Abstract

Fundo

A metástase é a causa mais freqüente de falha do tratamento e morte em câncer colorretal. A detecção precoce de tumores e metástases é crucial para melhorar as estratégias de tratamento e evolução de pacientes. Desenvolvimento de biomarcadores confiáveis ​​e simples testes de rotina aplicáveis ​​na clínica para a detecção, prognóstico e monitorização terapêutica é de especial interesse. Recentemente, identificou o novo gene Metástase-Associated em Colon Cancer 1 (MACC1), um regulador chave do HGF /Met-via. MACC1 é um forte biomarcador de prognóstico para a metástase do câncer de cólon e permite a identificação de indivíduos de alto risco em estágios iniciais, quando determinado em tumores primários dos pacientes. Para superar a limitação de um número restrito de análises moleculares no tecido tumoral, o estabelecimento de um exame de sangue não-invasivo para a identificação precoce de pacientes com câncer de alto risco, para o curso da doença monitoramento e resposta terapêutica é fortemente necessário.

Metodologia /principais conclusões

Pela primeira vez, nós descrevemos um ensaio, não invasivo para a quantificação de circulação de transcrições MACC1 no sangue de mais de 300 pacientes com câncer colorretal. níveis MACC1 transcritos aumentam em todas as fases da doença dos pacientes com câncer em comparação com voluntários livres de tumor. níveis mais elevados MACC1 foram determinados em indivíduos com metástases (todos com P 0,05). Importante, os níveis elevados MACC1 correlacionar com a sobrevivência desfavorável (P 0,0001). Combinando MACC1 com circulam transcritos do gene metástase S100A4, um alvo da transcrição do /β-catenina-via Wnt, melhora a previsão de sobrevida para pacientes com câncer recém-diagnosticados.

Conclusão /Significado

Este sangue ensaio baseado para fazer circular transcrições MACC1, que pode ser quantificada de forma rotineira, aplicabilidade clínica para o diagnóstico, prognóstico e acompanhamento terapêutico de pacientes com câncer. Aqui demonstramos o valor diagnóstico e prognóstico de circulação de transcritos MACC1 no plasma do paciente para a metástase e sobrevivência. Desde MACC1 representa um alvo promissor para terapias anti-metastáticos, circulando transcrições MACC1 pode vir a ser um ideal leia-out para monitorar a resposta terapêutica de futuras intervenções dirigidas metástases induzida MACC1 em pacientes com câncer

Citation:. Stein U , Burock S, P Herrmann, Wendler I, Niederstrasser H, Wernecke KD, et ai. (2012) Circulação Transcrições MACC1 em Colorectal Cancer Patient Plasma Predict Metástase e prognóstico. PLoS ONE 7 (11): e49249. doi: 10.1371 /journal.pone.0049249

editor: Hassan Brim, Howard University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de maio de 2012; Aceito: 04 de outubro de 2012; Publicação: 14 de novembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Stein et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Esses autores não têm apoio ou financiamento para relatar

CONFLITO dE iNTERESSES:. EUA e PMS são detentores de patentes relativas MACC1 (anteriormente 7a5 /prognostin) determinação em tumores primários. Stein U, Schwabe H, Walther W, Schlag PM. Verwendung des neu-identifizierten Gens 7a5 /Prognostin (MACC1) für Tumordiagnostik und Tumortherapie. 7a5 /Prognostin e à sua utilização para o diagnóstico e terapia de tumores. JP2006-519895 patente: 13.5.2011. AU patente 2004259281: 12.5.2011. A Patente US 7851168 B2: 14.12.2010. O pedido de patente CA 2526240: 2004. EP pedido de patente 008053: 2004. O pedido de patente DE 10.332.854,8: 2003. EUA, pH, SB, e PMS são titulares de um pedido de patente para o uso de metástase transcrições progressor S100A4 em fluidos corporais de colo-retal e gástrica pacientes com câncer. Stein L, P Herrmann, Burock S, Schlag PM. Uso de metástase transcrições progressor S100A4 em fluidos corporais de pacientes com câncer colorretal e gástricas. pedido 19.3.2010 Patente US 61 /261.017:: PCT /EP2010 /001891 pedido de patente 13.11.2009. Os autores confirmam que isso não altera a sua adesão a todas as políticas de PLoS One sobre os dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

A metástase é a causa mais freqüente de falha do tratamento e morte em câncer colorretal. A detecção precoce de tumores e metástases é crucial para melhorar as estratégias de tratamento e evolução de pacientes. Desenvolvimento de biomarcadores confiáveis ​​e simples testes que são rotineiramente aplicável na clínica para a detecção, prognóstico e monitorização terapêutica é de especial interesse.

