Abstract

Os microRNAs pode funcionar como supressores chave tumorais ou oncogenes e agir como biomarcadores para o diagnóstico de câncer ou prognóstico. Embora ensaios de alto rendimento têm revelado muitos biomarcadores miRNA para adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC), apenas alguns foram validados em populações independentes ou investigado por significado funcional no PDAC patogênese. Neste estudo, correlacionada à expressão de 36 miRNAs potencialmente prognósticos no tecido PDAC com características clínico-patológicas e sobrevida em 151 pacientes chineses. Em seguida, analisamos os papéis funcionais e genes alvo de dois miARNs em desenvolvimento PDAC. Descobrimos que a alta expressão de miR-186 e miR-326 prever a sobrevida pobres e melhorado, respectivamente. miR-186 era sobre-expressa em pacientes PDAC comparação com os controles, especialmente em pacientes com tumores grandes ( 2 centímetros), linfa metástases, ou a sobrevivência a curto prazo ( 24 meses). Em contraste, o miR-326 foi regulada para baixo em pacientes em comparação com controles e apresentadas relativamente a expressão aumentada nos pacientes com a sobrevivência a longo prazo ou sem invasão venosa. experiências funcionais revelou que a proliferação celular e migração PDAC foi diminuída com a inibição e melhorada a seguir sobre-expressão de miR-186. Em contraste, foi melhorada com a inibição e diminuíram após a sobre-expressão de miR-326. Um ensaio da luciferase indicaram que o miR-186 pode ligar-se directamente para a 3′-UTR de

NR5A2

para reprimir a expressão do gene. Estes achados sugerem que miR-186 sobre-expressão contribui para o potencial invasivo da PDAC, provavelmente através supressão de NR5A2, levando a um mau prognóstico; elevada expressão de miR-326 prolonga a sobrevivência provável através do potencial invasivo de células PDAC diminuindo. Estes dois miRNAs podem ser usados ​​como marcadores para diagnóstico clínico e prognóstico, e representam alvos terapêuticos para PDAC

Citation:. Zhang Zl, Bai Zh, Wang Xb, Bai L, Miao F, Pei Hh (2015) miR-186 e 326 predizer o prognóstico do pâncreas ductal Adenocarcinoma e afetar a proliferação e migração de células cancerosas. PLoS ONE 10 (3): e0118814. doi: 10.1371 /journal.pone.0118814

Editor do Academic: Surinder K. Batra, University of Nebraska Medical Center, United States |

Recebido: 08 de julho de 2014; Aceito: 06 de janeiro de 2015; Publicação: 05 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. o projecto foi apoiado pelo Guia Desenvolvimento social Plano de Xi’an (SF1203 (5)) e do projeto de Apoio para a Juventude do Hospital Segundo Affiliated de Xi’an Jiaotong University (YJ (QN) 201204). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

adenocarcinoma ductal pancreático (PDAC) é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer no mundo industrializado e sexto na China [1,2]. Dada a falta de manifestações clínicas distintas e métodos práticos para a detecção precoce, a maioria dos pacientes não tem a opção de ressecção cirúrgica quando diagnosticada [2]. Além disso, aproximadamente 70% dos pacientes que recebem a cirurgia ainda submetidos a recidiva precoce dentro de 6-12 meses, como resultado das propriedades altamente agressivas de PDAC [3]. Actualmente, a sobrevivência em 5 anos dos pacientes com PDAC é inferior a 5%, independentemente do tratamento [3]. Melhorar a taxa de mortalidade PC requer a descoberta de novas ferramentas para a detecção precoce, diagnóstico e monitorização da eficácia terapêutica.

Décadas de estudos revelaram que alterações persistentes em padrões de expressão genética devido a modificações epigenéticas, mutações genéticas e deleções são cruciais para o desenvolvimento, progressão e manutenção dos tumores pancreáticos [4]. Embora numerosas alterações na expressão dos genes têm sido encontrados em PDAC, tem sido um desafio para identificar os genes principais que são responsáveis ​​para a carcinogénese e progressão do cancro pancreático. A estratégia para a tela para fora genes ou oncogenes promotores de câncer é correlacionar biomarcadores pós-transcricional com características clínico-patológicas e sobrevivência. Um gene que prevê significativamente a progressão e prognóstico do câncer podem participar directamente na carcinogênese ou interagir com um gene que atua na patogênese do câncer [5]. Além disso, a identificação de novos marcadores é útil para o desenvolvimento de novos métodos de diagnóstico precoce e melhorar o prognóstico sombrio [6].

