumulação de células SA-β-galactosidase-positivas (Fig. S3A).

PTEN

PC3 nula, LNCaP, e linhas de células C4-2 mostrou um aumento dependente da dose de radiação e PARPi em células-SA-β-galactosidase positiva com o tratamento quer com radiação ou rucaparib (Fig. 2A e 2B) . LNCaP teve o maior número de células senescentes seguindo um agente único ou do tratamento de combinação. Em contraste, as células DU145 que têm um tipo selvagem

PTEN

alelo mostrou quase sem células senescentes, mesmo em altas doses utilizadas. O índice de combinação para a coloração senescência SA-β-galactosidase indicado uma sinergia de moderada forte (CI = 0,5-0,7) em PC3, células LNCaP, células e C4-2 (Fig. 2C e Fig. S2). As características senescência foram sustentados até, pelo menos, doze dias, com um ligeiro aumento do número de células-β-galactosidase positiva (Fig. 2D e Fig. S3B). Estes dados indicam que a senescência contribui para a diminuição da sobrevivência de

células -deficient PTEN Comprar e que o grau de senescência correlaciona-se com a sobrevivência clonogênica.

percentagem de células positivas galactosidase β- foi determinada depois da radiação (A ) e rucaparib (B), o tratamento em

PTEN

-deficient LNCaP, C4-2 e células PC3. A percentagem de células β-galactosidase-positivas foi determinada pela contagem de campos diferentes ≥five (~ 70 células /amostra). C, Synergy análises para senescência em LNCaP, PC3, e as células C4-2 para o tratamento de combinação. Veja-se Figs. S2 e 3 para a coloração β-galactosidase e sinergia análises adicionais. D, percentagem de células positivas C4-2 β-galactosidase foi determinada após 12 dias de tratamento com radiação ± rucaparib. E, parental e

TMPRSS2-ERG

fusão de genes que expressam as células PC3 foram quantificados por coloração de SA-β-galactosidase após 6 dias após a 4 Gy, 2,5 uM rucaparib, e os inibidores de ADN-PKcs NU7441 (500 nM ), isoladamente ou em combinação. As barras de erro representam SD da média (n = 3).

células VCaP, que abrigam células senescentes o

TMPRSS2-ERG

gene de fusão, adquirido na sequência de radiação e PARPi (Fig. S4 ). No entanto, estas células são dependentes do gene de fusão, portanto, examinando a senescência seguinte knock-down de

TMPRSS2-ERG

não foi informativo. Por isso, usamos células PC3 que expressam a mesma isoforma,

TMPRSS2-ERG fusion III Compra de novas experiências senescência. células PC3 que expressam

TMPRSS2-ERG

teve um aumento do número de células-SA-β-galactosidase positiva depois da radiação (Fig. S4). O efeito de

TMPRSS2-ERG

expressão foi comparável ao que foi obtido em células PC3 irradiados na presença dos inibidores de DNA-PKcs NU7441 (p = 0,0002), enquanto NU7441 sozinha não induziu a senescência, quer na linha de células . Rucaparib tratamento em combinação com a radiação de forma significativa (p 0,0001) aumentou o número de células senescentes em

TMPRSS2-ERG

-expressing células PC3, que por sua vez correlacionados com células PC3 tratadas com radiação, rucaparib, e NU7441, (p = 0,0009) (Fig. 2E). NU7441 tratamento não induzir a senescência em células PC3 expressando o

TMPRSS2-ERG

fusão depois da radiação, por si só ou em combinação com rucaparib. Estes dados indicam que a actividade de ADN-PKcs é crítica para a senescência, como indicado pelo aumento do número de células senescentes em

TMPRSS2-ERG

-expressing células ou quando a DNA-PKcs é inibida.

Rucaparib aumenta a persistência de danos no DNA induzidos por radiação Focos

a seguir, analisou se a eficácia dos tratamentos foi relacionada à sua capacidade de induzir a danos no DNA. χH2AX e p53BP1 são estabelecidos substitutos para medir a radiação ionizante focos induzida (IRIF) [24]. A irradiação gerado um aumento do número de focos χH2AX às 3 e 6 h, que foram significativamente diminuídas por 24 h, indicativos da reparação do dano do ADN (Fig. 3A). Em contraste, quando as células foram irradiadas na presença de rucaparib, χH2AX focos persistiu a 24 h. Além disso, os focos para p53BP1, outro marcador estabelecido para LAP, eram mais proeminentes em 24 h após a irradiação, com o tratamento combinado com rucaparib resultando num aumento do número de focos (Fig. 3B). Rad51 é um componente chave de RH; sua expressão não foi afetada pela

PTEN

status, de acordo com um relatório recente [25]. No entanto, a combinação de radiação e rucaparib mostrou focos Rad51 persistente às 24 h (Fig. 3C), indicando que a combinação é mais eficaz na infligindo danos no ADN persistente nas células tratadas.

