Abstract

O objetivo deste estudo é avaliar a expressão das citocinas por células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de pacientes com câncer de pulmão estágio I e para confirmar estes padrões de expressão, expondo PBMC para as células de câncer de pulmão

in vitro

. Cinco citocinas alterados na fase I doentes com cancro do pulmão (CCL3, IL8, IL1β, CXCL10, sIL2Rα) foram identificados no plasma de sujeitos (n = 15) antes e após a ressecção usando um ensaio de proteína do painel 30-Plex. estudos de expressão génica utilizando RT-qPCR foram realizados em PBMC de pacientes na fase I do cancro do pulmão (n = 62) antes e após a ressecção, e em comparação com os pacientes sem cancro (n = 32) antes e depois da cirurgia para a doença benigna. experiências de co-cultura que expuseram PBMC de dadores saudáveis ​​para as células de câncer de pulmão

in vitro

foram realizados para avaliar o efeito sobre a expressão das citocinas PBMC. a expressão do gene PBMC de CCL3, IL8 e IL1β foi maior em pacientes com câncer de pulmão em comparação com os mesmos pacientes em cada um dos quatro instantes seqüenciais após a remoção dos tumores, enquanto que CXCL10 e IL2Rα permaneceram essencialmente inalteradas. Esse padrão também foi detectado quando os pacientes de câncer de pulmão foram comparados com pacientes não-cancerosas. Quando os pacientes não-cancerosas foram submetidos a cirurgia para doenças benignas, essas mudanças de expressão de citocinas não foram demonstrável. linhas de pulmão de células cancerosas, mas não células epiteliais brônquicas benignos, induziu alterações semelhantes em gene de citocinas e expressão da proteína por PBMC de dadores saudáveis ​​em um

in vitro

sistema de co-cultura. Concluímos que PBMC de fase I pacientes com câncer de pulmão possuem padrões de expressão de citocinas distintas em comparação com os doentes não-cancerosas, e pacientes com câncer de pulmão após a remoção do tumor. Estes padrões de expressão são replicados por PBMC de dadores saudáveis ​​expostas a linhas celulares de cancro do pulmão, mas não benignos células epiteliais brônquicas

in vitro

. Estes resultados têm implicações para a compreensão da resposta imune ao câncer de pulmão

Citation:. Chang DH, Rutledge JR, Patel AA, Heerdt BG, Augenlicht LH, Korst RJ (2013) O Efeito do cancro do pulmão em citocinas Expressão em periféricos células mononucleares do sangue. PLoS ONE 8 (6): e64456. doi: 10.1371 /journal.pone.0064456

editor: Sai Yendamuri, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 12 de outubro de 2012; Aceito: 15 de abril de 2013; Publicação: 06 de junho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Chang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Hospital Valley. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses: Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o cancro do pulmão continua a ser a principal causa de mortalidade relacionada ao câncer nos Estados Unidos, e é esperado que respondem por mais mortes em 2012 do que colorretal, mama e câncer de próstata combinado [1]. Embora o cancro do pulmão tem sido considerada uma malignidade fracamente imunogénicos, várias linhas de evidência sugerem uma influência do sistema imune do hospedeiro em alterar o desenvolvimento e progressão do cancro do pulmão. Estes incluem relatos de sobrevivência melhorada em pacientes com câncer de pulmão com infecções pós-operatórias [2], o aumento das taxas de recorrência entre os pacientes que recebem transfusões de sangue perioperatória [3], [4], e as taxas de incidência mais elevadas entre os indivíduos imunodeprimidos, como aqueles que teste positivo para o vírus da Imunodeficiência humana (VIH) [5]. Apesar destas observações, a função do sistema imunitário do hospedeiro no desenvolvimento e progressão do cancro do pulmão permanece obscura.

citocinas e quimiocinas (citocinas quimiotáticas) são importantes reguladores endógenos do sistema imunitário e que são segregadas pelas células imunes, bem como pelo tumor. No paciente com cancro, estas moléculas possuem diversas e complexas papéis na função e o tráfico de células imunes e outras, incluindo células endoteliais progenitoras [6]. redes de citocinas e quimiocinas também pode ser “sequestrado” por células cancerosas para fornecer um ambiente propício para o crescimento do tumor [6], [7].

