Abstract

Polygonatum odoratum

lectina (POL), isolado do tradicional erva medicina chinesa

(Mill.)

Druce, tem atraído crescente atenção devido à sua ampla biológica actividades. No presente estudo, os efeitos anti-tumorais, incluindo apoptose e propriedades de indução de autofagia POL, foram determinadas por uma série de métodos de biologia celular, tal como o MTT, a observação da morfologia celular, citometria de fluxo, imunotransferência. Aqui, descobrimos que POL poderia induzir simultaneamente apoptose e autofagia em células humanas pulmão de não pequenas células A549 câncer. POL iniciado a apoptose através da inibição Akt-NF-kB via, enquanto POL desencadeada autofagia

via

suprimindo Akt-mTOR, sugerindo o papel interruptor molecular da Akt na regulação entre a apoptose induzida por POL e autofagia. Além disso, ROS foi envolvido na inibição induzida pela expressão POL de Akt, e pode, por conseguinte, tanto mediar a apoptose e autofagia em células A549. Além disso, POL apresentada nenhuma citotoxicidade significativa em relação às células de fibroblastos humanos normais HELF embrionárias de pulmão. Devido às actividades anti-tumorais, POL pode se tornar uma droga anti-câncer potente na terapia futuro, o que pode abrir caminho para explorar lectinas relacionadas com a GNA em medicamentos eficazes no tratamento do câncer

Citation:. Li C, Chen J, Lu B, Z Shi, Wang H, Zhang B, et al. (2014) Molecular troca de função de Akt em

Polygonatum odoratum

lectina-apoptose induzida e autofagia in Human células não pequenas do pulmão Cancer A549 Cells. PLoS ONE 9 (7): e101526. doi: 10.1371 /journal.pone.0101526

editor: Jin Q. Cheng, H. Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 15 Janeiro, 2014; Aceito: 08 de junho de 2014; Publicação: 03 de julho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Li et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelo National Science Foundation Natural da China (No. 81.373.311, No. 31.300.674, No. 30.970.643, No. 81.173.093 e nº J1103518), o Programa especial para a Ciência da Juventude e da Innovative Technology Research Group da província de Sichuan, China (No. 2011JTD0026). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

As lectinas são designados como proteínas de ligação de hidratos de carbono que amplamente existem em animais, plantas e microorganismos, e eles poderiam ligar hidratos de carbono, células aglutinar ou precipitar polissacarídeos e glicoconjugados [1]. O rápido progresso foi alcançado no isolamento e caracterização de lectinas de plantas, e, recentemente, a classificação de lectinas foi emended a partir de 7 famílias em 12 famílias [2] -. [4]

De nota, o cancro está associado com programado morte celular (PCD), que desempenha um papel importante na preservação da homeostase, diferenciação celular, controle de crescimento, de defesa celular e etc, selando em conjunto o destino final das células cancerosas [5]. Em geral, existem dois tipos principais de PCD, referindo-se à apoptose e autofagia. A autofagia é um mecanismo celular evolutivamente conservada para o apuramento das macro-complexos e organelas em células eucarióticas danificados ou supérfluas, o que leva a efeitos tanto pró-sobrevivência ou pró-morte [6]. A apoptose, que pode ser regulada por numerosas vias de sinalização molecular, destina-se principalmente para o suicídio de tumor. Autofagia e apoptose ter características morfológicas distintas e processo fisiológico, no entanto, ainda existem inter-relações complexas entre eles [7].

Polygonatum odoratum

(Mill.) Druce, um típico representante do Liliaceae família, é uma medicina tradicional chinesa ervas importante devido às suas grandes variedades de compostos biologicamente ativos.

Polygonatum odoratum

lectina (POL), isolado a partir de

Polygonatum odoratum

(Mill.) Druce, é um

Galanthus nivalis

aglutinina (GNA) família -relacionados específica de manose lectina, e exerce efeitos notável crescimento de inibição contra células A375 [8]. relatório anterior demonstrou que POL L929 induzida apoptose celular, tanto através do receptor de morte e vias mitocondriais, assim como a apoptose das células L929 induzida por TNFct amplificado [9]. No entanto, se POL poderia induzir simultaneamente apoptose e autofagia em células cancerosas estão ainda na sua infância. E, até agora, apenas a

Polygonatum cyrtonema

lectina (PCL) pode, simultaneamente, induzir uma apoptose e autofagia em células humanas melanoma A375 [10] e células L929 [11]. Portanto, a apoptose e os efeitos indutores de autofagia de POL precisa ser explorado.

