Abstract

Os doentes com cancro da próstata avançado, quase invariavelmente desenvolver metástases ósseas. Apesar de muitos estudos indicam que a activação da sinalização de NF-kB parece estar correlacionado com cancro avançado e promove a metástase do tumor por influenciar a migração de células tumorais e angiogénese, a influência de sinalização de NF-kB alterada em células de cancro da próstata dentro ósseas lesões metastáticas não é claramente Entendido. Enquanto as células de câncer de próstata C4-2B e PC3 crescer bem no osso, as células LNCaP são difíceis de crescer em óssea de camundongos após a injeção intraskeletal. Os nossos estudos mostram que quando comparado com LNCaP, a actividade de NF-kB é significativamente mais elevada em C4-2B e PC3, e que a activação da sinalização de NF-kB em células de cancro da próstata em resultado do aumento da expressão do osteoclasto indução de genes PTHrP e RANKL. Além disso, o meio condicionado derivado de NF-kB activado células LNCaP induzir a diferenciação de osteoclastos. Além disso, a inactivação de sinalização de NF-kB em células de cancro da próstata inibiram a formação de tumores no osso, tanto no PC3 osteolíticas e osteoblásticas células C4-2B mistos /osteoclástica; enquanto que a activação da sinalização de NF-kB em células LNCaP promovido o estabelecimento do tumor e proliferação no osso. A activação de NF-kB em células LNCaP resultou na formação de um tumor misto osteoblástica /osteoclástica com o aumento osteoclastos que rodeiam o osso novo formado, semelhante a metástases frequentemente observado em doentes com cancro da próstata. Estes resultados indicam que a reação osteoclástica é necessária mesmo nas células cancerosas osteoblásticas e a activação de NF-kB sinalização em células de câncer de próstata aumenta osteoclastog�ese por up-regulação genes osteoclastogênicos, contribuindo assim para a formação óssea metastática

Citation.: Jin R, Sterling JA, Edwards JR, DeGraff DJ, Lee C, Parque SI, et al. (2013) A ativação de NF-kappa B Sinalização Para promover o crescimento de células cancerosas da próstata nos ossos. PLoS ONE 8 (4): e60983. doi: 10.1371 /journal.pone.0060983

editor: Qiming Jane Wang, da Universidade de Pittsburgh School of Medicine, Estados Unidos da América

Recebido: 16 de Agosto de 2012; Aceito: 05 de março de 2013; Publicação: 05 de abril de 2013

Direitos de autor: © 2013 Jin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho recebeu apoio para RJ pelo Departamento de Defesa (DOD) Programa de Pesquisa em Câncer de próstata (PCRP) (W81XWH-10-1-0236); a JAS pela tmen (5U54 CA 126.505), a Universidade Vanderbilt Centro osso PPG (5P01 CA40035) e do Departamento de Assuntos de Veteranos Carreira de Desenvolvimento Award; a RJM pelo Instituto Nacional do Câncer (4R01 CA076142-14) e Frances Preston Laboratórios do T. J. Fundação Martell. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Quase todos os pacientes com câncer de próstata avançado (APC) desenvolver osseus metástase. O desenvolvimento do crescimento do tumor no osso é a complicação mais crítica de CaP avançado, muitas vezes resultando em significativa morbidade e mortalidade [1]. Ao contrário de outros tipos de cancro, um depósito metastático inicial de células PCA é quase estritamente limitada ao osso e muitas vezes é o único local de disseminação distal mesmo em estágios tardios da doença [2]. Uma vez que as células de tumor da próstata entram do esqueleto, um ciclo destrutivo de dano de crescimento bruto do tumor ocorre esquelético e, no ponto em que a terapêutica curativa já não é possível o tratamento paliativo e torna-se a única opção. O tempo médio entre o diagnóstico de uma metástase óssea clinicamente evidente e da morte é de cerca de 3-5 anos [3]. Portanto, compreender o mecanismo pelo qual as células CaP prosperar dentro do ambiente óssea e desenvolvimento método eficaz (s) para prevenir ou tratar CaP metástase óssea é fundamental para aumentar a taxa de sobrevivência de pacientes avançados APC.

