Abstract

A metástase é responsável por 90% das mortes por câncer. Durante a metástase, as células tumorais romper a partir do tumor primário, para o sangue e os vasos linfáticos, e usá-los como auto-estradas para viajar para locais distantes no corpo para formar tumores secundários. migração de células de cancro através do endotélio e na membrana basal representa um passo crítico na cascata metastática, ainda não é bem compreendido. Este processo é assim caracterizado por células do sistema imunológico que rotineiramente transmigrar através do endotélio para os locais de infecção, inflamação ou lesão. Estudos anteriores com leucócitos têm demonstrado que este passo depende muito do estado de ativação do endotélio e rigidez substrato subendotelial. Aqui, usamos um

in vitro

modelo previamente estabelecido do endotélio e imagens de células vivas, a fim de observar a transmigração de células cancerosas e comparar este processo de leucócitos. Curiosamente, a transmigração de células de câncer inclui um passo adicional, que nós denominamos “incorporação”, na monocamada de células endoteliais (CE). Durante esta fase, as células cancerosas deslocar fisicamente ECs, levando ao deslocamento da CE VE-caderina longe de cruzamentos CE fazem fronteira com células cancerosas e espalhar para a monocamada. Em alguns casos, a ECS destacar completamente a partir da matriz. Além disso, a incorporação celular de cancro ocorre independentemente do estado de activação e a rigidez do substrato subendotelial para cancro da mama e células de melanoma, uma diferença notável do processo pelo qual os leucócitos transmigram. Enquanto isso, a incorporação celular de cancro pancreático foi dependente do estado de activação do endotélio e mudado em substratos subendoteliais muito duro. Coletivamente, nossos resultados fornecem insights mecanicistas em extravasamento de células tumorais e demonstram que a incorporação é um dos primeiros passos

Citation:. Hamilla SM, Stroka KM, Aranda-Espinoza H (2014) VE-caderina-Independent Cancer Cell incorporação no endotélio vascular Precede Transmigração. PLoS ONE 9 (10): e109748. doi: 10.1371 /journal.pone.0109748

editor: Claudia Daniela ANDL, da Universidade Vanderbilt, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de maio de 2014; Aceito: 10 de setembro de 2014; Publicação: 02 de outubro de 2014

Direitos de autor: © 2014 Hamilla et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por um dos Institutos Nacionais de Saúde National Research Service Award F31NS068028 (KMS) e um Prêmio de Projeto Fronteira Humana RGP0058 /2011 ( HAE). O conteúdo é da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Distúrbios Neurológicos e Derrame ou o National Institutes of Health. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

metástase do câncer ocorre quando fragmento de células tumorais do local do tumor primário, entram nos vasos sanguíneos e linfáticos, e se espalhou para órgãos corporais distantes. Este processo é um dos principais fatores que contribuem para a letalidade do câncer [1], [2]. Uma vez que as células de cancro metastáticas ter entrado na corrente de sangue, eles devem atravessar a barreira de células endoteliais (CE) antes de invadir o tecido abaixo de um passo conhecido como extravasamento. A maioria tumor células prisão por ligação de fatores de coagulação inespecíficos e pela restrição de tamanho em leitos capilares [3]. Em alguns casos, os ligandos específicos de células tumorais têm sido correlacionados com um aumento do potencial metastático [4] – [6]. Até agora, a investigação significativa tem se dedicado a analisar os recursos bioquímicos e moleculares de células cancerosas [7] – [9], mas o mecanismo subjacente de extravasamento de células cancerosas através do endotélio permanece em grande parte desconhecido. As células cancerosas têm sido observados para migrar através do corpo da célula CE [10], e através das junções de células endoteliais de células sem destruir a camada de EC [11]. No entanto, pesquisas conflitantes também mostrou que as células cancerosas não deixe o endotélio intacto após o extravasamento [10], [12] – [14]. É importante notar que estes estudos utilizaram diferentes linhas de células de tumor, bem como de diferentes linhas de CE e