Recentemente, identificou o novo gene Metástase-Associated em Colon Cancer 1 (MACC1) [ ,,,0],1] – [3]. MACC1 é um novo biomarcador de prognóstico para a metástase do câncer de cólon e livre de metástases sobrevivência quando determinado em tumores primários dos pacientes. níveis MACC1 nos tumores primários foram encontrados para ser significativamente maior em cancros que metachronously desenvolvidos metástases à distância em comparação com aqueles que não metástase dentro de um 12-year follow-up. O valor preditivo do biomarcador sobre se um tumor metastizar ou não era de 74% e 80%, respectivamente. A taxa de 5 anos de sobrevivência foi de 80% para pacientes com baixa MACC1, em comparação com 15% para os pacientes com expressão alta MACC1 em seus tumores primários. MACC1 é um preditor para colorectal independente metástase do câncer de estágio do tumor, idade, sexo, infiltração tumoral, estado nodal e invasão de vasos linfáticos, e, portanto, permite a identificação das pessoas em alto risco de metástase nos estágios iniciais [1]. Isso faz com que MACC1 um importante gene de prognóstico na prática clínica. Além disso, verificou-se que MACC1 actua um regulador chave do HGF (factor de crescimento de hepatócitos) /Met-via, que é crucial no cancro colorrectal para a progressão do tumor e formação de metástases [1], [2], [4].

Vários grupos confirmaram entretanto uma correlação de expressão elevada MACC1 no tumor a progressão, metástase, sobrevivência, resposta e terapia no cancro colo-rectal (CRC) [5] – [9]. O papel da MACC1 como um biomarcador para progressão e sobrevivência de câncer foi, entretanto, também relatado para outros cancros sólidos, tais como gástrica [10], pulmão [11], [12], hepatocelular [13], [14] e do ovário [15 ].

analisa

Molecular no tecido tumoral, por exemplo, necessários para o prognóstico da doença no contexto da formação de metástases e sobrevivência, estão limitados a um número limitado de amostras de tecido disponíveis. Para superar essa limitação, o estabelecimento de um teste de sangue à base de MACC1 não-invasivo para a identificação precoce de pacientes com câncer de alto risco e para o acompanhamento da evolução da doença, bem como da resposta terapêutica é, portanto, fortemente necessário.

Aqui , pela primeira vez, foi desenvolvido um ensaio, não invasivo para os níveis de transcritos MACC1 no plasma. Analisamos o valor diagnóstico dos níveis de MACC1 para a detecção de tumores e metástases no cólon e pacientes com câncer retal, e seu valor prognóstico para a sobrevida global (sobrevivência) desses pacientes. Além disso, avaliamos o benefício de combinar MACC1 com um outro gene metástase, S100A4, para melhorar a previsão de prognóstico da doença [16] – [18].

Materiais e Métodos

Objectivo

O MACC1 gene indutor de metástase é um forte biomarcador de prognóstico para a metástase do câncer de cólon e permite a identificação de indivíduos de alto risco em estágios iniciais, quando determinado em tumores primários dos pacientes. Para superar a limitação de um número restrito de análises moleculares no tecido tumoral, que visa o estabelecimento de um teste de sangue à base de MACC1 não-invasivo para a identificação precoce de pacientes com câncer de alto risco e para monitorar o curso da doença.

participantes

Para características cólon e reto do paciente ver Tabelas 1, 2, 3. pacientes consecutivos com câncer de cólon ou rectal que foram atendidos no Hospital do câncer Robert Rössle, Universidade Charité Medicina de Berlim, em 2006, até 2007 para internamento ou tratamento ambulatório e que deram o seu consentimento informado por escrito para participar no nosso biobanco tumor foram inscritos.

os dados dos pacientes para a caracterização histopatológica do tumor (incluindo infiltração tumoral , linfonodo status, metástase, classificação, vasos linfáticos infiltração, vasos infiltrado sanguíneo, tumor residual), para o tratamento e sobrevivência estavam disponíveis a partir do banco de tumores do Charité Comprehensive Cancer Center. estadiamento do tumor histológica foi realizada por patologia de rotina. Os critérios de exclusão foram outras doenças malignas durante a história ou acompanhamento. Foram analisadas 312 amostras de sangue de dois pontos (n = 151) e retal (n = 161) pacientes com câncer (Tabelas 1, 2, 3).