microRNAs (miRNAs) são uma nova família de pequenos (tipicamente 18-25 nucleotídeos), de cadeia simples RNAs não-codificantes. miRNAs ligar mRNAs alvo específicos na 3′- região não traduzida (UTR), com complementaridade perfeita ou quase perfeita, resultando em degradação do mRNA alvo ou inibição de tradução, respectivamente. Existem 2.042 miARNs maduros humanos actualmente identificados que estão previstos para regular a mais de 30% de mRNAs humanos alvo [7]. Recentemente, cada vez mais provas demonstra que miARN desregulação contribui para a carcinogénese, promovendo a expressão de proto-oncogenes ou através da inibição da expressão de genes supressores de tumor [8]. Tais “onco-miRNAs” também têm sido demonstrados em PDAC: miR-196a promove a progressão do câncer, visando NFKBIA, e miRNA-126 e 148a inibir o crescimento de células de câncer por CDC25B-regulação para baixo e ADAM9, respectivamente [9-12]. Além disso, muitos microRNAs foram encontrados para ser expressas de forma aberrante em PDAC usando a análise de perfil de expressão, embora seus papéis funcionais na carcinogênese pancreática ainda não estão claros [13-17]. Considerando-se as redes de expressão de genes desregulados em câncer de pâncreas [18], a regulação pós-transcricional para o gene alvo no PDAC por miRNAs é digno de uma maior exploração.

O significado preditivo de expressão microRNA para as características clínico-patológicas e clínico resultados da PDAC também tem atraído grande atenção. O uso de chips de microarray de alto rendimento, milhares de microRNAs foram avaliadas em pequenas amostras de pacientes com PDAC, e alguns foram relatados para ser biomarcadores estatisticamente significantes para a sobrevivência [17,19,20]. Bloomston em el. perfilado expressão miRNA em 65 pares de tecido PDAC e amostras pareadas benignas adjacentes pancreáticos tecidos [17]. Eles descobriram que 21 miRNAs foram up-regulada e quatro miRNAs foram regulados negativamente em PDAC e que um subgrupo de seis miRNAs (MIR-452, miR-105, miR-127, miR-518a-2, miR-187 e miR -30-3p) foi capaz de distinguir sobreviventes a longo prazo com a doença de nódulo positivo daqueles que morreram no prazo de 24 meses. Jamieson et al. associado perfis de expressão de miRNA em 48 tecidos PDAC com sua característica clinicopatológica e prognóstico e descobriu que 20 miRNAs, incluindo miR-21 e miR-34a, previu a sobrevida global [20]. Deve notar-se que os biomarcadores microRNA descobertos por estes estudos não são consistentes, que é parcialmente atribuído à heterogeneidade nas características dos pacientes, bem como modelos de estudo variáveis ​​e os métodos de análise estatística. A maioria dos biomarcadores descobertos por estes estudos de alto rendimento não foram validados em outros estudos independentes, e seu papel funcional no desenvolvimento PDAC também não são claros [17,19,20]. Estas discrepâncias destacar uma necessidade para a replicação dos resultados de um grande tamanho da amostra para validar os significados preditivos desses microARNs. No presente estudo, foram selecionados 36 miRNAs que foram relatados para ser desregulamentados PDAC ou para prever significativamente o prognóstico em estudos anteriores e avaliados o seu significado preditivo para a sobrevivência em 151 pacientes chineses com PDAC. Além disso, analisamos o papel eo alvo funcionais genes de dois potenciais biomarcadores de miRNA no desenvolvimento PDAC.