Ao contrário de outros sólida tumores que estão associados com metástases ósseas osteolíticas, CaP metástase óssea está associada com metástases osteoblásticas. No entanto, o sucesso da colonização óssea por células CaP requer tanto processos osteoblásticas e osteolíticas. Isto ocorre, em parte, porque as células CaP são capazes de produzir factores de crescimento que podem afectar ambos os osteoblastos e osteoclastos, resultando em formação óssea osteoblástica e reabsorção óssea excessiva [1], [4]. Enquanto o papel de osteoblastos em CaP metástase óssea é bem reconhecida, várias descobertas sugerem fortemente um papel importante para a função de osteoclastos na formação bem sucedida de metástases ósseas CaP [5] – [10]. Por exemplo, quando as células CaP inicialmente colonizam um osso, que são pensados ​​para induzir primeiro osteoclastog�ese [11], e a subsequente reabsorção do osso. histomorfométrica evidência indica que formam metástases osteoblásticas em osso trabecular em locais de reabsorção de osteoclastos de reabsorção anterior e tal é necessário para a formação óssea osteoblástica posterior [12]. Estes achados sugerem que CaP induz a deposição óssea através de um aumento global de remodelação óssea. Além disso, a reabsorção óssea osteoclástica contribui para a maioria das sequelas esquelético, ou complicações ósseas (SREs, tais como fratura e dor), em pacientes com metástases ósseas. Além disso, a reabsorção óssea osteoclástica também contribui para o estabelecimento de tumores no esqueleto. Portanto, osteoclastog�ese induzida por células PCA é sugerida como sendo um evento precoce de metástases ósseas e é um pré-requisito inicial necessária para a colonização CaP osso. Embora o conceito de activação de osteoclastos como um componente subjacente de crescimento CaP no osso já é bem reconhecida, os detalhes mecanísticos, através da qual as células CaP aumentar a activação dos osteoclastos e, subsequentemente, induzir metástases para o ambiente ósseo ainda não são claras.

é agora amplamente acreditado que a tríade molecular – receptor Activador de NF-kB do ligando (RANKL), o seu receptor RANK, e o inibidor de RANKL solúvel endógeno, osteoprotegerina (OPG) – desempenham papéis essenciais e directos na formação, função e sobrevivência de osteoclastos. Muitos estudos têm indicado que a RANKL /RANK /OPG são os principais reguladores do metabolismo ósseo, tanto em condições normais e patológicas, incluindo metástases ósseas CaP [13], [14]. Outra importante gene, proteína relacionada com a hormona paratireóide (PTHrP), é conhecida por estar envolvida a diferenciação de osteoclastos. PTHrP é produzida por virtualmente todos os tumores que metastizar para o osso, e vários estudos demonstraram uma correlação entre a expressão do PTHrP e localização de tumores esquelético. PTHrP tem efeitos proeminentes no osso através da sua interacção com o receptor de PTH-1 em células osteoblásticas. Por meios indiretos, PTHrP suporta osteoclastog�ese por up-regulação RANKL em osteoblastos [15]. CaP células foram mostrados para expressar vários factores que regulam a osteoclastogénese, incluindo PTHrP, macrófagos factor estimulador de colónias (M-CSF), os membros de β factor de crescimento de transformação (TGF-p) da superfamília, e do tipo uroquinase activador do plasminogénio (uPA- plasmina), resultando na activação das metaloproteinases da matriz (MMPs; especificamente a MMP-2 e MMP-9), bem como a interleucina-1 (IL-1) e a interleucina-6 (IL-6) [16]. No entanto, a identificação do mecanismo crítico (s) ou via primária (s) que responsável pela expressão do gene inicial osteoclastogênica (s) e a reabsorção excessiva resultando na promoção de metástase óssea CaP permanece elusiva.