As amostras de sangue foram tiradas no dia do diagnóstico de pacientes recém-diagnosticados com um tumor primário com ou sem metástases síncronas ou de doentes que desenvolveram metástases após metachronously R0-ressecção do tumor primário. Exceção: Os pacientes com diagnóstico recente de cancro rectal localmente avançado, que receberam neoadjuvante radiação de curta duração ou radioquimioterapia longo prazo (n = 16). Aqui, as amostras de sangue foram tomadas após tratamento neoadjuvante do tumor primário. Para os pacientes que receberam radiação de curto curso, o intervalo entre o fim do tratamento e o sangue foi tomada 3 a 6 dias. Nós não encontrou níveis significativamente diferentes MACC1 transcritos entre os pacientes com câncer retal não tratados tratado (n = 16) e (n = 23).

As amostras de sangue a partir da coorte de pacientes de acompanhamento foram tomadas exclusivamente durante o período de seguimento (mediana de 975 e 1280 dias após o diagnóstico primário; mediana de 807 e 853 dias de acompanhamento após sangue levando para cólon e do cancro retal, respectivamente)

os controles de plasma derivadas de duas coortes independentes. de voluntários (n = 54). Recrutamento dos voluntários foi apoiada por Klaus Sperber, Medical Practioner, Berlim, e por Ursula Plöckinger, Charité Campus Virchow Klinikum, Berlim. Todos os voluntários devem ser e sem histórico de doenças oncológicas livre de tumor. Nós não encontrou níveis significativamente diferentes MACC1 com relação a sexo, idade, ou entre os dois grupos.

Recém-diagnosticados doentes com cancro colorectal com um tumor primário com ou sem metástases síncronas foram agrupados devido à sua análise cronológica numa (n = 36) set-teste e um set-validação (n = 35) para a determinação do valor diagnóstico da circulação transcrições MACC1 (Tabela 4).

Preparação Plasma

Em primeiro lugar, nós examinamos as condições ideais para obtenção de sangue, armazenamento e separação do plasma. Após obtenção de sangue de voluntários saudáveis ​​(n = 12), EDTA-sangue foi mantido à temperatura ambiente ou a 4 ° C. separação do plasma foi feito ou imediatamente, ou 7, 24, 48, e 72 horas depois de tomar sangue (10 análises por voluntário). O ARN foi isolado e quantitativo em tempo real, específico MACC1-RT-PCR foi realizado em duplicado (Fig. 1A). níveis de transcrição MACC1 serviu como ler-out. Nós não encontrou alterações dos níveis MACC1 quando a separação do plasma foi realizada durante as primeiras 24 horas (quer refrigerados ou mantidos à temperatura ambiente). Com base nestes resultados, o plasma foi separado de EDTA-sangue arrefecido ao mesmo dia dentro de 7 horas após a recolha de sangue. Processo para a separação de plasma foi como previamente descrito [18]. amostras cegos, nem cólon nem câncer retal, nem doença em estágio foi divulgado durante a análise, foram armazenadas a -80 ° C.

A. condições de separação de plasma para a determinação de circular transcrições MACC1. A separação do plasma a partir de amostras de voluntários livres de tumor (n = 12) foi feita imediatamente, 7, 24, 48, e 72 horas após a toma de sangue, quer a partir de amostras de sangue mantido a 4 ° C ou à temperatura ambiente. Subsequentemente, o plasma foi gerado dentro dos primeiros 7 horas a partir de 4 ° C-sangue arrefecido. B. MACC1 transcritos no plasma de voluntários livres de tumor (n = 54). Nenhuma diferença de níveis de transcrição MACC1 foram encontrados em duas coortes analisadas independentemente de voluntários livres de tumor (n = 34 e n = 20, respectivamente). transcrições C. MACC1 no plasma de todos os doentes com cancro colorectal (n = 312). Todos os grupos de pacientes portadores de colorectal, cólon (n = 151), ou rectal (n = 161) de câncer expressaram níveis MACC1 transcrição significativamente maiores do que os voluntários livres de tumor (

P Art 0,001 para todas as comparações).