Materiais e Métodos

A modelagem molecular

estrutura tridimensional de POL foi construído usando SWISS servidor -Model (https://swissmodel.expasy.org/) com a estrutura do PCL (PDB ID: 3A0E). como modelo [12], [13]

cultura celular

linhas celulares de adenocarcinoma do pulmão A549 foram adquiridos da American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, EUA), enquanto as linhas de células HELF normais humanas embrionárias de fibroblastos de pulmão foram adquiridos a partir de banco de células (Academia chinesa de Ciências, Xangai, China). as células não-pequenas humano A549 de cancro de pulmão de células foram cultivadas em meio RPMI-1640 (Gibco), contendo 10% de FBS, 100 mg /mL de estreptomicina (Invitrogen), 100 U /mL de penicilina (Invitrogen), e mantida a 37 ° C com 5% de CO

2 numa atmosfera humidificada. E as células de fibroblastos de pulmão HELF embrionárias humanas, usados ​​como grupo de controle correspondente, foram cultivadas em meio essencial mínimo Dulbecco (Gibco) contendo os mesmos materiais.

Reagentes

POL foi purificado e mantido pelo nosso laboratório [8]. de soro bovino fetal (FBS), 3- (4,5-dimetrylthiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT), 3,3-tetrahidrocloreto de diaminobenzidina (DAB), monodansylcadaverine (MDC), um inibidor autofagia 3- metiladenina (3-MA), laranja de acridina (AO), rodamina-123 e Z-VAD-fmk foram adquiridos da Sigma Chemical (St. Louis, MO, EUA). citocromo

c

cocktail de anticorpos apoptose WB (ab110415) foi obtida para MitoSciences (Eugene, Oregon, Estados Unidos). Pequenos RNAs de interferência (siRNAs) contra Beclin1 humana (# 6222), LC3 (# 6212) e controlar siRNA (# 6568) foram adquiridos de sinalização celular Technologies, EUA

Seguindo anticorpos foram adquiridos de Santa Cruz Biotech.: pró-caspase3 (# sc-7148), pró-caspase9 (# sc-56073), Bax (# SC-493), Bid (# sc-6538), Bcl-2 (# SC-492), Bcl-X

G (# sc-8392), PARP (# sc-7150), NF-kB (# SC-109), fosfo-NF-kB (Ser536) (# sc-136548) e β-actina (# SC- 47778). Além disso, os anticorpos, incluindo Phospho-Beclin1 (Ser234) (ab183335), mTOR (ab2732) e fosfo-mTOR (Ser2448) (ab109268) eram de Abcam. Anticorpos para LC3 (mAb # 12741), Akt (pan) (mAb # 4685), Phospho-Akt (Thr308) (mAb # 2965), Phospho-Akt (Ser473) (mAb # 4060), Phospho-p70S6K (Thr389) ( Acm # 9234) e fosfo-4EBP1 (Thr37 /46) (Acm # 2855) foram adquiridos a partir de Cell Signaling Technologies, EUA. As proteínas foram visualizadas utilizando anticorpos anti-coelho ou anti-IgG de ratinho conjugado com peroxidase (HRP) e tetracloridrato de 3,3- diaminobenzidina (DAB) como o substrato de HRP.

Akt constitutivamente activada (Myr-Akt, plasmídeo Addgene 9008 ), NF-kB (T7-RELA, Addgene plasmídeo 23251), mTOR (Flag-mTOR, Addgene plasmídeo 26603), vector vazio (pcDNA3, Addgene plasmid10792) foram adquiridos de Addgene.

ensaio de inibição de crescimento

as células A549 foram semeadas em placas de 96 poços e cultivadas durante o tempo indicado, e foram realizados os efeitos citotóxicos de várias concentrações de POL como previamente descrito [14]. A absorvância a 570 nm foi medida com um espectrofotómetro (Modelo 3550 Leitor de Microplacas Bio-Rad).