in vitro

métodos, por isso, é possível que diferentes combinações de vários tipos de células de tumor e células endoteliais podem conduzir a divergentes mecanismos de extravasamento. Existem três métodos propostos para a migração de células de cancro através do endotélio: (a) células cancerosas pode migrar através do corpo CE [10], (b) células cancerosas podem induzir CE apoptose [10], [13]; e (c) as células cancerosas pode migrar através de junções célula-célula endoteliais sem destruir de forma permanente da camada de CE [11]. Nos últimos anos, a investigação também demonstrou que as células de cancro, também exercem forças na ECS que os empurram mais profundamente na matriz extracelular durante a transmigração [15], [16], e que o endotélio aumenta a migração de células de cancro [17]. Estas descobertas sugerem que a migração do cancro através do endotélio é um processo complexo que requer mais investigação para elucidar o seu curso mecanicista.

Leucócitos transmigrar rotineiramente através do endotélio e das camadas subjacentes da vasculatura para atingir locais de tecido de inflamação, infecção, ou lesão. Este é um processo bem caracterizado, que se baseia em sinais bioquímicos localizadas. No tráfego de leucócitos, endotélio actua como uma barreira selectiva que reduz grandemente a taxa de invasão [18]. Durante uma resposta imune, o tumor quimioquina factor de necrose tumoral alfa (TNF-α) é produzido por células do estroma, e a exposição localizada de ECs a TNF-α regula positivamente moléculas de adesão, tais como molécula de adesão intercelular-1 (ICAM-1) na superfície do endotélio. Além disso, além de alterações moleculares, TNF-α também altera significativamente as propriedades estruturais do endotélio, o que induz amolecimento, realinhamento de actina, e um aumento na permeabilidade geral [19], [20]. Um factor adicional que aumenta a transmigração dos leucócitos é a rigidez do substrato subendotelial e propriedades mecânicas do endotélio. Estas variam durante a homeostase vascular e em condições patológicas [19]. Os neutrófilos são capazes de mechanosense seu microambiente [19], [21] – [24], e de neutrófilos transmigração aumentos como substrato subendotelial rigidez aumenta devido à cadeia leve de miosina quinase CE (MLCK) mediada por forças contráteis [19]. Todas essas mudanças na monocamada CE facilitar a transmigração de leucócitos durante uma resposta imune.

Desde leucócitos rotineiramente transmigrar através da camada CE, presume-se que as células cancerosas metastáticas podem compartilhar muitos dos mesmos mecanismos. No entanto, esses mecanismos têm ainda de ser investigada com maior detalhe. Por exemplo, o envolvimento de quimiocinas nas interacções endoteliais tumorais e os seus efeitos sobre a migração de células de cancro não são bem compreendidos [25]. Ainda mais, as alterações moleculares e estruturais significativas que ocorrem no endotélio após o tratamento com TNF-α pode melhorar a transmigração de células de cancro metastático. Também continua a ser visto como o extravasamento de células de câncer varia de acordo com rigidez substrato subendotelial. Tal como observado com os leucócitos [19], é possível que a transmigração de células de cancro pode aumentar com o aumento da rigidez do substrato. As células cancerosas também foram observados para empurrar ECs para dentro da matriz extracelular durante a extravasamento, o que indica que as propriedades mecânicas do ECM podem desempenhar um papel importante. Tomados em conjunto, estes resultados indicam que tanto o status de ativação do endotélio e rigidez substrato subendotelial pode influenciar o extravasamento de células cancerígenas.

Neste trabalho, um

in vitro

modelo do endotélio vascular [19 ], [26] – [28] foi usado para explorar a transmigração de células de cancro e como este processo compara a leucócitos extravasamento. Os nossos resultados mostram que um dos primeiros passos no extravasamento de células metastáticas de cancro da mama é a incorporação na monocamada CE, que perturba de forma significativa a barreira CE e desloca fisicamente ECs, algumas vezes levando a completar a remoção de células endoteliais a partir da monocamada. Ao contrário de transmigração de leucócitos, a incorporação de células de câncer não depende do estado de ativação do endotélio ou rigidez substrato subendotelial de células de melanoma e células de cancro da mama. Curiosamente, a incorporação celular do pâncreas depende do estado de activação do endotélio e a rigidez subendotelial. Em conjunto, os nossos resultados indicam que a extravasão de células de cancro da mama metastático envolve um passo adicional de incorporação do endotélio, o que não ocorre durante o extravasamento de leucócitos.