É amplamente aceite que a RANKL /RANK /OPG são os principais reguladores do metabolismo ósseo e a PTHrP é um dos principais reguladores mais importantes na diferenciação de osteoblastos e osteoclastos. Portanto, no presente estudo, têm-se centrado na compreensão de como RANKL e PTHrP são regulados em células CaP por NF-kB. proteínas NF-kB são uma importante classe de reguladores de transcrição em CaP. abundantes dados suporta um papel chave para a via de sinalização de NF-kB em controlar a iniciação e progressão do cancro humano [17] – [20]. A sobre-expressão de NF-kB nos núcleos de células CaP parece estar correlacionada com CaP quimiorresistência, estádio avançado, a recorrência de PSA e disseminação metastática [21] – [27]. Vários estudos publicados evidências indicando a via NF-kB é um contribuinte para a metástase visceral ou “dos tecidos moles” em CaP [18], [19], [28], [29]. Anteriormente, relataram que a activação da sinalização de NF-kB promove o crescimento de castração-resistente de CaP [30]. Neste estudo, foram investigados o papel da sinalização de NF-kB na colonização de células CaP no ambiente do osso e o papel deste mecanismo desempenha na destruição óssea associada com CaP metástase óssea. Relatamos que a activação da sinalização de NF-kB aumenta a expressão de genes em células osteoclastogênicos APC, que é suficiente para as células cancerosas para fixar e crescer no ambiente de osso e aumentar a formação de lesão. Para nosso conhecimento, este é o primeiro relatório que a ativação da sinalização da NF-kB em células CaP aumenta osteoclastog�ese por up-regulação genes osteoclastogênicos, contribuindo assim para a formação de metástases ósseas. Nosso estudo indica que a segmentação para baixo-regulação do NF-kB poderia ter um grande impacto na redução da metástase óssea dolorosa em pacientes avançados APC.

Materiais e Métodos

Cultura e materiais celular

As linhas celulares de carcinoma da próstata humano LNCaP e PC-3 foram obtidas de ATCC (Manassas, VA). células C4-2B foram presentes de Dr. Leland Chung (Cedars Sinai Medical Center, Los Angeles, CA) [31]. As células foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2 no ar. As linhas celulares foram rotineiramente cultivadas em RPMI 1640 (Gibco-BRL) de meio contendo 5% de soro de vitelo fetal (FBS) (Hyclone), 0,1% de ITS e 0,1% de glutamina (Gibco-BRL).

Geração de NF- kB sinalização continuamente activada /desactivada linhas celulares de CaP

Para gerar uma linha celular de sinalização de NF-kB CaP constitutivamente activada, as células LNCaP foram estavelmente infectadas com IKK2-EE vector retroviral resultante em LNCaP-EE, em que NF-kB actividade foi activado com um constitutivamente activa (EE) mutantes de IKK2, [33] [32]. Para gerar a sinalização de NF-kB linhas celulares de CaP continuamente inactivadas, células C4-2B e PC3 foram estavelmente infectadas com IKK2-KD vector retroviral (C4-2B-KD KD-e PC3), em que a actividade de NF-kB foi inibida com uma cinase mortos (KD) IKK2 mutante [32], [33]. As células infectadas com o vector vazio foram utilizados como controle (LNCaP-EV, C4-2B-EV e PC3-EV). Todos os vetores retrovirais foram uma oferta do Dr. Martin Leverkus, Universidade de Magdeburg, Alemanha.

transcrição reversa e PCR em tempo real

Total de RNAs de LNCaP, LNCaP-EE, C4-2B e células PC3 foram extraídos utilizando Trizol (Gibco-BRL), e o ADN genómico residual foi removido por tratamento com ADNasel (Invitrogen). Os ARN foram transcritas inversa utilizando iniciadores aleatórios e Superscript II (Gibco-BRL) de acordo com o protocolo do fabricante. Os iniciadores utilizados para amplificar a RANKL foram 5′-TGGAAGGCTCATGGTTGGAT-3 ‘(para a frente), 5′-CATTGATGGTGAGGTGTGCAA-3′ (inverso); PTHrP foram 5’-TTAAAGCAGTACCCCCCTACCA-3 ‘(para a frente), 5′-ATGGGCTCTAGCGCCTCTCT-3’ (inverso). As reacções de PCR em tempo real foram efectuadas num volume de 20 uL utilizando um formato de placa de 96 poços e a fluorescência foi detectada utilizando o sistema de detecção em tempo real da Bio-Rad I-Cycler QI. a expressão do gene foi normalizado para 18s rRNA pela 2

-ΔΔCt método [34].

ensaios PTHrP RANKL ELISA e Radio-imuno (RIA)

Para determinação dos níveis de RANKL e PTHrP secretado pelas células APC, LNCaP-EV, LNCaP-EE, PC3-EV e PC3-KD células foram cultivadas separadamente, durante 48 horas; os números de células foram contadas. 40 e 100 uL de meio de cultura foram usados ​​no ELISA (MyBioSource) e RIA (Beckman Coulter) conforme as instruções do fabricante, respectivamente. Cada amostra foi analisada em triplicado por leitor de ELISA ou de um contador gama (Beckman Coulter) e as concentrações foram determinadas segundo as instruções do fabricante.