A viabilidade celular (%) = (OD

570 nm (droga) /OD

570 nm (controle )) x 100%.

inibição manose ensaio

ensaio de MTT foi determinada tal como mencionado acima, excepto que as lectinas foram pré-incubadas a 37 ° C durante 30 min, com diferentes tipos de manoses, tais como manose α (1,3), manose α (1,6) e α manose (1,3:1,6), que pode inibir completamente a actividade de hemaglutinação em diferentes concentrações de POL.

ensaio de apoptose

A549 e células HELF foram tratados com PBS e 23 ug /mL POL durante 12 h, 24 h, 36 h e 48 h. A morfologia celular foi representada por imagem por microscopia de contraste de fase (Leica, Wetzlar, Alemanha), bem como a microscopia de fluorescência (Olympus, Tóquio, Japão) com Hoechst 33342 coloração. Então, o total de 6 × 10

5 células A549 /poço foram semeadas em placas de 6 poços e incubadas durante 24 h, e tratados com PBS ou 23 ug /mL POL por mais 12 h, 24 h, 36 h ou 48 h de incubação. As células recolhidas foram analisadas por citometria de fluxo de ensaio tal como descrito anteriormente [15]. Para a classificação mais cedo e apoptose tardia em células A549 tratadas com Pol, ensaio de dupla marcação com Anexina V-FITC /PI foi realizada pelo kit de isotiocianato de Anexina V-fluoresceína (FITC) de detecção da apoptose de acordo com as instruções do fabricante (BD Pharmingen, San Diego , CA, EUA).

Autophagy ensaio

Após a incubação com 23 ug /mL POL de tempo indicado, A549 e células HELF foram cultivadas com MDC 0,05 mM a 37 ° C durante 60 min. A intensidade de fluorescência das células foi analisada por citometria de fluxo. Além disso, as células A549 incubadas com PBS ou 23 ug /ml para o tempo indicado POL foram coradas com laranja de acridina (10 ng /mL) durante 15 min e sujeitas a citometria de fluxo. As células foram, respectivamente, transfectadas com ARNsi Beclin1, LC3 siRNA e ARNsi de controlo a 33 nm, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. As células transfectadas foram utilizados para experiências posteriores 24 h mais tarde.

Caspase ensaio

A apoptose foi avaliada por medição da actividade de caspase-3 utilizando o kit de actividade da caspase-3 (Beyotime Instituto de Biotecnologia , Haimen, China) seguindo as instruções do fabricante.

a detecção do potencial de membrana mitocondrial potencial

membrana mitocondrial foi medido utilizando o corante fluorescente rodamina-123 tal como descrito previamente [15]. A intensidade de fluorescência de células A549 interferiu com 23 ug /mL POL durante 12 h, 24 h, 36 h e 48 h, foi analisada por citometria de fluxo.

Determinação do intracelular ROS

Após o tratamento com várias concentrações de POL para os períodos de tempo indicados, as células A549 foram incubadas com 10? M de 2 ‘, 7’-diclorofluoresceína diacetato (DCFH-dA), durante 60 min a 37 ° C. A intensidade de fluorescência de células A549 foi medida por citometria de fluxo com um comprimento de onda de excitação de 480 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm. conteúdo de GSH intracelular e actividade da enzima GPX foram medidos de acordo com as instruções do fabricante.

transfecções

Células A549 foram plaqueadas em placas de 60 mm com meio RPMI 1640 contendo 10% FBS e 1% de penicilina-estreptomicina atingido a uma densidade de 1 x 10

6 células /prato. Em seguida as células A549 cultivadas continuamente em PRMI 1640 sem FBS a 10% e 1% de penicilina-estreptomicina durante mais 2 h. De modo a formar complexos de plasmídeo-Lipofectamina LTX, plasmídeos foram misturados com 25X diluente Lipofectamina LTX, e incubadas durante 20 min em temperatura ambiente. Em seguida, as transfecções foram respectivamente conduzida em meio OptiMEM reduzida de soro (Invitrogen) contendo 1 mg /ml de ADN, 0,1% mais reagente e 0,3% Lipofectamina LTX reagente de transfecção, e adicionado o meio com plasmídeo em placas de 60 mm durante mais 48 h de cultura de As células A549. Finalmente, a eficiência de transfecção foram detectadas por análise Western Blot.

análise Western blot

células A549 foram tratadas com 23 ug /mL POL para o tempo indicado, e, subsequentemente, ambos aderente, bem como células flutuantes foram coletados. A análise Western blot dos lisados ​​de células foi realizada como mencionado anteriormente [16], [17].