Materiais e Métodos

Preparação de substratos em gel de poliacrilamida

géis de poliacrilamida finas foram preparadas em lamelas de vidro de acordo com o método descrito pela primeira vez por Wang e Pelham [29] e descrito em pormenor nas nossas publicações anteriores [19], [23], [30] – [33]. Resumidamente, 280 kPa (15% de acrilamida + 1,2% de acrilamida bis) e 0,87 kPa (3% de acrilamida + 0,1% de bis-acrilamida) géis foram criados e revestido com 0,1 mg /mL de fibronectina (Sigma-Aldrich) como anteriormente descrito [19]. Caracterização do módulo dos géis de Young foi realizada por microscopia de força atómica e análise mecânica dinâmica, enquanto que a análise de fibronectina ligado à superfície foi realizada por imunofluorescência [23], [32]. Para experiências em vidro, 22 × 22 lamelas mm (Fisher Scientific) foram revestidas com 0,1 mg fibronectina /mL durante 2 horas à temperatura ambiente.

cultura celular

células endoteliais da veia umbilical humano (Lifeline Cell Technology) foram cultivadas como anteriormente descrito [34]. MDA-MB-231 células metastáticas de cancro da mama (ATCC) e células de melanoma A375 (ATCC) foram cultivadas em DMEM, FBS a 10% e 1% de penicilina estreptomicina. células de cancro do pâncreas SW1990 (ATCC) foram cultivadas em DMEM, FBS a 10%, e 50 ug /ml de gentamicina. HUVECs (passagens 2-5, 4 × 10

total de 5) foram semeadas em lamelas de vidro revestidas com fibronectina ou géis de poliacrilamida e crescidas durante aproximadamente 48 horas, altura em que uma monocamada formado. As células foram tratadas com meio de controlo ou 25 ng /ml de factor de necrose tumoral-α (TNF-α) para as 24 horas finais antes das experiências. Em alguns experimentos, HUVECs foram transfectadas com VE-caderina-GFP (VEcadGFP) utilizando um adenovírus (Adv), que foi recebido como um presente generoso do Dr. William Luscinskas (Harvard Medical School). laboratório do Dr. Luscinskas foi previamente descrito o procedimento para a construção do plasmídeo VEcadGFP e transferência para um vector de expressão de adenovírus [35]. As HUVECs foram semeadas em géis de poliacrilamida revestidos com fibronectina ou lamelas de vidro e dado 1-2 horas para espalhar, e 3 ul de AdV-VEcadGFP foram adicionados às células com 2 ml por meios de substrato. As HUVECs foram então cultivadas a formação de monocamada, tal como descrito acima. As monocamadas foram lavadas com PBS antes da adição de células HUVEC adicionais ou células de tumor (1 × 10

5 células totais) à superfície apical da monocamada de 22 mm × 22. Para distinguir entre as células HUVEC em monocamada e as células adicionais à monocamada, adicionou células HUVEC ou MDA-MB-231 foram corados com o DIIC lipofílico

16 corante (1? M) em suspensão durante 5 minutos à temperatura ambiente , seguido por centrifugação e uma lavagem com PBS.

imagem de células vivas e análise

microscopia de células vivas foi completada em uma incubadora platina do microscópio fechado a 37 ° C, 5% de CO