análise Western blot

lisado celular total foi extraído a partir de NF-kB ativadas células /inativados APC. Uma alíquota de 20 ^ g de cada amostra de proteína foi separada num gel de gradiente de Tris-glicina 4-12% (Novex ™), e, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose (Schleicher Schuell, Germany). As membranas foram bloqueadas com 5% de leite desnatado em TBS-T (solução salina tamponada com tripsina, 1% de Tween-20) tampão. O RANKL (N19, Santa Criuz) ou PTHrP (N19, Santa Criuz) anticorpos foram adicionados a sua concentração óptima (1:1000) e as manchas foram incubadas 1 hora em temperatura ambiente. Depois de se lavar três vezes durante 10 minutos cada uma em TBS-T, a incubação foi realizada durante 1 hora com os anticorpos anti-ratinho de cabra-peroxidase de rábano conjugado secundário, respectivamente. Os sinais foram desenvolvidos por um sistema de detecção ECL (Amersham Biosciences, Amersham, EUA).

transfecção transiente ensaio

O vector NGL [um vector repórter responsivo a NF-kB, que tem luciferase e verde fluorescente Protein (GFP) genes repórter] [35] foi usado para medir a actividade de NF-kB em células cancerosas CaP por experiências de transfecção transiente. LNCaP, C4-2B e PC3 células foram plaqueadas a uma densidade inicial de 2,5 x 10

4 /poço em placas de cultura de tecidos de 24 poços. Após 24 horas, as células foram transfectadas com o vector de NGL utilizando Lipofectamina (Invitrogen) durante quatro horas de acordo com o protocolo do fabricante. A eficiência da transfecção foi determinada por co-transfecção de pRL-CMV contendo o gene repórter de luciferase de Renilla (Promega). A actividade da luciferase foi determinada usando o sistema de ensaio de luciferase Promega Corp 24 horas após a transfecção. Os valores representados representam a média de pelo menos três amostras individuais ± SEM.

diferenciação dos osteoclastos ensaio

Células da medula óssea foram isoladas do fémur de rato pela pressão do fluido aplicada com uma seringa. Para a obtenção de osso derivadas de medula de monócitos /macrófagos, as células de medula óssea foram cultivadas em meio DMEM contendo 10% de sobrenadante de L929 como fonte de M-CSF e RANKL [36]. Após as células de medula óssea cultivadas primárias diferenciadas em monócitos /macrófagos (cerca de 6 dias), as células foram semeadas em placa de 24 poços e tratadas com meio condicionado a partir de células LNCaP (CaP diferentes, LNCaP-EE, C4-2B e células PC3) . Para gerar os meios condicionados contendo secreções de células APC, meio RPMI 1640 (contendo 5% de FBS, 0,1% de ITS e 0,1% de glutamina) foi adicionado à placa de cultura de células CaP. Após 24 horas, o meio foi recolhido e transferido para células alvo (monócitos /macrófagos). O meio condição foi alterado diariamente. Em seguida, após 10 dias de cultura adicional com meios condicionados, as células alvo foram fixadas e a diferenciação dos osteoclastos foi confirmada por coloração resistente ao tartarato ácido de fosfato (TRAP) (Sigma). As células com uma coloração positiva para a TRAP contendo 3 ou mais núcleos foram contadas como osteoclastos. Para a quantificação, o número de osteoclastos em cada poço da placa de 24 poços foi contado ao microscópio. Cada grupo tem 6 poços (poços de placa de 24 poços). Os resultados mostraram que o número médio desvios ± Standard.