ARN e quantitativa em tempo real de RT-PCR

Isolamento de RNA total foi realizada como previamente descrito [18]. Quantitativa em tempo real de RT-PCR foi levada a cabo a 30 seg 95 ° C, 45 × (10 seg 95 ° C, 10 seg 62 ° C, 10 s 72 ° C), ponto de fusão curva de 40 ° C a 95 ° C, por utilizando o LightCycler (kit de DNA mestre sondas de hibridação, Roche Diagnostics), como anteriormente descrito [1]. Os seguintes iniciadores e sondas foram usadas amplificar um produto de PCR específico do MACC1 136 pb: iniciador directo 5′-TTCTTTTGATTCCTCCGGTGA-3 ‘, o iniciador inverso 5′-ACTCTGATGGGCATGTGCTG-3′, com FITC-sonda 5’-GCAGACTTCCTCAAGAAATTCTGGAAGATCTA-3 ‘, LCRed640- sonda 5’-AGTGTTTCAGAACTTCTGGACATTTTAGACGA-3 ‘(sínteses de iniciadores e sondas: BioTeZ e TIB MolBiol, Berlim, Alemanha). O cDNA foi empregue calibrador em diluições em série ao mesmo tempo em cada execução, derivado a partir das linhas de células SW620. Autenticação da linha celular foi realizada por genotipagem curto repetições em cadeia (STR) (DSMZ Braunschweig, Alemanha). STR genótipo foi consistente com o genótipo publicada por esta linha de células (ATCC, CCL-227). quantitativa em tempo real, específico S100A4-RT-PCR foi realizada como previamente descrito [18]. a expressão de ARNm de uma amostra de sangue é dado como percentagem da expressão de ARNm de uma amostra de calibrador definido, o qual foi ajustado a 100%. Cada amostra foi executado em duplicado, os meios são retratados.

Ética

Todas as amostras de sangue de pacientes e voluntários livres de tumor foram obtidas com consentimento informado por escrito de acordo com a Conferência Internacional sobre Harmonização e com a aprovação do IRB local.

métodos estatísticos

as diferenças entre os grupos em termos de níveis de MACC1 transcritos no plasma foram testadas por meio de testes não-paramétrico de Wilcoxon-Mann-Whitney (depende da distribuição de normalidade): voluntários versus pacientes com tumores primários sem e com metástases síncronas, para pacientes com metástases metacrônicos livres de tumor, e pacientes para acompanhamento; pacientes com tumores versus aqueles com tumores e metástases. Em caso de pequenas amostras, maiores diferenças de tamanhos de amostra, grupos grandes, mas desequilibradas, conjuntos de dados contendo os laços, ou dados esparsos, os testes foram realizados em uma versão exata. Consideramos

P Art 0,05 a ser significativo. Todos os cálculos numéricos foram realizadas com SPSS, versão 18.

Para definir o valor diagnóstico da circulando transcrições MACC1 em plasma, sensibilidade e especificidade foram calculados com uma mesa de quatro vezes para o cancro colorectal (test- e validação-set), cólon e câncer retal pacientes, que foram diagnosticadas com um tumor primário sem ou com metástases síncronas em comparação com as amostras de sangue de 54 voluntários livres de tumor. De acordo com sua análise cronológica e pacientes sanguíneos levando iniciais foram agrupados em um test-set e validação-set. Nós começou com um teste-conjunto de pacientes com CCR recém-diagnosticados (n = 36), determinou o valor de corte ideal de MACC1 (sensibilidade 75%, especificidade de 76%), e aplicado este valor de corte para a validação do conjunto de pacientes com CCR (n = 35). A sensibilidade e a especificidade foram de 77% e 76%, respectivamente. Ao combinar todos os pacientes recém-diagnosticados CRC, sensibilidade e especificidade foram de 76%. Ao analisar cólon e pacientes com câncer retal em separado, a sensibilidade foi de 77% para câncer de cólon e 76% para câncer retal. A especificidade foi de 89% para câncer de cólon e 76% para câncer retal, respectivamente.