2 e 55% de humidade usando um microscópio invertido (Olympus IX71). As imagens foram capturadas com qualquer um QImaging Retiga-SRV-charge coupled device (CCD) câmera digital (QImaging Corporation) utilizando software IPlab (Becton, Dickinson and Company), ou com aa câmera digital QImaging Rolera-MGI CCD (QImaging Corporation) utilizando Slidebook software (versão 4.2.0.9; Inovações de imagem inteligentes). contraste de fase, contraste de interferência diferencial (DIC), e ou imagens /fluorescência timelapse foram capturados usando um 20 × /0,45 NA Ph1 objetiva ou um objectivo óleo NA 60 × /1,42. A fracção de células incorporadas (HUVECs ou MDA-MB-231) foi calculada dividindo o número de células que ficaram incorporados em qualquer altura durante a sequência de Timelapse pelo número total de células em fase-branca acima da monocamada no quadro inicial do seqüência. O tempo para completar a incorporação foi calculada usando a diferença entre o momento em que a célula começou a se espalhar para a monocamada eo momento em que a célula atingiu máxima espalhando área dentro da monocamada.

microscopia de reflexão Interferência

microscopia de interferência de reflexão (IRM) foi utilizado para detectar a superfície-a-superfície a interferência entre raios de luz reflectida a partir da interface substrato /médio e aqueles a partir da interface meio /célula, como descrito no nosso trabalho anterior [36] – [38] . Nesta técnica, a intensidade da luz é uma medida da proximidade da célula à superfície do vidro, de tal modo que as áreas da membrana mais próximo da superfície aparecem escuras e as mais longe aparecem mais brilhantes. Portanto, IRM é um método ideal quando se avalia celular anexo, adesão e espalhamento comportamento [36] – [38]. Para as experiências de espalhamento, 1 × 10

5 células MDA-MB-231 foram plaqueadas em lamelas de vidro revestidas com fibronectina de 22 × 22 mm em meios de HUVEC, resultando na observação de células individuais. Para estas experiências, um microscópio invertido (Olympus IX71) com uma lente objectiva de óleo a 60 × /1,42 NA e uma lâmpada de mercúrio de 100 W (Olympus; utilizado no comprimento de onda de 561) foi utilizado em combinação com uma câmara CCD (câmara Retiga SRV, QImaging) para captura de imagem. As experiências foram realizadas numa câmara de microscópio fechado que manteve as condições de cultura a 37 ° C, 50% de humidade e 5% de CO

2. Durante o espalhamento das células, uma moldura foi registada a cada 5 segundos durante um período de 1 μhour para n = 5 experiências independentes. Para avaliações estatísticas das áreas de propagação, as imagens foram analisadas usando ImageJ (National Institutes of Health) software. As células-fronteiras foram traçadas manualmente e área foi calculada utilizando rotinas ImageJ. Áreas de MDA MB-231 células se espalhando em uma monocamada HUVEC também foram traçadas manualmente e comparadas com células individuais que espalham sobre a lamela sem endotélio.

Imagem Confocal

Um total de 1 × 10

5 células MDA-MB-231 foram transfectadas com 10 � de CellLight Actina-GFP (Life Technologies) de acordo com o protocolo do fabricante e deixada a incubar durante 24 horas. Após 24 horas, as células infectadas MDA-MB-231 foram introduzidas para uma monocamada confluente de HUVEC e deixou-se incorporar, durante 15 horas. Após incorporação, as células foram fixadas em paraformaldeído a 4% e coradas utilizando o Texas Red-faloidina (Invitrogen). imagens Z-stack foram coletados por meio de um microscópio confocal Zeiss LSM 710 com um objetivo de 63 × óleo.

A análise estatística

A análise estatística foi concluída por meio de um teste t de Student entre os pares de dados, ou utilizando ANOVA para os grupos de dados, em que P 0,05 indicaram significância estatística. Após análise de variância, comparações múltiplas foram feitas usando o critério de diferença honesta significativa da Turquia. Todas as medições são relatados aqui no formato significa ± erro padrão.