χH2AX (A) e 53BP1 (B) focos foram determinados por microscopia de immunofluoresecence às 24 h após o tratamento combinado com radiação e rucaparib em PC3 e células LNCaP (painel esquerdo), com uma cinética dependente do tempo indicados (painel direito). C, focos Rad51 foram visualizados e quantificados nas células PC3 de forma semelhante depois de 24 h de tratamento. As barras de erro representam SD da média (n = 3).

LDR leva a danos DNA Aumento e Redução da célula de sobrevivência

A radiação é administrada na clínica quer como radioterapia externa (RT ) ou braquiterapia. Radiação para o tratamento de CaP por braquiterapia geralmente utiliza a dose taxas de 70 cGy /h, em comparação com 200-300 cGy /min, que são comumente usados ​​para radioterapia para

in vitro

estudos de radiação de linhas celulares de cancro humano com irradiadores convencionais. Para investigar a eficácia de baixas doses-taxas, as células C4-2 e PC3 foram expostos à dose taxas de 56 a 690 cGy /min, para conseguir uma dose total de 5Gy. O maior tempo de exposição directamente correlacionado com o dano ao DNA mais extenso, resultando em menos colónias (Fig. 4A) e mais χH2AX e focos 53BP1 (Fig. 5A e 6A). A taxa de dose mais baixa (56 cGy /minuto) aumentou o número de focos χH2AX significativamente (p 0,0002) em comparação com a taxa de dose convencional (146 cGy /min). danos no DNA induzidos tal como medido por um aumento do número de focos χH2AX (Fig 5B.); adição de rucaparib significativamente (p 0,0001) Aumento do número de focos p53BP1 seguintes do tratamento de combinação (Figura 6B.). A taxa mais baixa dose de radiação (56 cGy /min) induziu significativamente mais 53BP1 IRIF (p = 0,004 0,0007 para C4-2 e PC3 células, respectivamente) em comparação com a taxa de dose mais elevada (690 cGy /min)

a, foram realizados ensaios de sobrevivência clonogénicos por PC3 (painel da esquerda) e células C4-2 (painel direito) em doses diferentes taxas-± 1,25 uM rucaparib. B, células C4-2 foram expostas a diferentes taxas de dose de radiação de uma fonte de IV-192 ± 2,5 uM rucaparib. Uma dose total de radiação de 5 Gy (painel da esquerda) e 10 Gy (painel da direita) foi entregue; Por conseguinte, o tempo de exposição diferente para as diferentes doses utilizadas-taxas. As barras de erro representam SD da média (n = 3).

A, confocal imunocoloração para χH2AX focos, enumarated no PC3 e células C4-2 seguintes radiação nas doses indicadas. B, A quantificação da formação dependente da dose de focos γH2AX. As barras de erro representam SD da média (n = 3).

A, confocal imunocoloração de focos 53BP1 no PC3 e células C4-2 seguintes radiação nas doses indicadas. B, a representação gráfica de geração 53BP1 IRIF dependente da dose. As barras de erro representam DP da média (n = 3).

Foram realizadas experiências semelhantes com uma fonte de radiação LR-192 (dose total fixada de 5 e 10 Gy) ± rucaparib. As células que receberam a mais baixa taxa de dose (4,34 cGy /h), entregues ao longo do período de tempo mais longo, formado menos colónias em comparação com aqueles expostos a doses moderadas a elevadas (26,8 cGy /h) da radiação (Fig. 4B). Rucaparib muito reduzida formação de colónias, mesmo na dose mais elevada LDR testado (26,8 cGy /h), o que exigiu ~18 h para alcançar 5 Gy.