Para a análise de sobrevivência de recém-diagnosticados e de todos os pacientes de CRC, foram utilizadas curvas de Kaplan-Meier, em combinação com o teste de log rank. Esses pacientes com CCR foram incluídos nesta análise, onde ambos os marcadores, MACC1 e S100A4, pode ser determinado (n = 294). O valor de corte de MACC1 eo valor de corte de S100A4 foram a mediana dos grupos investigados (diagnóstico principal ou todos os pacientes), respectivamente. Os cálculos foram realizados com o programa SPSS, versão 18.

Resultados

Quantificação de circulação Transcrições MACC1 no plasma humano

condições ideais inicialmente identificados para processamento de plasma e MACC1 quantificação transcrição depois do sangue levando. A separação do plasma e análises MACC1 subsequentes foram realizados imediatamente ou 7, 24, 48, e 72 horas depois do sangue levando a partir de voluntários isentos de tumor (n = 12; alíquotas de 10 por voluntária), quer para 4 ° C-arrefecida ou deixada à temperatura ambiente ( Fig. 1A). níveis MACC1 aumento foram medidos por hemólise após 48 e 72 horas após tomar sangue. Para determinar os níveis basais de circulando transcrições MACC1 em voluntários livres de tumor e pacientes com câncer colorretal, que posteriormente separados plasma a partir de 4 ° C amostras de sangue com refrigeração dentro dos primeiros 7 horas depois de tomar sangue.

Circulação MACC1 Transcrições em plasma de voluntários livre de tumor

Foram analisados ​​os níveis basais MACC1 de voluntários livres de tumor em duas coortes independentes (n = 34 e n = 20, respectivamente; a Fig. 1B). transcrições MACC1 foram detectados em todas as amostras, sem diferenças significativas entre os dois grupos. Todos os voluntários livres de tumor foram combinados para análises posteriores (mediana 0,224 MACC1 mRNA expressão /% calibrador).

Circulação Transcrições MACC1 no Plasma Discriminate Voluntários livre de tumor e pacientes com câncer colorretal

Em seguida, analisaram os níveis MACC1 no plasma de dois pontos (n = 151) e retal (n = 161) pacientes com câncer (características dos pacientes: Tabelas 1, 2, 3). Para avaliar o valor diagnóstico da circulando transcrições MACC1 no plasma, que comparou recém-diagnosticados pacientes com CCR com um tumor primário com ou sem metástases síncronas (n = 71) com voluntários livres de tumor (n = 54) e calculadas sensibilidade e especificidade com uma quádrupla mesa. Nós começou com um teste-conjunto de pacientes recém-diagnosticados CRC (n = 36; sensibilidade 75%, especificidade de 76%), e aplicado o valor de corte ideal calculado para a validação do conjunto de pacientes com CCR recém-diagnosticados (n = 35; sensibilidade de 77%, especificidade de 76%). Quando a combinação de todos os pacientes de CRC recentemente diagnosticados, sensibilidade e a especificidade foram de 76% (Tabela 4). Ao analisar pacientes cólon e reto separadamente, as sensibilidades foram de 77% e 76%, e as especificidades foram de 89% e 76%, respectivamente. Assim, os níveis MACC1 transcritos no plasma suporta a identificação de indivíduos portadores de câncer de cólon e reto.

Detectamos transcrições MACC1 no plasma de todos os doentes com cancro. Encontramos níveis MACC1 significativamente mais elevados no cólon, rectal, e colorretais pacientes (combinado) de câncer em comparação com indivíduos livres de tumor (todos os

P Art 0,001; A Fig. 1C). Não foram observadas variações significativas de níveis MACC1 devido à idade, sexo ou entre os estágios tumorais I, II e III.

High níveis circulantes de MACC1 Transcrição em Plasma de metástase pacientes com câncer colorretal