Resultados

Incorporação ao endotélio é o primeiro passo na célula câncer metastático transmigração

MDA-MB-231 as células metastáticas de cancro da mama foram introduzidas na superfície apical de uma monocamada CE e monitorado à medida que interagiram com o endotélio (filme S1). Inicialmente, as células MDA-MB-231 foram branco e esférica em contraste com a fase subjacente endotélio-escurecido e achatado (Fig. 1A). Dentro de várias horas, as células MDA-MB-231 começaram a incorporar no endotélio, num processo que variou em média de 40 a 60 minutos (Fig. 1B) e foi visualmente distinta da transmigração de neutrófilos através do endotélio (Fig. 1C) . Especificamente, verificou-se que a ECs adjacente ao local de incorporação foram fisicamente deslocadas, criando espaços vazios para o celular MDA-MB-231 para se espalhar sobre a matriz subjacente (Fig. 1A), enquanto que os neutrófilos espremido através do endotélio sem perturbar a monocamada ( A Fig. 1C). Alguns CEs separado da matriz subjacente, arredondada e se tornou esférico após a incorporação das células MDA-MB-231 para a monocamada (Fig. 2). Aproximadamente 25% do ECs individual após a incorporação celular de cancro (Fig 2). No entanto, a incorporação de MDA-MB-231 em células do endotélio ocorreu mais lentamente, com uma inclinação menor de “espalhamento área em função do tempo”, e que teve uma menor área celular final, em comparação com células MDA-MB-231 de espalhamento sobre uma endotélio substrato revestido com fibronectina livre (Fig. 3D), o que indica que o endotélio não favorecem a incorporação da célula cancerosa, mas sim limitado da zona do espalhamento. Além disso, a incorporação celular MDA-MB-231 para o endotélio ocorreu mais lentamente, com uma inclinação menor de “incorporação cumulativa em função do tempo”, em comparação com os ECs incorporando uma monocamada de células endoteliais (Fig. 3A). Assim, é provável que a incorporação de células MDA-MB-231 para o endotélio ocorre por um mecanismo diferente do que a ECS nativas propagar-se no mesmo endotélio. células de melanoma A375 e células pancreáticas SW1990 também foram introduzidos para a superfície apical do endotélio. Da mesma forma para as células MDA-MB-231, as células de melanoma e células pancreáticas começou a incorporar no endotélio, num processo que durou cerca de 15 minutos e 50 minutos respectivamente. células cancerosas A375 incorporados na monocamada em um ritmo muito mais rápido em comparação com células de cancro da mama metastático e sua dinâmica de incorporação se assemelhava a de ECs nativa se espalhando para a monocamada CE. células de melanoma A375 teve uma fração final da incorporação que se assemelhava ECs espalhando em ECs, enquanto as células cancerosas SW1990 teve uma fração muito menor de incorporação em comparação com todos os grupos (Fig 3C). Além disso, as imagens confocais (Figura 4A) revelaram que, após 15 horas de incorporação, as células MDA-MB-231 (verde) deslocada ECS (vermelho), espalhando entre células endoteliais adjacentes. projecções ortogonais mostram que as células MDA-MB-231 são, de facto, espalhando entre células endoteliais e a migração não debaixo deles durante a incorporação (Fig 4B).

(A) imagem de contraste de fase de células MDA-MB-231 (branco brilhante ) no topo de uma monocamada endotelial umbilical humana veia (HUVEC). barra de escala é de 20 mm. (B) de células MDA-MB-231 (setas pretas) começa a incorporar no endotélio, como indicado pela sua mudança de microscopia de contraste de fase do branco brilhante para escuro. barra de escala é de 20 mm e aplica-se a todas as imagens no painel B. Período de tempo após o plaqueamento de células MDA-MB-231 sobre o endotélio é indicado no canto superior direito de cada imagem no formato hora: segunda: minuto. A porcentagem final de incorporação para este experimento foi de 95%. sequência de imagens (C) de contraste de fase de uma transmigração de neutrófilos através de um endotélio TNF-α-ativado. barra de escala é de 20 mm e aplica-se a todas as imagens no painel C. Período de tempo após o plaqueamento neutrófilos no endotélio é indicado no canto superior direito de cada imagem na hora: minuto:. formato de segunda

contraste de fase (à esquerda) e DIIC

16 de fluorescência (direita) imagens de MDA MB-231 células plaqueadas sobre uma monocamada HUVEC não tratadas, em momentos imediatamente após o plaqueamento (superior) e após 16 horas de interação com o endotélio (parte inferior ). As setas vermelhas apontam para a fase-brancos células que não emitem fluorescência; estas são as células endoteliais que foram forçados a sair da monocamada e, portanto, têm destacado e tornar-se arredondado. A barra de escala representa 25 um e aplica-se a todas as imagens.