proliferação osteoblastos ensaio

Um 3-dia filhote de cachorro velho do tipo selvagem C57BL6 foi anestesiado no gelo após mergulho em etanol 70%. Depois sacrificados por decapitação com tesouras, o couro cabeludo, foi feita uma incisão na linha média e exposto o crânio. Crânio (frontal, parietal, temporal e occipital ossos) foi excisado com um par de tesouras finas e iris cérebro removido em meios α-MEM (isento de soro) em placa de 60 mm. osso craniano foi cortada em 4-5 pedaços. Os ossos foram colocados em tubo de 15 ml com 2 ml de meio de colagenase [media α-MEM isento de soro com colagenase A (2 mg /ml)]. Os ossos foram incubadas durante 30 minutos a 100 rpm, em 37 ° C agitador bacteriana. meios sobrenadante foi cuidadosamente descartados, e os ossos foram adicionados 5 ml de novos meios de colagenase e incubadas durante 2 horas a 150 rpm numa incubadora trepidação. Depois de centrifugar a 1500 rpm durante 3 min, meios sobrenadante foi descartado e suavemente re-suspensa em 5 ml α-MEM suplementado com 10% de FBS e 2 × Penn /Strep e cresceu em milímetros prato 60. Após 2 semanas, os osteoblastos primários foram semeadas em canteiros de 96 poços e tratadas com meio condicionado derivado de NF-kB activado /CaP células inactivadas (LNCaP-EV, LNCaP-EE; C4-2B-EV, C4-2B-KD; PC3-EV e células PC3-kD). Para gerar os meios condicionados contendo secreções de células APC, meio RPMI 1640 (contendo 5% de FBS, 0,1% de ITS e 0,1% de glutamina) foi adicionada às placas de cultura de células APC. Após 24 horas, o meio foi recolhido e transferido para direccionar células (osteoblastos). ensaio de MTT foi realizado em 48 horas após o tratamento.

modelo do rato da doença óssea induzida por tumor

Todos os estudos com animais foram realizados em estrita conformidade com as recomendações contidas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de laboratório do National Institutes of Health. O protocolo foi aprovado pela Vanderbilt Institutional Care Use Committee (número de autorização: M /09/387). Tanto o NF-kB activado (PC3-EV, C4-2B-EV e LNCaP-EE) e inactivada (PC3-KD KD-C4-2B e LNCaP-EV) CaP células foram usadas para investigar se a activação de NF-kB sinalização kB contribui para o estabelecimento do tumor APC e crescimento no ambiente de osso. Para reduzir a variabilidade inter-anfitrião ao comparar os grupos controle e teste, NF-kB ativados e células CaP inativadas foram enxertados no mesmo mouse. Em cada host individual, a tíbia esquerda foi injetado com NF-kB activada PCA (PC3-EV, C4-2B-EV e LNCaP-EE) células, enquanto a tíbia direita foi injetado com NF-kB inativado PCA (PC3-KD, ) células C4-2B-KD e LNCaP-EV, respectivamente. Especificamente, uma suspensão de uma única célula de 2 × 10

5 PC3-EV ou PC3-KD; C4-2B-EV ou C4-2B-KD; células LNCaP-EV ou LNCaP-EE /10 ul de PBS foram colocadas directamente em ratinhos macho de 6-7 semanas de idade atímicos nu (BALB /c) de osso por injecção intratibial sob a anestesia com isoflurano, respectivamente. Cada grupo tinha um mínimo de 4 ratos. lesões osteoblásticas foram avaliados por meio de imagens de animais de raios-X radiografia pequeno (Faxitron LX-60; Lincolnshire). Após o sacrifício, o volume ósseo foi avaliada por tomografia computadorizada micro e análise histológica no 3 (para PC3-EV e PC3-KD células camundongos injetados) e 10 (para LNCaP-EV, LNCaP-EE, C4-2B-EV e C4-2B células -kd injectados ratos) semanas após a inoculação do tumor. tíbias colhidas foram fixadas em solução tamponada de formalina neutra a 10% durante 24 horas e descalcificados em 0,5 mol /L de EDTA em Ca

2 + – e Mg

2 + livre de PBS de Dulbecco durante uma semana antes da inclusão em parafina. Seis micrômetros secções em série foram cortadas longitudinais da tíbia e coradas com H E ou por IHQ para analisar o crescimento de tumores no osso. histomorfométrica para o volume do tumor (TV) e o volume trabecular do osso (BV) foram realizadas utilizando o software Metamorph (dispositivos Molecular, Inc.), como descrito anteriormente [37].

tomografia Microcomputed (μCT) Análise

para a determinação da arquitectura tridimensional do osso a seguir a inoculação do tumor, os ratinhos foram sacrificados e as tíbias foram recolhidos e fixados durante a noite em solução tamponada de formalina neutra a 10% durante 24 horas, seguido por 70% de etanol. As amostras foram varridas utilizando um sistema μCT (Scanco μCT 40; Bassersdorf, Suíça). A varredura foi composta de 129 fatias, com um valor de limiar de 263. Uma reconstrução tridimensional das imagens foi feita com a região de interesse consiste dos domínios trabeculares. Regiões de interesse foram desenhados em cada um dos 100 fatias, apenas dentro do osso cortical, para incluir apenas o osso trabecular e da medula.

