Abstract

propriedades biofísicas e bioquímicas do microambiente regular as respostas celulares, tais como crescimento, diferenciação, morfogênese e migração em células normais e cancerosas. Desde bidimensionais (2D) culturas não possuem as características essenciais do microambiente celular nativo, culturas tridimensionais (3D) foram desenvolvidos para melhor imitar a matriz extracelular natural. Até à data, sistemas de cultura 3D têm contado principalmente de colágeno e hidrogéis Matrigel ™, permitindo que apenas um controlo limitado sobre a rigidez da matriz, degradabilidade proteolítica e densidade de ligante. Em contraste, os hidrogéis de bioengenharia nos permitem de forma independente sintonia e sistematicamente investigar a influência desses parâmetros sobre o crescimento e diferenciação celular. Neste estudo, o polietileno glicol (PEG) hidrogéis, funcionalizado com o ácido arginina-glicina-aspártico motivos (RGD), motivos de ligação celular comuns em proteínas de matriz extracelulares, e metaloproteinases da matriz sítios de clivagem (MMP), foram caracterizados quanto à sua rigidez, propriedades de difusão e capacidade para suportar o crescimento de células de câncer de próstata LNCaP andrógeno-dependentes. Verificou-se que as propriedades mecânicas modulada a cinética de crescimento de células LNCaP no hidrogel de PEG. Em períodos de cultura de 28 dias, as células LNCaP sofreu alterações morfogênicas, formando estruturas semelhantes a tumores, na cultura 3D, com hipóxica e núcleos apoptóticos. Nós ainda comparado os níveis de expressão de proteínas e de genes entre as culturas 3D e 2D após estimulação com o andrógeno sintético R1881. Curiosamente, a cinética de R1881 estimulada do receptor de androgénio (AR), a translocação nuclear diferiram entre culturas 2D e 3D, quando observada por coloração imunofluorescente. Além disso, estudos de microarranjos revelou que as alterações nos níveis de genes que respondem a androgénios mediante tratamento R1881 expressão diferiam muito entre culturas 2D e 3D. Tomados em conjunto, a cultura de células de LNCaP em hidrogeles de PEG sintonizáveis ​​revela diferenças nas respostas celulares a estimulação de androgénio entre os ambientes 2D e 3D. Portanto, sugerimos que o sistema de cultura 3D apresentado representa uma poderosa ferramenta para o teste de drogas de câncer de próstata de alto rendimento que recapitula microambiente do tumor

Citation:. Sieh S, Taubenberger AV, Rizzi SC, Sadowski M, Lehman ML, Rockstroh Um, et ai. (2012) Caracterização fenotípica de células do cancro da próstata LNCaP cultivados dentro de um bioengenharia Microenvironment. PLoS ONE 7 (9): e40217. doi: 10.1371 /journal.pone.0040217

editor: Elizabeth Wilson, da Universidade de Carolina do Norte em Chapel Hill, Estados Unidos da América

Recebido: 17 de novembro de 2011; Aceito: 06 de junho de 2012; Publicação: 05 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Sieh et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela Universidade de Tecnologia de Queensland arranque subvenção para cadeira Prof. DW Hutmacher, Fundação Câncer de próstata da Austrália, o australiano Canadian Prostate Cancer Research Alliance, Australian Prostate Cancer Research Centre-Queensland e concessão NHMRC. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata (PAC) é uma das doenças malignas mais prevalentes entre os homens nos países ocidentais. A taxa de sobrevida em 5 anos para os homens diagnosticados com CaP localizada aproxima de 100%; Considerando que, o prognóstico piora rapidamente mediante a progressão da PAC a doença avançada e metastática [1] – [2]. Apesar de avanços nos métodos e tratamentos de detecção, PAC continua a ser uma das principais causas de morte por câncer em homens. Portanto, é importante para obter uma maior compreensão da progressão de localizada CaP avançado usando sistemas fisiológicos relevantes. Tal como muitas outras células de cancro, células CaP têm sido extensivamente estudados em culturas de duas dimensões (2D), através do qual um entendimento básico da biologia do cancro significativa foi adquirida. No entanto, em tecidos nativos, as células são incorporados na matriz extracelular (ECM) que proporciona não só o suporte de arquitectura, mas também sinais químicos e mecânicos para as células [3] – [4]. Recentemente, a importância das propriedades mecânicas do microambiente do tumor tem sido cada vez mais reconhecida. Em geral, o tecido canceroso e o seu estroma são mais rígidos do que os tecidos não malignos, devido à deposição e remodelação de ECM anormal no estroma [5] – [7].