(A) fracção cumulativa de ECs ou células MDA-MB-231 (231), SW1990 (1990), e as células A375 incorporada no endotélio como uma função do tempo após o plaqueamento. Os pontos de dados representam a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes (N 20 células para cada experimento). (B) fracção final de células MDA-MB-231 incorporados no endotélio tratado com TNF-α não tratada ou depois de 15 horas. Barras representam a média, enquanto as barras de erro representam SEM de pelo menos 3 experiências independentes. P 0,05 entre estes valores indicam que não há diferença estatística (n.s.). (C) fracção final de MDA-MB-231 de cancro da mama, células endoteliais, células de melanoma A375 e células SW1990 pancreáticas incorporados no endotélio após 15 horas. Barras representam a média, enquanto as barras de erro representam SEM de pelo menos 3 experiências independentes. (*) Indica significância (P 0,05) quando comparado com células endoteliais. (D) Lote de espalhamento área em função do tempo revela diferenças na propagação dinâmica para MDA-MB-231 de espalhamento para uma lamela revestida de fibronectina ( “células individuais”) ou para um endotélio não tratado ( “em monocamada”).

(a) um representante MDA-MB-231 (verde; actina-GFP) célula infectada com GFP-actina é mostrado espalhando em uma monocamada HUVEC (vermelho; faloidina). projeções ortogonais são mostrados. (B) mostrando esquemático que uma célula cancerosa (verde) desloca ECs (vermelho) por espalhar entre ECs adjacentes durante a incorporação.

A ativação do endotélio por TNF-α não afeta a dinâmica de incorporação de câncer de mama e células de melanoma

a ativação do endotélio é um passo chave na cascata de adesão de leucócitos, e nosso trabalho anterior demonstrou que a transmigração de leucócitos depende muito do estado de ativação do endotélio [19], [28], [ ,,,0],30]. A activação do endotélio por TNF-a, não só regula positivamente moléculas de adesão tais como ICAM-1 e molécula de adesão celular vascular-1 (VCAM-1), mas também aumenta a contractilidade CE [31] e a função de barreira reduz CE [20]. Portanto, o nosso próximo objetivo foi determinar se a incorporação de células de câncer de mama metastático para o endotélio exigiu a ECs para ser ativado. Curiosamente, verificou-se que a fracção acumulada de incorporação em função do tempo de células MDA-MB-231 foi semelhante, independentemente do facto de o ECs foram tratados com TNF-α (Fig. 3A). Além disso, a fracção final das células que incorporaram em um endotélio TNF-α-activado depois de 15 horas não foi diferente a partir da fracção incorporado num endotélio não tratadas (Fig. 3B). Finalmente, o tempo necessário para completar a incorporação (a partir de uma esfera arredondada para uma célula achatada dentro do endotélio) não era dependente de se o endotélio foi tratado com TNF-α (Fig. 5C). Semelhante a células de cancro da mama, a fracção de incorporação de células de melanoma A375 em ECs foi comparável, independentemente de o ECs foram tratados com TNF-α (Fig S1). Estes resultados sugerem que algumas células cancerosas metastáticas são capazes de completar as fases iniciais de extravasamento, mesmo na ausência de um estímulo inflamatório. No entanto, a fracção de incorporação após 15 horas para células pancreáticas SW1990 foi estatisticamente diferente entre os CEs sem tratamento e aqueles tratados com TNF-α (Fig S2). células SW1990 incorporada a uma taxa muito mais rápida e mais elevada fracção em TNF-α ECs tratadas em comparação com CEPs não tratada.