Para avaliar a relevância de circulação de transcrições MACC1 no plasma em relação à formação de metástases, os pacientes foram classificados de acordo com o estágio da doença: os pacientes com um tumor primário sem metástase síncrono (estágios I-III; n = 51 para colorectal, n = 12 para dois pontos, e n = 39 para pacientes com câncer retal); pacientes com um tumor primário e de metástases síncrono (fase IV; n = 20 para colorrectal, n = 10 para o cólon, e n = 10 para doentes com cancro rectal); e indivíduos com metástases após metacrônica R0-ressecção do tumor primário (n = 11 para colorrectal, n = 4 para dois pontos, e n = 7 para doentes com cancro rectal) (Tabelas 1, 2, 3). Foi retirado sangue no dia do diagnóstico. Além disso, nós também incluiu pacientes de acompanhamento (n = 230 para colorectal, n = 125 para dois pontos, e n = 105 para pacientes com câncer retal; Tabelas 1, 2, 3). MACC1 níveis eram significativamente mais elevados em cada estágio da doença do cólon e cancro rectal em comparação com voluntários livres de tumor (Fig. 2A-C). Notavelmente, claramente aumento dos níveis MACC1 foram detectados em pacientes com câncer recém-diagnosticados com metástases síncronas (estágio IV), em comparação com pacientes com câncer, sem metástases à distância (estágios I-III): para colorectal (Fig. 2A), cólon (Fig. 2B), e cancro rectal (Fig. 2C), medianas 0,937, 2,249 e 0,829 expressão de mRNA MACC1 /% calibrador em pacientes metástase, em comparação com 0,61, 0,78 e 0,559 mRNA MACC1 expressão /% calibrador em pacientes sem metástases à distância (

P

= 0,006,

P

= 0,176, e

P

= 0,041 para o colo-rectal, cólon e pacientes com câncer retal, respectivamente). Assim, a determinação quantitativa de transcritos MACC1 no sangue do paciente é de valor de diagnóstico com respeito à metástase.

A, B, C. Todos colorretal (a, n = 312), dois pontos (B, n = 151), e rectal (C, n = 161) de câncer do paciente sub-coortes mostraram significativamente maiores níveis circulantes de transcrição MACC1 do que os voluntários livres de tumor (n = 54). níveis MACC1 mais elevados também foram encontrados para colorectal (

P

= 0,006; A) e rectal (

P

= 0,041; C) pacientes de câncer com metástases síncronas (n = 20 e n = 10, respectivamente) em comparação com pacientes sem metástases à distância (n = 51 e n = 39, respectivamente). análise Box enredo, baseado no quantitativo em tempo real RT-PCR.

High níveis circulantes de MACC1 Transcrição em Plasma de colorretais pacientes com câncer está associado com menor sobrevida

Em seguida, avaliou-se a impacto prognóstico da circulando transcrições MACC1 no plasma. Começamos a análise dos níveis circulantes de MACC1 com respeito à sobrevivência de pacientes de CRC recentemente diagnosticados com um tumor primário com ou sem metástases síncronas (amostras de sangue foram tomadas no dia de diagnóstico) (Fig. 3A). O valor de cut-off foi usada a mediana dos níveis MACC1 medido neste grupo de pacientes (0,670 expressão de ARNm MACC1 /% calibrador). De acordo com esse ponto de corte, os pacientes foram classificados como expressores baixas ou altas MACC1. Curiosamente, os pacientes recém-diagnosticados com baixos níveis de MACC1 ( cut-off) demonstrou um tempo significativamente maior sobrevida do que pacientes com níveis elevados de MACC1 ( cut-off) (

P

= 0,003; Fig. 3A). Assim, os níveis circulantes de transcrição MACC1 no plasma quando determinado no dia do diagnóstico, são de valor prognóstico para a sobrevivência de pacientes recém-diagnosticados.

A, B. Kaplan-Meier de análise para recém-diagnosticados (A, n = 49) e todos (B, n = 294) pacientes com CCR, com base em sozinhos MACC1 (A, baixo MACC1 n = 24, alta MACC1 n = 25; B, baixo MACC1 n = 147, alta MACC1 n = 147). pacientes recém-diagnosticados CRC (A), bem como todos os pacientes de CRC (B) com circulantes elevados níveis de transcrição MACC1 demonstraram menor sobrevida quando comparados com pacientes demonstrando níveis baixos MACC1 (

P

= 0,003 e

P

0,0001, respectivamente). C, D. Análise de Kaplan-Meier para recentemente diagnosticada (C, n = 49) e todas (D, N = 294) pacientes de CRC, com base em uma combinação de MACC1 e S100A4. pacientes recentemente diagnosticados CRC (C) e todos os pacientes de CRC (D) foram classificados em grupos de baixas expressores de ambos os genes (n = 13 e n = 85, respectivamente), de pacientes com níveis elevados S100A4 (n = 25 e n ​​= 147 , respectivamente), de pacientes com níveis elevados MACC1 (n = 25 e n ​​= 147, respectivamente), ou com elevada expressão de ambos os biomarcadores (n = 14 e n = 85, respectivamente). Para pacientes recentemente diagnosticados (C), a sobrevivência foi reduzida com o aumento dos níveis circulantes de transcritos de S100A4, de MACC1, ou de ambos. indução de expressão de qualquer MACC1 ou S100A4 ou de ambos os biomarcadores correlacionada com a sobrevida dos pacientes reduzida.