Dado o papel claro de imunidade antitumoral em pacientes com câncer de pulmão, combinado com o importância global de citocinas e quimiocinas com a resposta imune, a hipótese de que o cancro do pulmão teria efeitos específicos sobre a expressão de citocinas /quimiocinas e secreção por células mononucleares de sangue periférico (PBMC). A este respeito, o objectivo do presente estudo é triplo. Em primeiro lugar, para determinar se os pacientes com estágio I câncer de pulmão apresentam a expressão das citocinas alterada no plasma e PBMC de circulação antes da ressecção potencialmente curativa, em comparação com após a ressecção, e identificar as citocinas diferencialmente expressos. Em segundo lugar, para confirmar esta expressão diferencial em PBMC obtidos a partir de uma coorte maior de fase I pacientes com câncer de pulmão, e comparar estes resultados com um grupo de pacientes submetidos a cirurgia torácica para doenças benignas. Em terceiro lugar, para determinar se esta expressão das citocinas diferencial é acionado quando PBMC de dadores saudáveis ​​são expostas a células de câncer de pulmão

in vitro

.

Materiais e Métodos

População de pacientes

Este estudo foi analisado e aprovado pela The Valley Hospital Institutional Review Board e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os participantes do estudo. Dois grupos de pacientes foram investigados. O grupo de pacientes de câncer de pulmão incluiu indivíduos submetidos a lobectomia pulmonar curativa e dissecção de linfonodos do mediastino, com o estatuto de fase I confirmada patologicamente. O grupo de controlo de doentes incluiu pacientes não oncológicos submetidos a cirurgia torácica para condições benignas, como pneumotórax espontâneo, a ressecção de diagnóstico de um nódulo pulmonar benigno, doença pulmonar bolhosa, bronquiectasia, cistos mediastino /pulmonares e reparação de hérnia hiatal.

os pacientes foram excluídos do estudo se eles estavam recebendo corticoterapia crônica, descobriu ter avançado câncer de pulmão (fase II, III, IV) patologicamente após a ressecção, tinha outros além do câncer de pele não-melanoma cancros concomitantes, adjuvante necessário ou quimioterapia neoadjuvante , radioterapia ou ambos, ou tinham uma história de infecção pelo HIV, hepatite B ou C ou outras doenças imunossupressoras ou mieloproliferativas. pacientes do grupo controle foram excluídos se eles foram submetidos a cirurgia torácica para condições inflamatórias /infecciosas (empiema, doença intersticial pulmonar, ou pneumonite ativa) ou tinham uma história de outros tipos de câncer.

amostras de sangue pré-operatórios foram coletados durante um período de dois semana janela antes da cirurgia, enquanto que amostras pós-operatórias foram obtidas em 3 (2-4 meses), 6 (5-7 meses), 9 (8-10 meses) e 12 (11-13 meses) após a cirurgia, a menos que indicado de outra forma.

Colheita de sangue e Processamento

Lung e controlar sangue do paciente foi elaborado por punção venosa periférica em BD Vacutainer CPT Preparação de células Tubos com heparina sódica (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ). processamento de sangue foi realizada de acordo com o protocolo do fabricante. pelotas PBMC foram recolhidas e armazenadas a -80 ° C durante a extracção de ARN e os ensaios subsequentes. O plasma também foi salvo e armazenadas a -80 ° C.

leucócitos do sangue de doadores saudáveis ​​(buffy coat) usado no

in vitro

experimentos foram adquiridos a partir do Serviços de Sangue da Comunidade (Paramus, NJ) . Estes PBMC foram preparadas por centrifugação do sangue em meio de gradiente de densidade de Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare, Pittsburgh, PA) durante 30 minutos a 805 ×

g

RCF (força centrífuga relativa) à temperatura ambiente. Isolado PBMCs foram recuperados e lavados duas vezes em PBS por centrifugação durante 15 min a 10 e 453 ×

g

a 4 ° C. Isolado PBMC foram então usadas para o

In vitro

ensaios de co-cultura.