In vitro

estudos e alguns

in vivo

estudos têm demonstrado que a rigidez da matriz circundante pode aumentar o crescimento de células de cancro, modulam a sinalização celular e facilitar a invasão de células [8] – [11]. Considerando o papel vital de rigidez matriz, restrições geométricas artificiais ea alta rigidez imposta sobre células em 2D de plástico de cultura de tecidos pode afetar o crescimento do tumor, aderência, polaridade celular, morfologia, migração e mecanismos de proteólise [12] – [15].

nos últimos anos, numerosos estudos demonstraram que estudam tumores em 3D melhores reproduz

in vivo

características de crescimento e resistência contra agentes quimioterápicos do que uma abordagem 2D [16] – [18]. Os modelos 3D Matrix mais comumente usados ​​são derivados de animais reconstituído extrato de membrana basal, Matrigel ™ [17], [19] – [20], e colágeno tipo cauda de rato matrizes I [21] – [24]. Embora estas matrizes de origem natural tem propriedades biológicas ECM semelhante, as suas características inerentes limitam a flexibilidade de ajustar a rigidez da matriz sem afectar simultaneamente outras propriedades da matriz, tais como degradabilidade proteolítica e densidade de ligando. Além disso, Matrigel ™ mostra as variações de lote para lote, o que diminui a reprodutibilidade dos experimentos e comparabilidade dos conjuntos de dados entre diferentes laboratórios. Para simplificar as interacções celulares complexas de outra forma dos vários componentes que ocorrem em matrizes de origem natural, existe um interesse crescente na utilização de matrizes modificadas com características biológicas e bioquímicas específicas de ECM naturais [25] – [28]. Essas matrizes biomiméticos permitir um estudo mais sistemático do impacto de certos componentes ou propriedades do microambiente do tumor em células cancerosas. Portanto, abordagens emergentes em ciência biomaterial têm-se centrado no desenvolvimento de matrizes sintéticas tais como matrizes derivadas de hyaluronon ou de alginato para células cancerosas de cultura [25] – [28]. Outro exemplo é hidrogeles à base de PEG-que são inertes-se em termos de desencadeamento vias de sinalização celular, mas pode ser equipado com (por exemplo, locais de degradação proteolítica) bioquímicos e funcionalidades biológicos (por exemplo, motivos RGD de uma forma controlada) [29]. De um modo vantajoso, a rigidez de tais hidrogeles podem ser ajustados precisamente, independente da sua sensibilidade e ligando celular proteolítica densidade.

Anteriormente, e outros têm utilizado MMP-sensíveis hidrogeles à base de PEG-em que motivos RGD são incorporados numa densidade definida [13], [30] – [32]. Os motivos RGD proporcionar locais para a ligação de células através de integrinas, e as sequências de clivagem de MMP permitir que as células para degradar a matriz, o que cria um espaço para a proliferação e migração celular. Para este fim, uma completa caracterização fenotípica de células cultivadas dentro de CaP este ECM biomimética não foi relatada. Neste estudo, o objetivo foi estabelecer e validar um sistema de cultura 3D para células LNCaP que permite a modelagem da formação de tumores avascular fase inicial. Para fazer isto, foi investigado o efeito da rigidez do hidrogel sobre o crescimento celular. Em seguida, examinámos a morfologia, expressão do gene e a síntese de proteínas das células LNCaP crescidas em hidrogéis 3D em comparação com culturas 2D convencionais. Nós também usado este sistema de cultura 3D para estudar os efeitos do androgénio sintético, R1881, na sinalização de AR, em comparação com culturas 2D [33] – [34]

Nossas descobertas fornecem informações sobre o papel do microambiente. na modulação do comportamento celular e molecular de células de cancro. Além disso, revelam diferenças nas respostas celulares a andrógenos entre culturas 2D e 3D. Este modelo é um trampolim para o desenvolvimento de sistemas de cultura 3D replicar o

in vivo

tumor microambiente, permitindo a criação de poderosas ferramentas para compreender melhor CaP biologia, em particular em resposta aos andrógenos.

Resultados

propriedades mecânicas e de difusão de hidrogéis biomiméticos são dependentes do PEG conteúdo

para imitar a fase inicial de formação de tumores PAC em 3D, nos propusemos a células LNCaP cultura em PEG biomimético hidrogeles. Os precursores de PEG conjugados com locais de clivagem de MMP e motivos RGD foram incorporados à rede de hidrogel para conferir características biomiméticos essenciais da ECM naturais (Figura 1A). Dado que as propriedades mecânicas do hidrogel são conhecidos por influenciar o crescimento, morfologia e fenótipo invasivo das células cancerosas [5], [10], [35], que em primeiro lugar destinada a optimizar a rigidez do hidrogel de cultura de células. hidrogeles de PEG isentos de células de diferentes graus de rigidez foram preparados através do ajuste do conteúdo de PEG a 1.5, 2, 2.5% (w /v). A rigidez do hidrogel foi determinada por ensaios de compressão simples usando um microtester (Figura 1B, esquerda) e de microscopia de força atómica (AFM) medições de recuo (Figura 1C, esquerdo) que foram convertidos para uma curva de tensão-deformação (Figura 1B, meio) .