Materiais e Métodos

2.1 Pacientes e COLETA

O presente estudo envolveu 151 pacientes submetidos à pancreatectomia curativo na segunda Hospital Filiado de Xi’an Jiaotong University durante o período de 2005 a 2010. Todos os pacientes foram patologicamente diagnosticado com adenocarcinoma primário humano pancreático ductal (PDAC) de acordo com a classificação da OMS. Nenhum dos pacientes tinham recebido quimioterapia pré-operatória. As características demográficas e clínico-patológico dos pacientes foram obtidas por revisão dos prontuários e contato com os médicos responsáveis. O tempo de sobrevida global foi calculado a partir do momento do diagnóstico até a morte por mortes por câncer de pâncreas ou a data do último contato ou morte por outras causas para casos censurados. Um total de 151 embebidas em parafina Os tecidos fixados com formalina (FFPE) PDAC a partir dos espécimes de tecido ressecado estes pacientes foram utilizados para análise de expressão de miARN. Além disso, 15 e 14 tecidos de cancro do pâncreas tecidos normais adjacentes foram obtidos a partir dos espécimes de cirurgia dissecados de 15 pacientes com PDAC. Todos os procedimentos do estudo foram aprovados pelo Comitê de Ética Médica do Segundo Hospital Filiado de Xi’an Jiaotong University (certificado No. MEC2012023). Todos os participantes do estudo desde que o consentimento informado por escrito.

2.2 miRNA selecção

Nós revisamos a literatura sobre a importância preditiva de miRNAs para a sobrevivência do câncer de pâncreas publicada 2007-2012 na base de dados PubMed. Um total de 36 miRNAs foram selecionados para validação em nossa coorte paciente com base em dois critérios: 1) foram relatados para ser desregulamentados PDAC ou prever a sobrevivência de PDAC; 2) eles não foram validados em qualquer coorte independente paciente. Os miRNAs investigados incluídos miR-196a-2, miR-219, miR-452, miR-105, miR-127, miR-518a-2, miR-187, miR-30a-3p, miR-17-5p, miR- 125b, miR-141, miR-154 *, miR-181b, miR-186, miR-193, miR-221, miR-223, miR-224, miR-29c, miR-30a, miR-30c, miR-30d , miR-31, miR-33a, miR-34a, miR-378, miR-423, miR-455, deixe-7b *, miR-1207-3p, miR-1296, miR-1914 *, miR-197, miR -326, miR-3610, miR-4290.

Lines

2.3 celulares

As linhas celulares PDAC humanos, MiaPaCa-2, BxPC3, Panc-1, e no epitélio ductal pancreático humano (HPDE) as células foram adquiridos a partir do Type Culture Collection da Academia chinesa de Ciências (Xangai, China). As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 (Gibco, Life Technologies, Xangai, China), suplementado com 10% FBS e 1% de penicilina /estreptomicina (Life Technologies, Xangai, China). As células foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2 numa incubadora humidificada e colhidas com tripsina-EDTA em uma fase de crescimento exponencial.

Isolamento

2,4 de ARN e RT-PCR quantitativo

miARNs foram isolados a partir de secções de FFPE utilizando um kit Qiagen miRNeasy FFPE (Hilden, Alemanha) seguindo o protocolo do fabricante. Resumidamente, tecidos de câncer foram macro-dissecada 4-6 slides de amostras FFPE PDAC após uma revisão da H representante lâminas E-manchados. Os tecidos isolados foram desparafinadas com xileno e lavou-se com etanol e secou-se; elas foram em seguida tratadas com proteinase K a 37 ° C durante a noite. O lisado foi misturado com tampão de ligação de RBC e transferido para uma coluna de centrifugação ADNg eliminador para remover ADN genómico. Em seguida, uma coluna RNeasy MinElute foi usado para ligar o ARN total a partir do líquido restante. O RNA purificado foi eluído a partir dessa coluna por RNase água e foi quantificada pela absorvência a 260 nm com um espectrofotómetro de ND-1000 (NanoDrop, Wilmington, DE, EUA). O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas e as células microdissecadas utilizando um kit de isolamento de miRvana miARN (Ambion, Austin, TX, EUA). Os níveis de cada um miARN expressão foram examinadas com um TaqMan quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) utilizando iniciadores e sondas específicos individuais de acordo com as instruções do fabricante (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Para a quantificação de ARNm, ADNc foi sintetizado a partir de 2 ug da fracção de ARN grande usando a transcriptase reversa M-MLV, e PCR em tempo real foram conduzidas com SYBR

Premix Ex Taq

kit (Takara Bio, Otsu, Japão ). Os iniciadores para a quantificação de mRNA foram adquiridos a AuGCT, Inc. (Pequim, China), e as sequências são mostradas na Tabela S1. Os níveis de cada expressão amadurecer miRNA e mRNA foram avaliados usando o método de ciclo limite comparativa (Ct) e normalizadas para U6 snRNA (2

-ΔCt). A mudança de dobragem de cada miARN /ARNm foi calculada a partir de tecidos de tumor /células contra os tecidos /células normais e as células tratadas em comparação com células não tratadas. expressão miRNA foi determinada a ser elevada quando o nível de expressão era igual ou superior à média da coorte e baixa quando foi abaixo da média da coorte.