Luminex Ensaio

O ensaio Luminex é um imunoensaio baseado em grânulo em multiplex, o que permite a simultânea medição de analitos múltiplos (por exemplo, citocinas) usando uma biblioteca de esferas codificadas por cores acoplado a anticorpos (denominadas microesferas). Para a triagem inicial de proteínas do plasma, plasma foi coletado de pacientes 15 cancro fase I do pulmão no pré-operatório e pós-operatório 3-7 meses. As amostras de plasma foram então analisados ​​por meio do Painel de citocinas Humano 30-plex, LHC6003, (plataforma Luminex; Life Technologies; Carlsbad, CA). Os ensaios foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante, com a excepção de que as amostras, grânulos e tampão foram incubadas durante a noite a 4 ° C. As reacções foram realizadas usando o instrumento Luminex 100 (Luminex, Austin, TX), as curvas padrão foram geradas, e os dados foram recolhidos e analisados ​​utilizando software integrado Luminex 100 Versão 2.3. Os sobrenadantes a partir de

In vitro

experiências de co-cultura também foram avaliados utilizando o ensaio de Luminex, de acordo com o protocolo descrito acima. Para os estudos iniciais de rastreio de plasma, os níveis de proteína foram expressos relativos por cálculo da razão de mudança da dobra significativo na expressão da proteína (no pré-operatório de pós-operatório), e transformando os valores para o registo

2 escala. Pacientes com expressão exibindo pelo menos um ponto de dados acima do nível mínimo de detecção Luminex foram incluídos nos cálculos de razão.

PBMC Gene Expression Database

A expressão gênica em PBMC de seis casos de câncer de pulmão, antes e 2-5 meses após a ressecção curativa foi obtido utilizando o Affymetrix U133 + microarrays de 2,0, utilizando ARN isolado a partir de lisados ​​de células PBMC, em oposição às amostras de plasma. Este trabalho foi descrito anteriormente [8]. intensidades de hibridação foram usadas para calcular diferenças de dobragem entre pré-operatório e pós-operatório amostras.

Extração de RNA e avaliação da qualidade

O ARN foi extraído a partir de lisados ​​de PBMC utilizando RNeasy Mini Kit (Qiagen Ciências, Valência, CA) de acordo com o protocolo do fabricante, com as seguintes modificações. peletes congelados PBMC foram lisadas directamente em tampão RLT para minimizar a degradação de ARN. Os lisados ​​celulares foram passados ​​através de QIAshredder (Qiagen) antes da purificação subsequente, tal como descrito no protocolo. foi usado-Ribonculease livre de DNase (Qiagen) durante a digestão de ADN em coluna para minimizar a presença de DNA genómico residual.

qualidade do RNA e concentração foram avaliados utilizando chips de ARN nano com Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA), e analisados ​​usando o software Expert 2100 (Agilent). O RIN (ARN Número de Integridade) para o RNA extraído estava na gama de 7,0 a 10,0, com a média de 8,8 ± 0,68 para todas as amostras de ARN utilizados neste estudo.

quantitativa em tempo real transcrição reversa PCR (RT -qPCR)

as experiências RT-qPCR foram realizadas utilizando o 7500 instrumento de PCR em tempo real da Applied Biosystems (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). Todos os materiais e protocolos foram obtidos de Applied Biosystems. conjuntos de primers e sonda (Tabela S1) foram projetados usando Primer Software Express (Applied Biosystems), após o conjunto padrão de critérios de desenho estabelecidos pelo software. Conjuntos durou um intrão e ponte uma junção exão-exão, foram feitas a especificação tanto por Applied Biosystems ou Sigma-Aldrich (St. Louis, MO). Os iniciadores e as sondas foram testados empiricamente para a ausência de interferência, antes de ser utilizado para a multiplexação. O controlo de normalização utilizada para todas as experiências de RT-qPCR era (símbolo gene ACTB) β-actina, que foi utilizado como o gene de referência para todos os cálculos. RT-qPCR ensaios multiplex que consiste em três a quatro conjuntos de iniciadores e as sondas (incluindo os que para ACTB.) [9].

A reacção de RT foi realizada com 2 ug de ARN por reacção, utilizando ARN de alta capacidade foram realizados ao kit de ADNc (Life Technologies Corp., Carlsbad, CA). reacção de PCR quantitativa foi realizada utilizando 30 ng de ADNc em triplicado. Dobre cálculos mudanças foram realizadas utilizando o “método comparativo C (T)” estabelecido pelo fabricante [10]. C (T), o limiar de ciclo, também é referido como valor Cq (ciclo Quantificação). Para o cálculo, a média dos valores em triplicado Cq foi utilizado para a análise. valores CQ foram normalizados para aqueles para ACTB.