A análise estatística dos dados

Todos os dados foram expressos como média ± SEM de pelo menos três experiências independentes . As comparações estatísticas foram feitas por ANOVA de duas vias e one-way ANOVA com teste de Bonferroni post hoc. A value≤0.05 p foi considerado significativo.

Resultados

família modelagem molecular de POL

As lectinas de GNA relacionadas com a suportar diferente da sequência de aminoácidos constituição, mas todos eles exibiram estrutura tridimensional semelhante. GNA relacionadas com lectinas da família suportar rigorosa actividade de ligação à manose, e conservado motivo de aminoácidos de ‘QXDXNXVXY’ desempenha um papel importante no reconhecimento de manose. POL possuía três subdomínios conservadas ‘QXDXNXVXY’ e, portanto, POL era rigoroso lectina de ligação a manose. Como mostrado na Fig. 1A, a estrutura tridimensional de pol foi construído, e o monómero de POL exibiu uma estrutura β de barril que compreende três subdomínios (I, II, III), cada um subdomínio é constituída por três ou quatro cordões de folha β antiparalela interagindo por loop de Ω.

(A) estrutura molecular do monômero POL. (B) de carcinoma do cólon Caco-2 As células, carcinoma do colo do útero células HeLa, células A549 do cancro do pulmão de células não-pequenas, carcinoma hepatocelular HepG

2 e 7721 células, as células MCF-7 de carcinoma da mama, células de melanoma A375 foram tratadas com diferentes concentrações de POL durante 24 h, e o IC

50 valores foram quantificados por ensaio MTT (média ± SEM,

N

= 3). (C) As células A549 foram tratadas com diferentes concentrações de POL, e, em seguida, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio de MTT na hora indicada (média ± SEM,

N

= 3). (D) várias concentrações de pol foi pré-incubado a 37 ° C durante 30 min com manose (1-3), manose (1-6) e manose (1-3; 1-6), e depois tratou-se com células A549 para 24 h. A proporção de inibição celular foi medida por ensaio MTT (média ± SEM,

n

= 3).

efeitos citotóxicos de POL em células A549

O inibidor do crescimento efeitos de POL foram avaliadas pelo ensaio de MTT sobre células cancerosas humanas, incluindo carcinoma do cólon células Caco-2, células HeLa de carcinoma do colo do útero, células A549 carcinoma de pulmão de células não pequenas, carcinoma hepatocelular HepG

2 e células 7721, o carcinoma da mama MCF- 7, células de melanoma A375, e o IC

50 valores foram de 47 ug /ml, 30 ug /ml, 23 ug /ml, 42 ug /ml, 38 ug /ml, 50 ug /mL e 26 ug /mL , respectivamente (Fig. 1B). Este resultado mostrou que POL foi mais sensível às células A549 carcinoma de pulmão de células não pequenas, e, portanto, as células A549 foram escolhidos para posterior exploração.

POL induzida morte celular A549 numa dose e modo dependente do tempo, e 0 ng /mL a 100 ug /mL POL exerceu efeitos inibidores potentes no crescimento de células A549 (Fig. 1C). Após 24 h de incubação com 23 ng /mL POL, a velocidade de inibição atingiu cerca de 50%.

A correlação entre actividade de ligação ao açúcar e anti-proliferativa da POL

O ensaio de inibição foi manose realizada para determinar a relação entre a actividade de ligação ao açúcar de pol e a sua propriedade anti-proliferativa. Diferentes concentrações de pol foi pré-incubada com manose α (1,3), manose α (1,6) e α manose (1,3:1,6) durante 30 min, respectivamente. Devido à actividade de ligação a manose de POL, todos os três tipos de manoses inibiu completamente a actividade hemaglutinante de POL. Como mostrado na Fig. 1D, os efeitos inibidores do crescimento de várias concentrações de POL foram perdidos no nível correspondente com o perder de actividade de ligação à manose, indicando que pode haver uma ligação estreita entre a atividade hemaglutinante e propriedade anti-proliferativa dos POL.