PARP Inibição Radiosensitizes TMPRSS2-ERG fusão de genes que expressam as células a um nível semelhante a DNA-PKcs inibição em células parentais

a fusão entre a

TMPRSS2

, um oncogene regulada por androgénio, e um gene regulado pelo estrogênio fator de transcrição ETS, ERG gerada por uma deleção intersticial do cromossomo 21 ou por translocação recíproca está presente em ~ 50% de CaP fase inicial [26]. As células que expressam VCaP

TMPRSS2-ERG

endogenamente foram radiosensitized por rucaparib (Fig. 1B e Fig. S2A). Estas células são dependentes

TMPRSS2-ERG

como eles param de proliferar quando ela está esgotada por siARN (dados não mostrados). Portanto, as células PC3 foram transfectadas com o

TMPRSS2-ERG

isoforma fusão III, o gene de fusão mais comum CaP. Sua expressão estável não teve um efeito significativo sobre a radiossensibilidade, estimada por ensaios de sobrevivência clonog�icas (Fig. S1B) e pela χH2AX e 53BP1 focos. No entanto, quando foi administrada juntamente com rucaparib, o número de colónias foi reduzido de forma significativa (p = 0,0105) (Fig. 7B). Este efeito foi comparável ao que foi obtido em células PC3 tratadas com o inibidor NU7441 DNA-PKcs. A combinação rucaparib radiosensitized ainda mais essas células (p = 0,0005), numa extensão comparável a células que expressam o

TMPRSS2-ERG

gene de fusão tratado com rucaparib (Fig. 7A). Um aumento do número de 53BP1 e χH2AX focos eram visíveis mesmo com a dose menor, ainda demonstrando que rucaparib é um radiossensibilizador potente para células CaP que abrigam um gene de fusão (Fig. 7C).

A, ensaio de sobrevivência clonogênica em células PC3 seguintes 4 Gy de radiação ± 2,5 uM rucaparib e o DNA-PKcs inibidor NU7441 (500 nM; painel esquerdo). B, ensaios de sobrevivência clonogénicos em células PC3 e derivados que expressam TMPRSS2-ERG fusão III em diferentes doses-taxas ± 2,5 uM rucaparib. C, imunocoloração para χH2AX e 53BP1 em células PC3 que expressam o gene de fusão depois da radiação ± rucaparib tratamento durante 24 h. As barras de erro representam SD da média (n = 3)

Discussão

Rucaparib (CO-338; anteriormente conhecido como AG014699 e PF-01367338)., uma PARPi representa uma nova classe de agentes com actividade anti-tumor documentada contra linhas de células humanas e xenoenxertos contendo mutado ou silenciados epigeneticamente BRCA1 /2 [4], [27]. Trabalho anterior demonstrou que a PARP-1 interage com TRMPRSS2-ERG, proporcionando assim uma base lógica para o mecanismo da utilização de PARPi no gene de fusão ETS-positivo CaP [3]. Aqui mostramos pela primeira vez, a sua eficácia como um sensibilizador à radiação de um painel de linhas celulares de APC, com sinergia máxima conseguida com taxa de dose baixa (LDR), em vez de dose de radiação convencional. As doses LDR usadas aqui imitar aqueles empregados na prática clínica para CaP brachythrepay [28]. Acreditamos que este achado é importante, pois a braquiterapia é mais eficaz do que a radioterapia para o tratamento APC, e pode empregar mecanismos moleculares que promovem a radiossensibilidade de células de câncer avançado, em nosso estudo através de senescência reforçada. Com efeito, a inibição química da PARP-1 induziu actividade de radiossensibilização acentuada de vários crescimento exponencial linhas de células de tumor no intervalo de dose de 5-30 cGy. LDR radiossensibilização de dividir activamente células tumorais por PARPi sugere que eles podem ter um papel no aumento da eficácia de regimes de ultra-fraccionados ou LDR [29]. Os nossos estudos indicam que é uma rucaparib PARPi muito potente que sinergiza com doses clínicas de radiação alcançado durante braquiterapia. Seu uso como um rediosensitizer é eficaz mesmo quando a dose de radiação é muito reduzida, a situação encontrada como os radioactivas “sementes” deterioração durante o extenso tempo eles são usados ​​em pacientes APC.

Rucaparib, o primeiro PARPi que era desenvolvido e testado em a clínica (em 2003 sob o nome AG014699) [22], [23], tem sido também mostrado ser eficazes em xenoenxertos de tumor de mama, pulmão, cólon, colo-rectal e cancro pancreático [27], [30 ]. Ao mesmo tempo, tem sido demonstrado ser não tóxica em ratinhos que transportavam pelo menos uma cópia funcional do gene BRCA2. Nosso estudo é o primeiro realizado para rucaparib em CaP. Embora não tenhamos realizado estudos de xenoenxerto semelhantes, com base nos relatórios acima com diversos tipos de tumores, todas as indicações são de que estes resultados seriam traduzidas a modelos de xenotransplante CaP.