Cultura de Células e

in vitro

Experiment Co-cultura

O A549 e HCC827 linhas celulares de cancro de pulmão humano foram adquiridos da ATCC ( Manassas, VA). As células A549 foram cultivadas em meio F12K, HCC827 células em meio RPMI. Ambos os meios de cultura foram suplementados com soro fetal bovino a 10%, 0,028% de HEPES (ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico), 0,02% de piruvato de sódio, 0,02% de Penicilina /Estreptomicina, e 0,004% de gentamicina. Todos os reagentes utilizados para a cultura celular foram adquiridos a Life Technologies (Carlsbad, CA). As células primárias humanas epiteliais brônquicas NHBE (), meio de cultura BEBM (suplementado com kit de bala BEGM) correspondentes, e os reagentes foram adquiridos a partir de Lonza (Allendale, NJ). cultura NHBE e subcultura foi realizada de acordo com o protocolo do fornecedor (Lonza). As culturas celulares foram mantidas a 37 ° C com 5% de CO

2.

A549, células HCC927 e NHBE foram cultivadas durante dois dias em 3 ml de meio em placas de 35 mm (6 poços) (BD Biosciences , Franklin Lakes, NJ) a 80-90% de confluência. Após dois dias, 0,4-uM inserções Transwell (Corning Corp, Corning, NY) foram colocados nas cavidades e 5 × 10

6 de PBMC de dadores saudáveis, suspensos em 3 ml de meio de cultura de células correspondente, foram adicionados a cada transwell . controlos co-cultura consistia em poços contendo apenas meio completo de cultura de células (F12K, RPMI ou BEBM, suplementado, tal como descrito acima) sem as células epiteliais malignas ou benignas. Co-culturas foram então incubadas durante 6 e 18 horas. Após a incubação, os sobrenadantes de cultura de células foram colhidos, centrifugados (453 ×

g

RCF, 4 ° C, 15 min), e alíquotas armazenadas a -80 ° C durante o ensaio de Luminex. Para análise da expressão génica, as inserções Transwell foram removidos e imediatamente lisadas PBMC

In situ

utilizando tampão de RLT (kit RNeasy; Qiagen) e armazenado a -80 ° C ou usado imediatamente para extracção de ARN para RT-qPCR. Para a análise de citometria de fluxo da expressão da proteína, 10 horas após a adição de PBMC às inserções Transwell, adicionaram-se 1 ul /ml de Golgi plug /Brefeldina A (BD Biosciences) para inibir o transporte de proteínas. PMA (forbol-12-miristato-13-acetato, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foi adicionada a poços seleccionados como um controlo positivo ao mesmo tempo com GolgiPlug. Depois de mais 8 horas de incubação, as PBMC foram colhidos e utilizados para a citometria de fluxo para detectar citoquinas intracelulares.

Citometria de Fluxo

Para definir populações de células PBMC, sangue do paciente BD foi arrastado para Vacutainer Além disso plástico K

2EDTA ao mesmo tempo em que foi recolhida para extração de RNA. populações de células imunes foram caracterizadas por citometria de fluxo seguindo os procedimentos operacionais padrão estabelecido pelo Hospital Vale Patologia Clínica do Laboratório. A citometria de fluxo foi realizada utilizando um Beckman Coulter Cytomics FC500 e CXP citómetro de software. A análise dos dados foi realizada utilizando software Kaluza da Beckman Coulter. Os reagentes para a citometria de fluxo foram adquiridos a partir de várias fontes: Anti-humano-CD11b-PECF594, anti-humano-IL-8-PE, anti-CD14 humano-FITC, e anti-humano-PE-IL1β da BD Biosciences; anti-humano-CD8-PE-Cy5 anti-humano-CD56-PE-Cy7, e anti-humano-CCL3-PE a partir eBioscience (San Diego, CA); anti-humano-CD3-ECD e de anti-humano-CD45-PE-Cy7 de Beckman Coulter (Brea, CA); anti-humano-CD4-FITC e anti-humana-CD19-PE-Cy5 da Dako (Carpinteria, CA).