Em seguida, queríamos analisar sobre se um impacto prognóstico de transcritos MACC1 vale para a coorte de todos os pacientes de CRC, incluindo os pacientes de acompanhamento. O valor de cut-off foi usada a mediana dos níveis medidos MACC1 de todos os pacientes de CRC (0,518 expressão de ARNm MACC1 /% calibrador). Com base nesta corte, todos os pacientes com CCR foram agrupados como expressores baixas ou altas MACC1. Notavelmente, pudemos confirmar a nossa descoberta do grupo de pacientes recém-diagnosticados também para todos os pacientes de CRC analisados: pacientes com baixos níveis de MACC1 ( cut-off) mostrou um tempo de sobrevivência significativamente maior do que os pacientes com níveis elevados de MACC1 ( corte- off) (

P Art 0,0001; A Fig. 3B). Assim, os níveis circulantes de transcrições MACC1 no CRC plasma do paciente são de valor prognóstico em relação à sobrevida do paciente.

Combinação de circulação MACC1 e S100A4 Transcrição Níveis no Plasma melhora a sobrevida Previsão para pacientes com câncer colorretal

para melhorar ainda mais a previsão de sobrevivência, nós adicionamos a S100A4 gene metástase, um alvo do /β-catenina-via Wnt, com esta análise MACC1. O hotel tinha escolhido estes biomarcadores metástase para combinação, uma vez que lidar com vias de sinalização mais relevantes na progressão do câncer colorretal e metástases: MACC1 – um regulador chave do HGF /Met via de sinalização, e S100A4- um gene alvo da transcrição do /β-catenina Wnt via de sinalização. Até agora, nenhuma regulação cruzada destes dois genes associados à metástase – MACC1 e S100A4 – é conhecido

Além disso, nós relatado anteriormente o valor diagnóstico e prognóstico de transcritos S100A4 no plasma [18].. Aqui, os indivíduos com níveis plasmáticos de baixo S100A4 também mostrou uma sobrevida maior (Fig. S1A, B).

O primeiro abordou a questão sobre se a combinação de ambos os biomarcadores, transcrições de MACC1 e de S100A4 circulação, pode melhorar o valor prognóstico da MACC1 sozinho na coorte de pacientes recém-diagnosticados CRC. Os valores de corte utilizados foram a mediana dos níveis MACC1 medido neste grupo de pacientes (0,670 expressão de ARNm MACC1 /% calibrador), bem como a mediana dos níveis de S100A4 medidos neste grupo de pacientes (0,435 expressão de ARNm S100A4 /% calibrador) . De acordo com esses valores de corte, os pacientes foram classificados como de baixo expressores de ambos os genes, como altas expressores de S100A4, como altas expressores de MACC1, ou tão elevados expressores de ambos os genes. Pacientes que apresentavam baixos níveis circulantes de MACC1 e de S100A4, tiveram os tempos de sobrevivência mais longos. sobrevivência reduzida foi então observada para doentes com níveis elevados S100A4, seguido de pacientes com níveis elevados MACC1. Mais curtos tempos de sobrevivência foram encontrados para pacientes com ambos os biomarcadores altamente expressos (Fig. 3C). Assim, para os doentes recentemente diagnosticados, a combinação de níveis elevados S100A4 alta MACC1 e melhorado predição sobrevivência, em comparação com níveis elevados MACC1 sozinho.