(A) fracção cumulativa de MDA MB-231 incorporados em células endoteliais numa 0,87 revestidos por fibronectina kPa ou 280 kPa gel de poliacrilamida, ou de vidro (50 GPa). Os pontos de dados representam a média ± SEM de pelo menos 3 experiências independentes (N 20 células para cada experimento). (B) fracção final de células MDA-MB-231 incorporados no endotélio (não tratados) em função da rigidez substrato subendotelial. Barras representam a média, enquanto as barras de erro representam SEM de pelo menos 3 experiências independentes. P 0,05 entre estes valores indicam que não há diferença estatística (n.s.). (C) Tempo para as células MDA-MB-231 para completar a incorporação é independente das propriedades mecânicas do substrato abaixo as células endoteliais. As células endoteliais em lamelas revestidas com fibronectina de vidro (50 GPa) ou géis de poliacrilamida (0,87 kPa ou 280 kPa) foram deixados sem tratamento (sem FNT) ou tratadas com TNF-α (TNF). Não houve diferença estatística no tempo de incorporação foi medida como uma função da rigidez subendotelial substrato ou tratamento de células endoteliais (P 0,05).

Incorporação é independente da rigidez substrato subendotelial de células de câncer de mama e melanoma

o nosso trabalho anterior demonstrou também que a transmigração de leucócitos depende das propriedades mecânicas do substrato abaixo as células endoteliais [19], [30]. Mais duras matrizes subendotelial promovem miosina de cadeia leve quinase dependente da contratilidade CE, conduzindo a lacunas intercelulares e reforçada leucócitos transmigração [19], [30]. Portanto, o nosso próximo objetivo foi estabelecer se a incorporação de células de câncer de mama metastático para o endotélio era dependente de rigidez substrato subendotelial. Ao contrário de transmigração de neutrófilos, que aumenta com a rigidez substrato subendotelial, a dinâmica de incorporação celular MDA-MB-231 para o endotélio foram semelhantes para macio (0,87 kPa), intermediário (280 kPa), e muito dura (vidro; 50 GPa) substratos subendoteliais (Fig. 5A). Além disso, a fracção incorporada final do MDA-MB-231 para o endotélio foi independente da rigidez substrato subendotelial (Fig. 3B). e o tempo total necessário para completar a transmigração foi independente da rigidez substrato subendotelial (Fig. 5C). As células A375 de melanoma incorporados em matrizes subendotelial macios, intermediários, e muito duros com dinâmica de incorporação semelhantes e fração final da incorporação de células de cancro da mama (Fig S3). células pancreáticas SW1990 exibido um comportamento diferente das células de melanoma e células de cancro da mama (Fig S4). Quando as células SW1990 foram plaqueadas em substratos macios e intermediários, eles exibiram um nível semelhante de incorporação e dinâmica fracção final da incorporação após 15 horas (Fig S4). No entanto, quando autorizados a incorporar em matrizes muito rígidas (de vidro; 50 ACP), eles exibiram uma fração muito menor de incorporação e taxa de incorporação mais lenta. Enquanto os passos subsequentes da cascata metastática podem depender de rigidez do substrato, os nossos resultados indicam que os estágios iniciais de extravasamento de células de cancro da mama e o extravasamento de melanoma ocorrer independentemente das propriedades mecânicas da matriz abaixo do endotélio enquanto incorporação célula pancreática muda em substratos muito rígidas.

as células endoteliais não expressam VE-caderina ao longo das fronteiras com cancro da mama células incorporados

Vascular caderina endotelial (VE-caderina) é uma das moléculas de adesão homofílicas chave expressas pelo ECS na célula-célula fronteiras em uma monocamada confluente. A integridade do endotélio como uma barreira vascular é fortemente dependente do bom funcionamento do VE-caderina de moléculas de adesão [39], [40]. Como ECs incorporado num endotélio confluentes saudável, GFP-VE-caderina foi expresso por todas as células endoteliais vizinhas da DIIC incorporada

16-rotulados CE (Fig. 6A, Filme S2), indicando que a adição de novos ECs para a monocamada não fez interromper a integridade das junções CE. A seguir, procurou identificar as possíveis mudanças no VE-caderina morfologia seguinte incorporação de células MDA-MB-231 no endotélio. Surpreendentemente, ECs vizinha incorporada DIIC

16-rotulados células MDA-MB-231 não expressam GFP-VE-caderina em limites com as células MDA-MB-231, embora eles continuaram a expressar a GFP-VE-caderina em cruzamentos com outro ECS (Fig. 6B). Estes resultados indicam que a fase inicial da extravasão de células de cancro não só afecta a VE-caderina dependente de adesão célula-célula, mas também pode proporcionar uma via de fácil acesso de extravasamento para outras células tumorais circulantes.