Para o

in vitro experimentos

co-cultura, coloração intracelular de citocinas foi realizada seguindo o protocolo Cytofix /Cytoperm da BD Biosciences. Resumidamente, as PBMC a partir das experiências de co-cultura foram colhidas, lavadas e coradas para marcadores de superfície celular. Após a coloração da superfície, as células foram lavadas, fixadas com Cytofix /Cytoperm e coradas para CCL3 intracelular, IL8, e IL1β. Após a coloração, as células foram lavadas de novo antes da análise.

Análise estatística

As diferenças nos níveis de expressão de médias entre os doentes com cancro e doentes de controlo e as alterações nos níveis de expressão média ao longo do curso de tempo eram avaliada simultaneamente usando análise de medidas repetidas de variância (ANOVA). Este tipo de ANOVA representa o efeito simultâneo de ambos os factores de expressão [11]. A comparação dos doentes com cancro e doentes de controlo essencialmente avalia o efeito da presença de tumores nos níveis de expressão, enquanto a avaliação da expressão como uma função de tempo avalia o efeito que um procedimento cirúrgico teve em cada paciente no estudo.

Os valores de P ≤0.05 foram considerados estatisticamente significativos. software IBM SPSS Statistics (versão 19) foi utilizado para todas as análises estatísticas.

Resultados

Análise inicial de Plasma do Estágio I pulmão pacientes com câncer para os níveis de proteína de citocinas

Para avaliar se citocinas e quimiocinas foram diferencialmente expressos no plasma do estágio I pacientes com câncer de pulmão (n = 15) antes e depois (3-7 meses de pós-operatório) ressecção curativa foi utilizado um imunoensaio multiplex humana, e os resultados são apresentados na Tabela 1. dos 30 alvos do factor originais imunes citocina /quimiocina /crescimento ensaiada por Luminex, os níveis de 21 alvos estavam acima do limite de detecção em amostras de plasma dos pacientes com cancro do pulmão (Tabela 1), enquanto que os níveis de expressão de 9 alvos (factor de Necrose tumoral alfa, IL2, IL4, IL5, IL10, IL13, IL17, macrófagos granulócitos factor estimulador de colónias, o interferão gama) estavam abaixo do limite de detecção, tanto no pré-operatório e pós-operatório amostras (dados não mostrados).

Identificação de 5 genes para posterior investigação

para corroborar as descobertas iniciais para os 21 alvos identificados pelo ensaio Luminex, e para ajudar a definir metas para uma investigação mais aprofundada, nós interrogado um banco de dados de microarranjos gerada anteriormente em nosso laboratório que compara padrões de expressão gênica em PBMC obtidos de pacientes com câncer de pulmão em estágio I, antes e após a ressecção curativa. Semelhante aos dados de proteínas, a expressão do gene para a maioria desses 21 citocinas foi maior antes da ressecção curativa de câncer de pulmão em estágio I, em comparação com após a ressecção (Tabela 1).

Cinco citocinas foram selecionados para uma investigação mais aprofundada por examinar os dados de proteínas plasmáticas triagem inicial e o banco de dados microarray (mRNA) em paralelo, com foco em metas que foram significativamente up /subregulado (p /= 0,05). Como mostrado na Tabela 1, uma das quatro citocinas (proteínas) que foram detectados no plasma aos níveis mais altos

antes

à fase I cancro do pulmão ressecção (CCL3 (quimiocina CC com motivo ligando 3), IL8 (Interleucina 8), IL-6 (IL-6), IL1β (interleucina 1 beta)), três foram corroborados pelos dados de expressão de genes de PBMC a partir da base de dados de microarray (

CCL3, IL8, IL1β

) ao nível do ARNm. Da mesma forma, as duas citocinas (proteínas) que foram encontrados nos níveis mais baixos

antes

para a fase I ressecção cancro do pulmão (CXCL10 e IL2Rα solúvel) foram ambos corroborada pelos dados de expressão de gene PBMC do banco de dados microarray. Figura S1 representa graficamente os resultados de proteínas plasmáticas triagem resumidos e resultados de banco de dados de mRNA PBMC para os 5 genes selecionados para um estudo mais aprofundado:.