2,5 miRNA imitar e transfecção inibidor

consequências funcionais de aberrante miR-186 e miR-326 expressão foram estudados por transitoriamente transfecção de seus imitadores (miR-186 mímico e miR-326 mímico), inibidores (Anti-miR-186 e Anti-miR-326, imita Mirvana miRNA /inibidor , Life Technologies, Xangai, China), e correspondentes controlos negativos (Anti-miR-NC e miR-NC para cada miRNA, GenePharma, Xangai, China) em MiaPaCa-2, BxPC3, as células Panc-1. As células foram semeadas numa placa de 24 poços a 10.000 células por poço e foram transfectadas, 24 horas mais tarde com um inibidor de miARN ou imita a uma concentração final de 10 nm, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Às 48 horas após a transfecção, as células foram colhidas por western blot ou qRT-PCR análises.

2.6 Ensaio de Proliferação Celular

A proliferação celular foi testada por ensaio colorimétrico usando um kit de reagente WST-1 (Roche Applied Science, Basel, Suíça). Um total de 5000 células que tinham sido submetidos a 48 horas após a transfecção foram colocados em cada poço de uma placa de 24 poços e incubadas durante mais 48 horas. Em seguida, foram adicionados 10 ul de reagente WST-1 e incubou-se durante 3 horas. A absorvância a 450 nm foi medida e comparada com o valor de referência a 650 nm utilizando um leitor de microplacas e analisados ​​com o software SoftMax Pro 5. Cada grupo experimental consistiu de pelo menos 8 poços em replicado, e todas as experiências foram repetidas pelo menos três vezes, independentemente. A proliferação celular relativa foi normalizada com o controle correspondente.

2.7 Transwell celular Invasion Ensaio

BD Falcon 8.0-mm pore inserções de cultura de células Transwell (BD Biosciences, lagos Franklin, NJ, EUA) foram usada para avaliar a capacidade de invasão de células transfectadas com diferentes PDAC miARNs ou controlos negativos. As pastilhas foram colocadas numa placa de 24 poços durante 30 minutos, antes de semear as células. Um total de 3 × 10

4 células foram colocadas em cada poço da câmara superior e foram incubadas durante 24 h a 37 ° C em 5% de CO

2. Após a incubação, as células migraram que permaneceram na superfície inferior foram fixadas com uma paraformaldeído a 4% (Sigma-Aldrich, Xangai, China) solução durante 10 minutos, lavadas com PBS e coradas com 0,5% de violeta de cristal (Sigma-Aldrich, Xangai, China ) durante 10 minutos. A contagem das células foi efectuada através da utilização de um leitor de microplacas. Todos os experimentos foram realizados de forma independente em triplicado.

2.8 miR-186 alvos previsão

Os alvos miRNA putativos foram previstos pela TargetScan [21], Miranda [22], e PITA [23 ], os algoritmos RNAhybrid [24], utilizando os parâmetros por defeito incluídos no software para cada. Os genes alvo putativas foram adicionalmente rastreadas para fora através da avaliação da expressão do banco de dados do pâncreas (https://www.pancreasexpression.org) [18]. Foram selecionados os genes que preencheram dois padrões: 1) foram identificados por todos os quatro algoritmos; 2) que foram revelados para ser regulada juntamente com o desenvolvimento PDAC em estudos anteriores.

2.9 luciferase ensaio

Para construir a proteína verde fluorescente (GFP) plasmídeo repórter, o 3′-UTR do fragmento do ARNm NR5A2 contendo o sítio de ligação de miR-186 previsto foi amplificado por PCR utilizando os iniciadores listados na Tabela S1 e inserido a jusante do gene da GFP no vector pcDNA3.1 /CT-GFP-TOPO (Promega, Madison, WI, EUA) . O vector resultante foi denominado pGFP-NR5A2 3′-UTR. mutagénese dirigida ao local do local alvo de miR-186 na NR5A2 3′-UTR foi realizada utilizando um kit de mutagénese QuickChange (Stratagene, San Diego, CA, EUA) com NR5A2 3′-UTR como um molde e foi nomeado NR5A2 3 ‘-UTR-Mut. Na construção mutada, o miR-186 local alvo 5’-ATTCTTT-3 ‘foi substituído com um 5′-ACTGAAT-3′ do fragmento. NR5A2 3′-UTR-Mut foi clonado em pcDNA3.1 /CT-GFP plasmídeo-TOPO para construir pGFP-NR5A2 3′-UTR-Mut. Todas as inserções foram confirmadas por sequenciação. células MiaPaCa-2, BxPC3, e Panc-1 foram transfectadas com pGFP-NR5A2 3’-UTR ou Mut-juntos com miR-186 imita /Anti-miR-186 ou a vectores de controlo correspondente (miR-NC ou anti-miR- NC). Todas as transfecções foram efectuadas utilizando Lipofectamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA). Quarenta e oito horas após a transfecção, as actividades da luciferase foram medidas pela luciferase dupla Reporter Assay System (Promega, Madison, WI, EUA). Cada experiência foi repetida em triplicado.