(a) um esquema que mostra a preparação de hidrogeles biomiméticos. As células LNCaP foram misturados com os precursores de PEG que contêm locais de clivagem de MMP péptidos RGD e antes da polimerização FXIII-catalisada. (B) de rigidez global de hidrogéis isentos de células com diferente conteúdo de PEG (w /v) foi medida utilizando um microtester. Uma curva de tensão-deformação representante registada para um gel de 2% de PEG. O (elástica), módulo de Young, E, foi calculada a partir do declive da linha ajustada à curva de tensão-deformação em 9-12% de deformação (meio). Um gráfico de dispersão mostrando módulos de Young medida para diferentes hidrogéis PEG (direita). As medianas são indicados pelas barras vermelhas. (C) a rigidez local de hidrogéis isentos de células com diferentes conteúdos de PEG (w /v) foi medida usando microscopia de força atômica (AFM). A forma piramidal cantilever AFM foi utilizado para realizar medições de recuo. Uma força representativa versus a curva ponta-sample-separação é mostrada abaixo o esquema AFM. A linha vermelha representa o ajuste usado para aproximar a curva abordagem com um modelo de recuo hertziana. módulos de Young medidos por um hidrogel de PEG 2% é distribuído normalmente na gama de 4 kPa (meio). gráfico de dispersão mostra os medianos módulos de Young medidos para diferentes hidrogéis (direita). As barras vermelhas representam as medianas. Ambos os microtester e AFM recuo medições produzir módulos semelhantes de Young e mostram um aumento linear da rigidez com conteúdo de PEG. (D) Os diagramas de caixa mostram os coeficientes de difusão, D medido para o E133 corante alimentar (794 Da) e FITC-BSA (66 kDa) em hidrogéis isentos de células em diferentes conteúdos PEG. Os valores de D para E133 são uma ordem de magnitude maior do que para FITC-BSA. Pelo menos três amostras foram medidos a partir de três experiências independentes.

Enquanto o microtestor investiga as propriedades elásticas globais dos hidrogeles de PEG, as medidas de AFM de recuo se obter informações sobre o seu local de distribuição de rigidez (Figura 1C). Ambos os métodos revelou um aumento linear nos módulos de elasticidade com o aumento de conteúdo de PEG e indicado módulos elásticos semelhantes, variando entre cerca de 0,8 kilopascal (kPa) a 10 kPa para os hidrogeles de PEG de 1,5% e 2,5%, respectivamente (Figura 1B e 1C, direita) . medidas de AFM revela uma distribuição homogénea de módulo de Young local, E sobre as sondadas hidrogéis (Figura 1C, no meio). Quando os hidrogéis 2,0% foram testadas usando o microtester antes e depois de mais do que 4 semanas de cultura, não se observaram alterações significativas na rigidez global da matriz (2,5-4,2 kPa), o que foi consistente com a variação nos hidrogéis testados% 2 ( Figura S1). Como relatado anteriormente, em culturas de células 3D dentro matrizes semelhantes [5], [10], [35], isto indica que estes biomimética de hidrogel à base de PEG são apenas localmente degradado pelas células incorporadas, enquanto que a rigidez global não é afectado através da analisados período de crescimento.

as alterações no conteúdo de PEG são esperados para alterar o tamanho de poro dos hidrogeles de PEG [36], que poderia afectar a transferência de moléculas pequenas, tais como o androgénio sintético R1881, e também os factores de crescimento presentes na meio em nossos experimentos. Para estimar a difusão de R1881, medimos o coeficiente de difusão D, do corante alimentar E133 (792 Da), que tem um peso molecular mais elevado do que R1881 (284 Da). Descobrimos que os valores médios de difusão diminuiu com o aumento do teor de PEG (Figura 1D) de 2,99 ± 0,06 × 10

-6 cm

2 /s para 1,5% hidrogéis PEG para 1,9 ± 0,13 × 10

– 6 cm

2 /s para 2,5% hidrogéis PEG. Para testar se os factores de crescimento essenciais, tais como o factor de crescimento de fibroblastos, factor de crescimento endotelial vascular e factor de crescimento derivado de plaquetas (20-50 quiloDalton, kDa) também pode penetrar no hidrogel, investigou-se a difusão da fluoresceína isotiocianato de albumina de soro bovino conjugada (FITC BSA) (66 kDa), que tem um peso molecular mais elevado do que estes factores de crescimento. O coeficiente de difusão de FITC-BSA foi inferior em comparação com E133 e diminuíram com o aumento de conteúdo de PEG (Figura 1D). valores D para 1,5-2,5% hidrogéis PEG (1,5-3,0 × 10