Rucaparib foi examinado em combinação com vários agentes quimioterapêuticos. Verificou-se ser eficaz em combinação com a platina no peito e modelos de xenoenxerto de cancro do ovário [27], [31]. Nosso estudo é o primeiro a examinar a sua eficácia em combinação com radioterapia. Outros PARPi, em combinação com a irradiação, foram relatados para causar atraso no crescimento tumoral significativa no cancro do pulmão

in vivo

modelos [8], e para ser radiosensitizers eficazes em ambos os pulmões e células CaP linhas [32]. A sensibilização à radiação e agentes alquilantes foi melhorada em células de DSB de reparação deficiente em [33], de acordo com a sensibilidade notável para a inibição de PARP de BRCA-1 e BRCA-células tumorais 2 deficiente em [6]. O ABT-888 (veliparib) PARPi foi recentemente mostrado para aumentar a resposta de células de tumores APC e a irradiação de células DU145 e PC3 [34]. Combinando ABT-888 com 6 Gy resultou no novo crescimento tumoral retardado em comparação com qualquer dos agentes por si só apenas em tumores de xenoenxertos PC3, enquanto que os tumores continuaram a crescer DU145. Semelhante aos nossos estudos, PC3 mas as células não DU145 e tumores foram mostrados para conter células senescentes abundantes exibindo persistente danos no DNA focos [34]. Mostramos que rucaparib é eficaz no adicional

PTEN

células -deficient incluindo aqueles que abrigam fusões de genes ETS. Claramente, a eficácia de PARPi pode depender de uma resposta senescência competente a danos no ADN acumulados, tal como quando

PTEN

é deficiente ou quando o

TMPRSS2-ERG

é expresso. Um estudo recente descobriu que rucaparib radiozensitization pode ser dependente também NF-kB [35]. Neste estudo mostramos que

TMPRSS2-ERG

, além de

deficiência de PTEN

, pode sensibilizar para PARPi, que estabeleça sinergias com a radioterapia

Uma vez que as mutações em BRCA1 /2.

que fornecem um “

letalidade sintética

” relacionamento com PARPi são raros na APC, há um interesse considerável na definição de outros marcadores moleculares para a sensibilidade PARPi. Com efeito, a sensibilização a PARPi foi recentemente demonstrado que ser aumentada, bloqueando a sinalização de danos de ADN, através de ATM /Chk2 [36], [37] e o complexo MRN através Mre11 [38]. Em contraste, bloqueando NHEJ de ADN reparar através p53BP1 [39], pode, de facto, contrapor a sensibilidade excelentes para PARPi causada por deficiência de BRCA1 [40]. Por outro lado, a expressão de p53 em nosso painel de célula APC e um relatório recente [39] não fazer a diferença tanto como nula p53 (PC3) ou proficientes p53 (LNCaP, C4-2) células responderam bem ao PARPi como um radiossensibilizador. A resposta foi bastante dependente principalmente em uma resposta senescentes competente, que estava ausente em células DU145 que têm um funcional

PTEN

alelo e, um supressor de tumor retinoblastoma truncada não-funcional [41].

ETS fusões de genes encontram-se na maioria dos casos de CaP [26]. A expressão do gene de fusão é responsável pela proliferação de células em células que expressam o CaP

TMPRSS2-ERG

[42]. próstatas de rato desprovidas de

PTEN

visualização melhorada génese do tumor na presença de ERG overexpressed [43]. Um relatório recente mostrou que a expressão do gene de fusão altera quimio-sensibilidade radioterapia e quando a radiação de raios-X é administrado em combinação com paclitaxel [44]. Semelhante a deficiência de BRCA1 /2, inibidores de PARP-1 aumentar a extensão do dano no DNA promovida inicialmente por sobre-expressão de genes de fusão [3]. Portanto, as células tumorais da próstata abrigando fusões ETS, tais como

TMPRSS2-ERG

são mais propensas a resposta robusta para PARPi, sozinho em combinação com LDR. Outro estudo, no entanto, descobriu que

PTEN

eliminação em células APC, pode não necessariamente associar-se com a perda da função RAD51 [25], com sensibilidade para a PARPi diferente sendo associado ao invés com um defeito na expressão MRE11. Descobrimos que a inibição de ADN-PKcs por

TMPRSS2-ERG (dados não mostrados)

tem um papel crítico para a activação senescência. Notavelmente, a DNA-PKcs expressão foi recentemente mostrado para prever a resposta a radioterapia em CaP [45].

Em adição ao seu papel na reparação de danos no ADN e, um papel de transcrição foi também atribuído a PARP-1 [3], indicando mais recentemente que é necessário para a função do receptor de androgénio, em particular em modelos resistente à castração de CaP [46].