, em seguida, avaliada MACC1 esta abordagem combinatória e S100A4 com respeito à sobrevivência de todos os pacientes de CRC , incluindo os pacientes de acompanhamento. Os valores de corte utilizados foram a mediana dos níveis MACC1 medido para todos os pacientes de CRC (0,518 expressão de ARNm MACC1 /% de calibrador), bem como a mediana dos níveis de S100A4 medido para todos os pacientes de CRC (0,421 expressão de ARNm S100A4 /% calibrador) . De acordo com esses valores de corte, todos os pacientes com CCR foram classificados como de baixo expressores de ambos os genes, como altas expressores de S100A4, como altas expressores de MACC1, ou tão elevados expressores de ambos os genes. Tal como observado para os pacientes recém-diagnosticados, também todos os pacientes com CCR, que mostraram níveis de MACC1 e de S100A4 baixo circulantes, tiveram os tempos de sobrevivência mais longos. indução de expressão de qualquer MACC1 ou S100A4 ou de ambos os biomarcadores correlacionados aos pacientes reduziu a sobrevivência (Fig. 3D).

Além disso, nós também comparou a sobrevida de pacientes com baixos níveis de MACC1 e de S100A4 ou com apenas um marcador (ou MACC1 ou S100A4) aumentou com a sobrevivência dos pacientes que mostraram tanto MACC1 e S100A4 elevados. Encontramos uma sobrevivência significativamente menor para os pacientes com altos níveis plasmáticos de ambos os biomarcadores. Isso foi observado para o grupo de pacientes recém-diagnosticados (

P Art 0,0001; Fig. S2A), bem como para todos os pacientes de CRC analisadas (

P

= 0,001; A Fig. S2B ).

Discussão

Aqui, relatamos o desenvolvimento do primeiro ensaio com base em sangue para o MACC1 gene de indução de metástases, que é um biomarcador de prognóstico para a metástase do cancro de cólon, bem como para a progressão tumoral e sobrevivência em uma variedade de cancros sólidos. Este ensaio para a circulação de transcritos MACC1, que pode ser quantificada numa base de rotina, é clinicamente aplicável para o diagnóstico, prognóstico e monitorização terapêutica de doentes com cancro. Níveis circulantes de transcrições MACC1 são significativamente maiores em pacientes com câncer em comparação com voluntários livres de tumor. Surpreendentemente, níveis mais elevados de transcritos que circulam MACC1 foram determinados em indivíduos com metástases, demonstrando o valor diagnóstico dos transcritos MACC1 no plasma do paciente em relação a formação de metástases. Mais importante ainda, altos níveis de MACC1 – determinada prospectivamente -. Correlacionam com a sobrevivência desfavorável dos pacientes que sublinham o valor prognóstico da circulando transcrições MACC1

A detecção de mRNA livre de células no sangue como “biópsias líquidos” permite o monitoramento em tempo real de progresso da doença, prognóstico e resposta terapêutica [19]. Numerosos estudos descrevem a detecção de transcrição de circulação de RNA isento de células no plasma e no soro de pacientes que sofrem de uma variedade de cancros sólidos, incluindo tiróide, pulmão, gástrico, da mama e do cancro do colo do útero, e a sua utilização para o prognóstico da evolução da doença [20] – [29]. Estabilidade de circulação de RNA isento de células é assegurada por exossomas (micropartículas, microvesículas, multivesicles) protegendo-o da degradação [30], [31]. Particularmente para fazer circular o RNA no plasma de doentes com cancro do cólon, é relatado que este ARN livre de células é confinado em estruturas vesiculares do tipo mRNA enriquecidas [32]. Várias transcrições circulantes já foram relatados para ser útil para o diagnóstico e prognóstico para câncer colorretal; por exemplo. hTERT [33], β-catenina [34], a timidilato sintase [35], e LISCH7 [36]. Particularmente CEA [37], [38], também em combinação com marcadores, tais como CK19, CK20, hTERT, TIMP-1, miR141 [39] – [41], é reconhecido como um auxílio potencial na detecção precoce de CRC, como marcador de prognóstico de recorrência, e também como biomarcador preditivo em relação à resposta terapêutica. Testando a combinação de ambos, CEA e MACC1, pode superar esses recursos.

As nossas novas descobertas de circulando transcrições MACC1 no plasma de pacientes com câncer colorretal para o diagnóstico e previsão de sobrevivência estão em linha com aqueles que relataram baseada anteriormente sobre a quantificação da expressão de mRNA em tecidos de cancro colorectal em relação ao prognóstico da doença [1]. Posteriormente, vários grupos validado o link de expressão alta MACC1 em tecido de cancro colorectal para doença avançada (por exemplo, [5], [7], [8]).