DiIC16 marcado HUVEC (A) ou de MDA-MB-231 (B) foram plaqueadas em células endoteliais que expressam VE-caderina-GFP (VE-CAD-GFP). As imagens foram capturadas seguinte incorporação de cada tipo de célula. barra de escala é de 10 mm e aplica-se a todas as imagens nesta figura.

incorporação de células de câncer de mama inicia deslocando VE-caderina nas junções das células endoteliais

Antes do início do MDA MB-231 incorporação no endotélio, observou-se intacta GFP-VE-caderina na junção CE directamente abaixo do MDA-MB-231 de células (Fig 7A;. setas vermelhas, filme S2). Isto estava em contraste directo com as células MDA-MB-231, que incorporada no endotélio em pontos de tempo anteriores, em que GFP-VE-caderina foi não expressas por células endoteliais vizinhas (FIG 7A;. Setas amarelas). O primeiro passo de incorporação criada uma interrupção no GFP-VE-caderina na junção CE directamente abaixo do celular MDA-MB-231, que conduz à formação de uma pequena (~ 2? M

2) furo na junção CE (Fig . 7B; seta vermelha). Um segundo buraco pequeno, às vezes formado (Fig 5B;. Duas setas vermelhas), antes de o vazio tornou-se significativamente maior (~33 mm

2 a T = 6,35) e limpou a área da parte do corpo do CE. Finalmente, o que começou como uma pequena lacuna no GFP-VE-caderina propagada em um enorme buraco no endotélio, que passou a ser ocupado pelo celular MDA-MB-231 (Fig. 7B). Observamos também o deslocamento e reestruturação da significativa GFP-VE-caderina nos cruzamentos CE-CE próximos (Fig 7B;. Setas amarelas).

DIIC

células MDA-MB-231 de 16 marcados foram semeados em As células endoteliais que expressam VE-caderina-GFP (VE-CAD-GFP). (A) São mostrados contraste de interferência (DIC), DIIC

16 (vermelho) de fluorescência diferencial e VE-caderina-GFP fluorescência (verde), e sobreposição de imagens. Neste ponto de tempo, um MDA-MB-231 já incorporada no endotélio (setas amarelas), e a VE-caderina-GFP está ainda intacto no local directamente abaixo outro celular MDA-MB-231 que ainda não tenha começado a incorporar (setas vermelhas). Timelapse sequência (B) de fluorescência de uma DIIC

16 marcado com células MDA-MB-231 (vermelho) incorporando um endotélio expressando VE-caderina-GFP (verde). Duração do tempo após o plaqueamento de células MDA-MB-231 sobre o endotélio é indicada no canto superior direito de cada imagem em formato hora: minuto. Barra de escala painel A (imagem DIC) em é de 10 mm e aplica-se a todas as imagens nesta figura.

Discussão

metástase do cancro continua a ser uma das principais causas de morte em pacientes com câncer [1], [2], e um dos passos importantes que regulam a metástase é extravasamento a partir da vasculatura. Embora os mecanismos que regulam este processo não são claras, o endotélio é conhecida por desempenhar um importante papel, na qualidade de qualquer uma barreira para algumas células cancerosas, ou um promotor da capacidade invasiva em outras células cancerosas, incluindo células MDA-MB-231 [15], [ ,,,0],41]. apoptose CE e desembaraço da membrana basal foram relatados como efeitos colaterais durante o extravasamento de células de câncer [10], [13]. Da mesma forma, esferóides de células do tumor dos ovários deslocar células mesoteliais durante a intercalação no espaço submesotelial [16].