Imunohistoquímica

secções de tecido embebidos em parafina de tíbias foram manchado imunohistoquímica com anticorpos contra AR (clone N20, Santa Cruz), PSA (clone LK2H10, Santa Cruz) e Fox A1 (T20 clone, Santa Cruz). O anticorpo primário foi incubado a uma concentração adequada (AR: 1:1000; PSA: 1:500; Fox A1: 1:1000) durante uma hora à temperatura ambiente. O anticorpo secundário foi incubado durante 60 minutos, utilizando-rábano conjugada com peroxidase de cabra anti-coelho ou de cabra anti-ratinho (1:1000), respectivamente. As lâminas foram lavadas extensivamente em água da torneira, contrastadas com hematoxilina de Mayer e montado

A análise estatística ea imagem

Se for o caso, grupos experimentais foram comparados utilizando de duas amostras

t

. – teste, com significância definida como

P

. 0,05

resultados

a ativação da sinalização de NF-kB aumenta a expressão de genes associados à OSTEOCLATOGÊNESE em células CaP

IκBα inibe a sinalização de NF-kB através da ligação a NF-kB e prevenção de localização nuclear [38], [39]. Portanto, a regulação por diminuição dos IκBα resulta em activação contínua de sinalização de NF-kB [40], [41]. A fim de investigar o papel do NF-kB de sinalização sobre a próstata desenvolvimento /CaP e progressão, foi realizada microarray ARN para comparar directamente os tecidos da próstata a partir de IκBα rato knockout (KO) [40], [41] (incluindo IκBα – /- e ratinhos IκBα +/-) com os tecidos normais da próstata do rato. Os resultados da análise de microarray mostrou que a expressão de muitos genes associados a osteoclastogénese, tal como RANKL, PTHrP, GM-CSF e uPA, aumentou ao longo de 2 vezes em ambos IκBα – /- e +/- IκBα tecidos prostáticos, em comparação com aquele de próstata normal (dados não mostrados). De modo a confirmar ainda mais se a sinalização de NF-kB está envolvida na regulação de genes associados a osteoclastogénese em células APC, que activada de NF-kB de sinalização em células LNCaP infectando com IKK2-EE vector retroviral, em que a actividade de NF-kB foi activada com mutantes constitutivamente activas de IKK2, [33] [32]. A activação de sinalização de NF-kB foi confirmado utilizando o repórter NGL, um plasmídeo repórter de NF-kB, que tem um elemento responsivo a NF-kB acoplado a um repórter GFP /luciferase [35] (Fig. 1A). análise de qRT-PCR mostrou que a RANKL e expressão PTHrP são significativamente aumentados no NF-kB activado células LNCaP, em comparação com células de controlo de vector vazio (Fig. 1B e 1C). RANKL e PTHrP são conhecidos como factores principais de osteoclastogénese no osso, e que desempenham um papel chave na metástase óssea de muitos cancros [15], [42] – [45]. Por conseguinte, os resultados do nosso qRT-PCR indicam que a sinalização de NF-kB está envolvida na regulação de RANKL e PTHrP, os genes associados a osteoclastogénese em células APC.

sinalização de NF-kB foi activada nas células LNCaP pela infectando com IKK2-EE vector retroviral (LNCaP-EE), enquanto que as células LNCaP infectadas com o vector vazio foram utilizados como os controlos (LNCaP-EV). a actividade de NF-kB em células LNCaP-EE LNCaP-EV e foram medidos usando um repórter NGL responsivo a NF-kB (A). Expressão de RANKL (B) e PTHrP (C) foi medida por meio de qRT-PCR. Os valores representados representam a média de pelo menos três amostras individuais ± SEM. A significância estatística foi determinada por duas amostras

t

-teste. **,

P

. 0,01

células CaP capazes de crescer no microambiente ósseo têm maior atividade de NF-kB