CCL3, IL8, IL1β, CXCL10,

e

IL2Rα

Confirmação por RT-qPCR de diferencialmente expressos citocinas após ressecção de Fase I Lung Cancer

Para validar e estender os resultados obtidos a partir dos dados iniciais Luminex e microarray, a expressão do gene PBMC foi avaliada em muito maiores coortes de fase I pacientes com câncer de pulmão (n = 62) e pacientes controle submetidos a cirurgia torácica para doenças benignas (n = 32). características demográficas dos dois grupos de doentes são apresentados na Tabela S2.The cinco genes alvo seleccionados,

CCL3, IL8, IL1β, CXCL10,

e

IL2Rα,

foram investigados pela real ensaio do tempo de RT-qPCR. Dos 62 pacientes na coorte de cancro do pulmão submetidos a flebotomia antes da ressecção, 58 coleta de sangue para análise durante o período pós-operatório, assim como 16 dos pacientes do grupo controle 32. A Figura 1 mostra as mudanças relativas de expressão detectados para os 5 genes durante o período pós-operatório para o cancro do pulmão e pacientes de controle. Curiosamente, a expressão do gene PBMC para as três citocinas (

CCL3, IL8, IL1β

) detectado no plasma em níveis elevados

antes da cirurgia do câncer de pulmão durante a triagem inicial foram encontrados a ser reprimidos

após

ressecção de câncer de pulmão em todos os momentos. Além disso, o mesmo padrão não foi detectada nos pacientes de controlo submetidos a cirurgia torácica para doenças benignas. Finalmente, a expressão do gene PBMC para os 2 citocinas (

CXCL10, IL2Rα

) que não foram detectados no plasma em níveis elevados

antes da cirurgia do câncer de pulmão durante a triagem inicial não foram significativamente diferentes

após ressecção (Figura 1). Após a análise desses dados utilizando medidas repetidas ANOVA, torna-se claro que

IL8

e

IL1β

expressão são significativamente reprimidos após a ressecção de câncer de pulmão em estágio I, um achado que não está associado com o efeito da cirurgia torácica em pacientes não-cancerosas.

CCL3

também parece ser regulada negativamente de forma semelhante, na medida em que ele se aproxima de significância estatística (Figura 2). Além disso, a citometria de fluxo de PBMCs mostra uma população uniforme de subtipos de linfócitos em todos os grupos de pacientes, sugerindo que as alterações na expressão genética não parece ser devido a diferenças na representação de células nas populações de linfócitos de PBMC, embora estes dados não eliminam a possibilidade de mudanças sutis em subpopulações (Figura S2).

a expressão gênica por 5 citocinas selecionados em PBMC de câncer em estágio I pulmonar (círculos fechados) e pacientes do grupo controle não-câncer (círculos abertos) depois da cirurgia são demonstrados. Cada ponto representa a média de pós-operatório (+/- SEM) vezes mudança na expressão em que ponto de tempo designado pós-operatória em comparação com o nível pré-operatório, expressos em log

2 escala. valores pré-operatórios (pré-operatório) são mostradas como zero para fins de referência. Alterações menor que zero representa regulação baixa após a cirurgia. Para os doentes com cancro, o número de amostras utilizadas nos cálculos são: pré-operatório: n = 58; 3 meses: n = 48; 6 meses: n = 43; 9 meses: n = 40; 12 meses: n = 40. Para os pacientes de controlo, o número de amostras utilizadas nos cálculos são: pré-operatório: n = 16; 3 meses: n = 11; 6 meses: n = 9; 9 meses: n = 6; 12 meses: n = 7.

A medidas repetidas de análise de variância foi utilizado para isolar o efeito da presença ou ausência de cancro de pulmão na expressão de

CCL3

(P = 0,07),

IL8

(p = 0,01),

IL1β

(p = 0,004),

CXCL10

(p = 0,4) e

IL2Rα

( p = 0,69). Cada barra representa a média (+/- SEM) vezes a mudança relativa para cada citocina incorporando todos os dados pós-operatório em comparação com a expressão antes da cirurgia, expressos em log

2 escala. A variação negativa vezes relativamente indica downregulation após a ressecção de câncer de pulmão em estágio I.