2,10 análise de mancha ocidental

Western blotting foi realizado para determinar a expressão da proteína NR5A2. A proteína total foi extraído dos tecidos PDAC e tecidos normais. As proteínas foram quantificadas pelo método de Bradford de acordo com o protocolo do fabricante (Bio-Rad, Hercules, CA, EUA). As amostras (50 ug de proteína) foram resolvidas em um 10% de SDS-PAGE e transferidos para uma membrana de nitrocelulose. As membranas foram sondadas com anticorpos para NR5A2 e da desidrogenase do gliceraldeído-3-fosfato (GAPDH). Todos os anticorpos foram adquiridos da empresa Abcam e foram utilizados a uma diluição de 1: 500 de anti-NR5A2 e 1: 1000 para o anti-GAPDH. A aquisição e análise de imagem software LABWORKS (UVP, Upland, CA, EUA) foi utilizado para quantificar intensidades de banda.

2,11 estatística A análise

As curvas de sobrevida foram construídas com análise de Kaplan-Meier e comparadas com um teste de log-rank para avaliar a influência de miRNA individual e co-variável clínica no resultado. Foi utilizado um Cox modo de riscos proporcionais multivariada para avaliar o risco de sobrevida global através de cálculo da taxa de risco (HR) com intervalos confidenciais de 95% (CIs) com ajuste para fatores de risco competindo de forma gradual para trás. As variáveis ​​com

P Art 0,1 na análise univariada foram incluídas na análise multivariada. A χ

2 teste foi realizado para fazer uma comparação das variáveis ​​categóricas. Teste t de Student, o U-teste e análise de variância Mann-Whitney foram conduzidos para comparar as variáveis ​​contínuas, quando apropriado. Todos os

In vitro

experiências foram realizadas em triplicado e foram repetidas pelo menos duas vezes, com expressão de dados como a média ± DP. Todos os

P

-Valores são dois lados e são consideradas estatisticamente significativas quando inferior a 0,05. Para os testes múltiplos, a taxa de descoberta de falsas (FDR) foi calculada utilizando o método descrito por Benjamini e Hochberg [25]. FDR estima a proporção dos resultados que foram declarados positivo que são realmente falsas, e os resultados com FDR 0,05 para múltiplos testes são considerados como estatisticamente significativos. A análise estatística foi realizada no SPSS 16.0 software.

Resultados

3.1 Características dos pacientes

A tabela 1 resume as características demográficas e clínico-patológicos dos 151 pacientes incluídos no PDAC nosso estudo. A maioria dos pacientes tinha-1 grau /2 tumores estágio T2 /3, com perineural e invasão venosa, linfonodos positivos, e margens de ressecção positivos. A sobrevida global mediana foi de 16,2 meses. Desses pacientes, 110 pacientes morreram dentro de 24 meses após a ressecção (definidos como sobreviventes de curto prazo), e 41 pacientes sobreviveram 24 meses após a ressecção (definidos como sobreviventes a longo prazo). Não houve diferenças significativas nas variáveis ​​demográficas e clínico-patológico entre sobreviventes de curto prazo e longo prazo sobreviventes (FDR 0,05, Tabela 1). Além disso, a análise univariada para estas 11 variáveis ​​com um teste de log-rank revelou que a sobrevida global pobres foi significativamente associada com invasão venosa (

P

= 0,006, FDR = 0,033, Fig. 1A) eo envolvimento margem de ressecção (

P

= 0,004, FDR = 0,033, Fig. 1B), mas foi nominalmente associados à diferenciação tumoral (

P

= 0,021, FDR = 0,0