É relatado que C4- 2B e PC3 CaP crescer bem, mas as células LNCaP são difíceis de crescer em óssea de camundongos após a injeção intrafemural /intratibial [46]. Isto indica que os eventos de expressão de genes específicos de células contribuem para a colonização bem sucedida do osso por células APC. A fim de determinar se a actividade de NF-kB CaP reflecte o crescimento de células no osso, endógena actividade de NF-kB em células LNCaP, as células PC3 C4-2B e foi medida usando o repórter NGL [35]. Curiosamente, a actividade de NF-kB em células PC3 e C4-2B (que crescem bem no osso) é significativamente maior do que a de células LNCaP (Fig. 2A). Além disso, qRT-PCR indicam expressão PTHrP (ARNm) é significativamente mais elevada em NF-kB activado LNCaP-EE, C4-2B e células PC3, em comparação com a de células LNCaP (Fig. 2B). ensaios de ELISA e RIA mostram que a activação de NF-kB de sinalização e secreção aumentada de RANKL PTHrP (proteína) significativamente nas células LNCaP-ee, em comparação com células de controlo de vector vazio (Fig. 2C, D e E). Contudo, a inactivação do NF-kB de sinalização em células PC3 (PC3-kD), infectando-as com IKK2-KD vector retroviral no qual a actividade de NF-kB foi inibida com uma cinase morta (KD) de IKK2 mutante [32], [33] ( a Fig. 2C), resultou num decréscimo significativo nos níveis de RANKL e PTHrP em comparação com células de controlo de vector vazio (PC3-EV) (fig. 2D e e). A análise Western blot confirmou ainda que a expressão de RANKL e PTHrP foi aumentada no NF-kB activado células PCA (LNCaP-EE), ao mesmo tempo, diminuindo em NF-kB inactivado células PCA (PC3-KD), em comparação com células de controlo de vector vazio ( LNCaP-EV e PC3-EV) (Fig. 2F). Estes resultados indicam que as células CaP que são capazes de crescer no microambiente do osso tem maior actividade de NF-kB e activação de NF-kB sinalização-regula genes associados a osteoclastogénese em células APC, potencialmente aumentando a sua capacidade para fixar e crescer no osso células CaP microambiente.

(a), capazes de crescimento na exposição microambiente ósseo um aumento da actividade de NF-kB. a actividade de NF-kB em células LNCaP, células C4-2B e PC3 foram medidos usando um repórter NGL responsivo a NF-kB. (B) Expressão de PTHrP está correlacionada com a actividade de NF-kB de sinalização em células APC. Expressão de PTHrP em LNCaP, NF-kB activado LNCaP-EE, C4-2B e células PC3 foi medida por qRT-PCR. (C) Geração de NF-kB inativado linhas celulares APC. sinalização de NF-kB foi inactivado em C4-2B e células PC3 infectando com IKK2-KD vector retroviral (C4-2B-KD KD-e PC3), enquanto que as células CaP infectadas com o vector vazio foram utilizados como os controlos (C4-2B e PC3-EV). a actividade de NF-kB foi medida usando um repórter NGL responsivo a NF-kB. (D e E) Expressão de RANKL (D) e proteínas PTHrP (E) no NF-kB activado LNCaP-EE e NF-kB inactivado células PC3-Kd foram medidas por ensaios de ELISA e RIA, respectivamente. As células infectadas com o vector vazio (LNCaP-EV e PC3-EV) foram utilizados como controle. (F) Expressão de RANKL e PTHrP estão correlacionadas com a actividade de NF-kB de sinalização em células APC. RANKL e PTHrP expressão foram avaliados por análise de Western blot. Os valores representados representam a média de pelo menos três amostras individuais ± SEM. A significância estatística foi determinada por duas amostras

t

-teste. **,

P

. 0,01

A ativação de NF-kB sinalização em células CaP contribui para a osteoclastogênese