A expressão de

CCL3, IL8

e

IL1β

é maior em PBMC do Estágio I Lung Os pacientes com câncer comparados aos pacientes sem cancro do pulmão

para determinar se PBMC de doentes com cancro do pulmão fase I têm maiores níveis de expressão de

CCL3, IL8

e

IL1β

do que pacientes sem pulmão cancro, os resultados de RT-qPCR das amostras de PBMC pré-operatórios do cancro do pulmão fase I (n = 62) e coortes de controlo (n = 32) foram comparados. Como mostrado na Figura 3, a média da expressão em pacientes com câncer de pulmão foi significativamente maior em relação aos controles para

CCL3

e

IL1β

(10 e 29 vezes, respectivamente). Apesar de não ser estatisticamente significativa, a média de expressão de

IL8

foi 6 vezes maior nos pacientes com cancro do pulmão em relação aos controles. Em contraste, embora estatisticamente significativa,

IL2Rα

expressão era de apenas 2 vezes maior nos pacientes com cancro do pulmão, enquanto o

CXCL10

expressão era essencialmente inalterada. Importante, aos três e doze meses após a cirurgia, os níveis de expressão aparecem para equalizar entre o câncer e coortes de controle (Figura 3).

A. expressão pré-operatório PBMC gene na fase I pacientes com câncer de pulmão (n = 62) em comparação com pacientes não-cancerosas programados se submeter à cirurgia torácica para doença benigna (n = 32).

CCL3

: p = 0,003;

IL8

: p = 0,23;

IL1β

: p = 0,05;

CXCL10

: p = 0,55;

IL2Rα

: p = 0,01. B. expressão Três mês pós-operatório PBMC gene na fase I pacientes com câncer de pulmão (n = 48) em comparação com pacientes não-cancerosas (n = 11).

CCL3

: p = 0,79;

IL8

: p = 0,3;

IL1β

: p = 0,1;

CXCL10

: p = 0,8;

IL2Rα

: p = 0,29. C. Doze mês pós-operatório expressão do gene PBMC na fase I pacientes com câncer de pulmão (n = 40) em comparação com pacientes não-cancerosas (n = 7).

CCL3

: p = 0,76;

IL8

: p = 0,52;

IL1β

: p = 0,87;

CXCL10

: p = 0,22;

IL2Rα

: p = 0,58. Para todos os painéis, cada barra representa a relação entre o nível médio de expressão nos doentes com cancro sobre o nível de expressão significativo nos pacientes de controlo, expresso em log

2 escala. Um valor positivo indica que a expressão é maior nos pacientes com câncer em comparação com os pacientes do grupo controle. Duas amostras testes t foram usados ​​para determinar a significância das diferenças na expressão.

A citocina Perfil saudáveis ​​PBMC Doadores Mimics

In vivo

Descobertas após co-cultura com câncer pulmonar Linhas celulares

Para estender a análise dos efeitos de cancro do pulmão em PBMC expressão de citocinas, foi utilizada uma

in vitro

sistema de co-cultura, tal como descrito em Materiais e Métodos. Duas linhas de células humanas diferentes de cancro do pulmão foram usadas em câmaras Transwell inferiores: A549, uma linha celular de carcinoma do pulmão de portadora de uma mutação K-ras e HCC827, uma linha celular de adenocarcinoma de pulmão com uma mutação do EGFR (A750 E746-del). Como um controlo adicional, as células NHBE benignos também foram usadas nas câmaras Transwell inferiores. PBMC, usado nos transwells superiores, foram preparados a partir de dadores saudáveis, sem histórico de câncer de pulmão conhecido.

A exposição das PBMC de dadores saudáveis ​​para 6 e 18 horas para ambos os A549 ou HCC827 células supra-regulação da

CCL3 induzidas, IL8

e

IL1β

ARNm de uma forma dependente do tempo quando comparado com o exposto simulada PBMC (Figuras 4A e 4B). Embora

IL2Rα

mRNA também foi regulada, a extensão é muito menos do que a observada para a

IL8

e

IL1β

. Em contraste,

CXCL10

expressão estava inalterada ou regulados negativamente após co-incubação com as linhas celulares de cancro de pulmão. Curiosamente, este padrão de expressão do gene de citocinas não foi visto na co-cultivadas com as células NHBE benignos (Figura S3) de PBMC. Além disso, os mesmos cremes leucocitários utilizados para a co-cultura de células NHBE e PBMC (mostrando nenhuma resposta de citocinas) também foram expostos a células A549 e HCC827 cancro do pulmão, onde uma resposta similar àquele mostrado na Figura 4 foi apreciado (dados não mostrados) .