POL induz a apoptose em células A549

marcadas alterações morfológicas apoptóticos como formação de bolhas de membrana, a redução do volume celular e arredondamento, foram observados in /mL células A549 tratadas com POL 23 ug por microscopia de contraste de fase (Fig. 2A). Além disso, a fragmentação de ADN em núcleos considerável foi observada em células A549 induzida por pol, enquanto o grupo de controlo tratado com PBS mostraram normal, rodada e homogeneamente núcleos corados (Fig. 2B). No entanto, 23 ug /mL POL não resultou em morfologia apoptótica aparente em células não-cancerosas HELF após 24 h ou 48 h de tratamento (Fig. 2C e Fig. 2D). Estes resultados sugeriram que POL podem induzir selectivamente a apoptose de células A549, mas não pode provocar a apoptose de células HELF normais. Além disso, como mostrado na Fig. 2E, 23 ug /mL POL marcadamente levou ao aumento da Sub-L

proporção um fago de células A549 de forma dependente do tempo (b: 27,34 ± 4,1%, C: 39,27 ± 5,8%), indicando que POL apoptose induzida em células A549. Além disso, anexina V-FITC e PI dupla coloração foi realizada para classificar entre células vivas (anexina V /a IP), no início de apoptose (anexina V + /PI-), apoptose tardia (anexina V + /PI +) e células necróticas (anexina V – /PI +). Como mostrado na Fig. 2F, depois de 23 mcg /mL tratamento POL, a percentagem de células vivas foram gradualmente reduzidas (a: 98,25 ± 1,3%, b: 74,63 ± 4,7%, c: 55,71 ± 3,9%), enquanto a proporção de início (b: 15,34 ± 2,6%, C: 23,75 ± 2,8%) e tardia (b: 13,94 ± 3,6%, C:. 22,14 ± 4,5%), as células apoptóticas foram reforçadas com o aumento do tempo

(A549), as células a foram tratados com PBS (24 h) ou 23 mcg /mL POL para o tempo indicado, e as variedades morfológicas foram detectados por microscopia de contraste de fase e (B) microscopia de fluorescência (200 ×). (C) Depois de tratado com células HELF com PBS (24 h) ou 23 ug /mL POL para o tempo indicado, as variedades morfológicas foram detectadas por microscopia de contraste de fase e (D), microscopia de fluorescência (200 ×). (E) Diferentes fases percentagem de células A549 interferiram com 23 ug /mL POL durante 24 h ou 48 h foram medidos por citometria de fluxo. O grupo de controlo foi tratado com PBS durante 24 h. (F) As células A549 foram expostas a 23? G /mL POL durante 24 h ou 48 h, as proporções de apoptose precoce e tardia de apoptose foi medida por citometria de fluxo utilizando o ensaio de dupla marcação V-FITC /PI anexina. O grupo controle foi tratado com PBS durante 24 h.

POL desencadeia a autofagia em células A549

A fim de detectar a formação de vacúolos autofágicos, intensidade de fluorescência MDC de 23 mcg /mL POL células HELF durante 24 h ou 48 h A549 tenha sido tratada com e foram analisadas por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 3A, vacúolos autofágicos foram formadas em células A549 que foi caracterizado por um aumento da intensidade de fluorescência MDC, indicando a presença de morte celular autophagic. No entanto, na Fig. 3B, a intensidade fluorescente de células HELF MDC tratadas com POL não aumentou nem após 24 horas, nem 48 h, sugerindo vacúolos autofágicos não foram formadas em células HELF induzida por AOP. Poderíamos incluem POL que pode induzir selectivamente a morte celular em células A549 autophagic mas não em células HELF. Através da utilização adicional de coloração laranja de acridina, a formação de organelos vesiculares ácidas (AVO) em células A549 desencadeou-pol foi demonstrado (Fig. 3C). Desde aprimoramento e transformação de LC3I para LC3II Beclin1 eram as características da autofagia, foram detectadas as expressões de Beclin1 e LC3 em células A549 induzida por POL. Como mostrado na Fig. 3D, POL induziu o aumento dependente do tempo de beclin 1 nível e acumulação da LC3-II em células A549. Posteriormente, as expressões de Beclin1 e LC3 foram derrubados usando siRNAs específicos (Fig. 3E). A transfecção com Beclin1 ou LC3 siARN diminuiu a inibição do crescimento celular induzida por POL (Fig. 3F). Todos estes resultados indicaram que POL autofagia induzida em células A549.