Os osteoclastos são células multinucleadas altamente especializados responsáveis ​​pela óssea reabsorção, um processo crítico para a manutenção da estrutura óssea e a homeostase do cálcio. No entanto, a activação patológica dos resultados osteoclastos na perda óssea associada com a artrite inflamatória, doença periodontal, e metástases de cancro para o osso. Os osteoclastos são derivadas de monócitos /macrófagos de linhagem progenitoras sob a influência da citocina RANKL [47]. A fim de determinar se a activação de NF-kB sinalização em CaP células influências osteoclastog�ese na medula óssea, os /progenitores da linhagem de macrófagos monócitos a partir de células de medula óssea primária foram tratadas com meio condicionado de NF-kB activado /células CaP inactivadas, e monitorizada por osteoclastos diferenciação. Os nossos resultados mostram que o meio condicionado de NF-kB activado células LNCaP (LNCaP-EE) induzida TRAP-positivo formação de células multinucleadas característica dos osteoclastos, enquanto que o meio condicionado a partir de células LNCaP não o fez (Fig. 3A e a Tabela 1). C4-2B e meios condicionados de células PC3 também induziu TRAP-positivo formação de células multinucleadas (Fig. 3A e a Tabela 1). Para compreender melhor como a sinalização de NF-kB em células CaP influências componentes celulares do microenviornment osso, osteoblastos a partir de culturas primárias de células da medula óssea de murinos foram tratadas com meio condicionado de NF-kB activado células inactivadas /APC. Os nossos resultados mostram que o meio condicionado derivado de NF-kB activado células CaP não teve nenhum efeito significativo na proliferação de osteoblastos (Fig. 3B). Estes resultados indicam que a activação de NF-kB de sinalização em células CaP contribui para osteoclastogénese, mas não a proliferação de osteoblastos.

(A), meio condicionado de NF-kB activado células CaP induz a formação de células semelhantes a osteoclastos

in vitro

. Osso macrófagos derivados de medula foram tratadas com meio condicionado de LNCaP, NF-kB activado LNCaP-EE, C4-2B e células PC3. ARMADILHA coloração foi realizada após 10 dias de cultura com meio condicionado adicional. As setas indicam as células semelhantes a osteoclastos. (B) A activação da sinalização de NF-kB em células CaP não tem efeito significativo sobre a proliferação de osteoblastos. osteoblastos primários foram tratados com meio condicionado de NF-kB activada (LNCaP-EE, C4-2B-EV e PC3-EV) ou inativados (LNCaP-EV, C4-2B-KD e PC3-KD) células APC. ensaio de proliferação (MTT), foi realizada a 48 horas após o tratamento.

Antagonizar sinalização de NF-kB inibe o estabelecimento do tumor APC e crescimento no

óssea

A fim de determinar se antagonizar a sinalização de NF-kB inibe o estabelecimento do tumor APC e crescimento no microambiente ósseo, geramos NF-kB sinalização linhas de células CaP inativadas por infectar de forma estável com vetores IKK2-KD (PC3-KD e C4-2B-KD) (Fig. 2C ). Apesar do bloqueio de NF-kB taxas de proliferação ligeiramente alterada (Fig. 4), todas as células manipuladas cresceram bem (sobreviver)

In vitro

após regulação negativa da actividade de NF-kB. NF-kB PC3 inactivado e as células C4-2B (PC3-KD e C4-2B-kD) foram inoculadas no osso de ratos por injecção intratibial, e imagiologia radiografia animal pequeno raio-X foi realizada para monitorizar o desenvolvimento da lesão óssea. Os ratinhos foram sacrificados para análise histológica em 3 semanas (por PC3-EV e células PC3-KD ratinhos injectados) e 10 semanas (para células C4-2B-KD C4-2B-EV e ratinhos injectados) pós-inoculação. Todos os tumores enxertados com células C4-2B-EV PC3-EV e (PC3 e C4-2B células infectadas com o vector vazio, foram utilizados como controlos) cresceu bem no osso; Considerando que, a NF-kB inactivado crescimento celular C4-2B-KD KD-PC3 e não foi detectada (0/4 em ambos os grupos) por imagiologia radiografia de raios-X ou análise histológica (Fig. 5A e 5B). histomorfométrica mostrou que a média BV /TV é de 5,3% para o PC3-EV e 13,9% para os tumores C4-2B-EV. Estes resultados indicam que a inativação da sinalização de NF-kB inibe tanto osteolítico (PC3) e osteoblástica /osteoclástica misto (C4-2B) CaP tumores estabelecimento e crescimento no ambiente de osso.

NF-kB activada /inactivada célula CaP linhas foram gerados através da infecção de forma estável com IKK2-EE /vectores IKK2-KD. IKK2-EV foi usado como vector de controlo. taxa de proliferação foi determinada por ensaio MTT.

NF-kB inactivado células C4-2B-KD KD-PC3 e foram enxertados nos ossos rato por injecção intratibial.