linhas celulares de cancro de pulmão foram co-cultivadas com PBMC de dadores saudáveis ​​tal como descrito em Materiais e Métodos. a expressão do gene de PBMC e os níveis de proteína do sobrenadante foram avaliados para cada uma das 5 citocinas seleccionadas. A. expressão do gene em PBMC expostas a células A549. B. expressão do gene em PBMC expostas a HCC827 células. Para os painéis A e B, cada barra representa a média (n = 8 dadores saudáveis) mudança de dobragem relativa (+/- EPM) entre PBMC expostas células de cancro do pulmão e PBMC expostas a meios isolados, expressos em log

2 escala. barras a cheio indicam 6 horas de co-cultura, ao passo que as barras em branco indicam 18 horas de co-cultura. C. Cytokine níveis de proteína no sobrenadante através de co-cultura de células A549 com PBMC de dadores saudáveis. D. Os níveis de proteína de citocinas no sobrenadante através de co-cultura de células HCC827 com PBMC de dadores saudáveis. Para os painéis C e D, cada barra representa a média (n = 8 dadores saudáveis) mudança de dobragem relativa (+/- EPM) entre o cancro do pulmão de células PBMC expostas (18 horas de co-cultura) de CMSP e expostos a meios isolados, expressa em log

escala de 2. Uma amostra testes t foram usados ​​para determinar a significância da média observada dobre mudanças. Em todos os painéis, um asterisco indica P 0,05. ND indica que os dados abaixo do nível de detecção.

Para avaliar os níveis de proteína de citocinas no sistema de co-cultura, os sobrenadantes foram colhidos 18 horas seguintes de co-cultura com as linhas celulares de cancro de pulmão, e avaliada utilizando o ensaio Luminex (Figuras 4C e 4D). Enquanto IL8, CXCL10 e concentrações sIL2Rα imitou os dados de expressão de genes correspondentes (Figura 4A e 4B), e os níveis de CCL3 IL1β estavam abaixo dos limites de detecção em todas as amostras para ambas as linhas celulares. Para resolver esta falta de CCL3 detectável e IL1β nos sobrenadantes de cultura, as PBMC foram avaliadas utilizando citometria de fluxo para detectar a presença intracelular do CCL3, IL8 e IL1β. Como mostrado na Figura 5A, CCL3 intracelular, IL8 e IL1β foram detectados na fracção de células CD3 + (células T) de PBMCs de dadores saudáveis ​​que tinham sido co-cultivadas com a linha celular de cancro, quer pulmonar, mas não nos que cultivadas na ausência de cancro do pulmão células. Um resultado semelhante foi obtido para a fracção CD14 + PBMC (monócitos), mostrado na Figura 5B. Por outro lado, os (células NK) CD19 + fracção (células B), e CD56 + fracção não mostrou nenhum aumento nos níveis intracelulares destas citocinas (dados não mostrados).

a seguir à co-cultura, as PBMC foram fixados e avaliados usando citometria de fluxo de citocinas intracelulares (CCL3, IL8 e IL1β). É mostrado um representante dador saudável (de 3 realizado). A. CD3 + fracção de células. A abcissa representa a coloração de CD3, enquanto que a coloração de citocinas indivíduo é reflectido ao longo da ordenada. A percentagem de células duplamente coradas está representada no canto superior direito de cada subpainel. fracção de células B. CD14 +. A abcissa representa a coloração de CD14, enquanto que a coloração de citocinas indivíduo é reflectido ao longo da ordenada. A porcentagem de células duplamente coradas é descrito no canto superior direito de cada subpainel.

Discussão

O papel das citocinas na biologia de malignidade humana é complexa, mas a maior parte do interacção entre células tumorais e células do sistema imunológico do hospedeiro é pensada para ser mediada por desta grande família de proteínas e glicoproteínas [6]. Como resultado, há um crescente corpo de literatura que avaliou os níveis de citocinas no soro no que diz respeito às características clínico-patológicas de ambos hematológicas e tumores sólidos, incluindo o cancro do pulmão. Muitos destes estudos, no entanto, só comparados os níveis de citocinas no soro de pacientes com câncer aos de voluntários saudáveis, com a ênfase colocada na utilidade potencial destas medições, em um biomarcador [12], [13].