células A549 (A) e células HELF (B) foram tratados com PBS (24 h) ou 23 ug /mL para POL tempo indicado, e a MDC intensidade da fluorescência foi analisada por citometria de fluxo. As células A549 (C) foram tratados com PBS (24 h) ou 23 ug /mL para POL tempo indicado, e a intensidade de fluorescência laranja de acridina foi medido por citometria de fluxo. (D) As células A549 foram tratadas com 23 ug /mL para POL tempo indicado, seguido por análise de transferência de Western para detecção de níveis fosforilados-Beclin1 e LC3. β-actina foi utilizado como um controlo de carga igual. As células A549 (E) foram transfectadas com Beclin1, LC3 ou ARNsi de controlo, durante 24 h, a níveis LC3 Beclin1 e foram examinados por análise de mancha de Western. (F) As células A549 foram transfectadas com Beclin1, LC3 ou ARNsi de controlo, durante 24 h, seguida de estimulação com ou sem 23 ug /ml de pol por 24 h, a razão de inibição do crescimento celular foi medida pelo ensaio de MTT (média ± SEM,

n

= 3).

POL induz apoptose dependente da caspase em células A549

Como mostrado na Fig. 4A, após tratamento autophagic inibidor 3-MA, 23 ug /mL POL aumentou significativamente a actividade da caspase-3 de um modo dependente do tempo, indicando apoptose induzida por POL ocorre através da activação de executores apoptóticos comuns, tais como a caspase-3. Além disso, análises de Western blot após autofagia foi inibida mostraram que após o tratamento com 23 ug /mL POL para o tempo indicado, caspase-3 clivada e -9 foram, uma vez que pro-caspase-3 e -9 foram diminuiu enquanto caspase-3 clivada e foram -9 aumentou (Fig. 4B a). Além disso, a regulação positiva de proteínas Bax e Lance pró-apoptóticas bem como a sub-regulação de anti-apoptótica de Bcl-2 e Bcl-X

proteínas G foram observadas após o tratamento POL. Além disso, 23 ug /mL POL conduziu à clivagem de PARP a partir de uma banda de 116 kDa a 89 kDa um fragmento com o aumento do tempo (Fig. 4B b), e citocromo

C

foi libertado de mitocôndrias no citoplasma após o tratamento POL (Fig. 4B c). Como mostrado na Fig. 4C e a Fig. 4D, quando autofagia foi suprimida por 3-MA, POL diminuiu a intensidade de fluorescência rodamina 123 de uma maneira dependente do tempo. Além disso, a clivagem de caspase-3 e -9 podia ser resgatado na presença de 10 uM de Z-VAD-fmk em células A549 induzida-Pol (Fig. 4E). E, Sub-G

1 análise proporção celular e anexina V /PI dupla coloração foram também demonstrou que inibidor de caspase z-VAD-fmk poderia proteger células A549 de morte celular por apoptose (Fig. 4F e Fig. 4G). Todos estes resultados indicam claramente que a apoptose induzida através de POL via mediada por mitocondrial em células A549.

(A) Efeitos de 23? G /mL POL sobre a activação de caspase-3 com o aumento do tempo (média ± SEM,

N

= 3) (* P 0,05

0 h vs

grupo).. (B) 23 ug /ml POL clivagem induzida de caspase-3, caspase-9 (a). POL resultou na clivagem de PARP, a sobre-regulação de pró-apoptótica Bax e Bid, bem como a sub-regulação de anti-apoptótica de Bcl-2 e Bcl-X

L com tempo de cultura (b). Os lisados ​​celulares foram fraccionados para isolar citoplasmática e mitocôndrias em bruto, e a presença de citocromo

C

nas fracções citosólica e mitocondrial foi avaliada por análise de WB utilizando o cocktail de anticorpos ApoTrack. β-actina foi utilizado como um controlo de carga igual citosol, enquanto proibitina foi utilizado como controlo mitocôndrias de carga (C). (C) A influência de 23 ug /mL POL sobre a integridade das membranas mitocondriais foi medida por coloração com rodamina 123, e a intensidade da fluorescência foi analisada por citometria de fluxo. (D) As variedades de membranas mitocondriais potencial foram ainda apresentados como diagrama de barras (média ± SEM,

n

= 3) (** p 0,001

vs

grupo de controle, ns: Não. significativa

vs

. grupo de controle). (E) Análise de transferência de Western de pró-caspase 3, caspase 3 clivada e pró-caspase9 e níveis caspase9 clivado em células A549 tratadas com 23 ug /ml sozinho ou em combinação com 10