-7 cm

2 /s) estão dentro da mesma ordem de grandeza (6 × 10

-7 cm

2 /s) relatado por Ramanujan

et al (2002) e Erikson

et ai (2008) medição de difusão de BSA em géis de colagénio mais suaves [37] -.. [38]. Quando hidrogeles de PEG foram incubadas com FITC-BSA durante 24 horas, observou-se uma penetração generalizada da FITC-BSA (Figura S2). A partir destes resultados pode-se concluir que, embora a transferência de R1881 e factores de crescimento pode ser retardado em geles com maior conteúdo de PEG, o tamanho de poro de todos os géis é suficientemente grande para proporcionar células incorporados com factores solúveis a partir do meio de cultura.

a proliferação de células LNCaP dentro hidrogéis biomiméticos é influenciada pelo teor de PEG e rigidez de hidrogéis

em seguida, para avaliar o efeito da rigidez da matriz sobre a proliferação celular, foi realizada cultura de células de LNCaP em 1,5, 2,0 e 2,5% hidrogéis mais de 28 dias (Figura 2A, painel superior, direita). culturas em monocamada (tempo de duplicação, Td = 27 hr) cresceu exponencialmente até ao dia 5 e começou a estabilizar depois (Figura 2A, painel superior, à esquerda). Pelo contrário, as células proliferaram mais lento em 1,5% (Td = 54 h) e 2% (Td = 58,5 h) hidrogeles de PEG. O crescimento exponencial ocorreu entre os dias 7 e 14 em culturas 3D (Figura 2A, painel superior, direita). células LNCaP continuou a proliferar, pelo menos, até 28 dias nos hidrogéis de 2,0%, enquanto que os números de células máximos foram atingidos após 14 dias nos hidrogéis 1,5%. As taxas de crescimento mais elevadas no mais macia 1,5% de hidrogel em comparação com o hidrogel de 2,0% pode ser devido à tensão mais baixa exercida sobre as células por o hidrogel circundante mais suave [39] – [40]. A curva de crescimento sigmoidal observamos é comparável ao observado crescimento de xenoenxertos de LNCaP com a evidência de crescimento lento, na fase inicial, o crescimento exponencial da fase intermédia e abrandamento do aumento na fase posterior [41] – [46]. Por outro lado, nenhum crescimento foi detectada em 2,5% de hidrogeles como confirmado por coloração vivo-morto (Figura 2A, painel inferior), revelando a presença de células predominantemente não viáveis ​​no hidrogel de 2,5% no dia 24. imagens de campo claro que mostrou as células foram capazes de formar colónias no 1,5 e 2,0%, mas não em 2,5% de hidrogéis.

(a) curvas de crescimento de células LNCaP mais de 7 dias para as culturas 2D (esquerda) e 28 dias para as culturas em 3D ( direita) em meios normais de crescimento, medida pela quantidade total de ADN (média ± SE). Em culturas 2D células proliferam muito mais rápido atingindo confluência dentro de 7 dias (painel superior, à esquerda). O perfil de crescimento das células é dependente das propriedades mecânicas das matrizes de PEG de bioengenharia, onde a taxa de crescimento é mais elevado em 1,5%, seguido de células cultivadas em 2% de hidrogeles (painel superior, direita). Sem a proliferação celular é detectada nos hidrogéis mais duras (2,5%). exame live-mortos foi realizada utilizando coloração com iodeto de diacetato-propídio fluoresceína no dia 24 de células LNCaP cultivados em diferentes conteúdos PEG (painel inferior). A coloração vivo-morto revela que a maioria das células são viáveis ​​(verde) em ambos os 1,5 e 2,0% hidrogéis, mas não viável (vermelho) em 2,5% de hidrogéis. As imagens foram tiradas com CLSM (10 ×, 0,4 NA). as imagens de campo claro também confirmam que as células em 2,5% de hidrogéis não formaram colónias como observado em 1,5% e 2,0% no dia 28. hidrogéis (B) (painel superior) um representante projecções CLSM 3D de colónias LNCaP marcadas com faloidina (actina, vermelho ) /DAPI (núcleos, azul) a partir do dia 7 ao dia 28 (20 ×, 1,0 NA). Colónias são mais arredondadas no dia 7 e no dia 14, mas tornar-se agregados irregulares de dia 21 em diante. Os diagramas de caixa de tamanho da colónia e factor de forma analisados ​​a partir de seis imagens CLSM (painel de baixo) mostram aumento significativo no tamanho do esferóide e diminuição do factor de forma (p 0,001) no dia 28 relativamente ao dia 7 culturas são detectados. (C) Uma secção de histologia representativa de 28 dias as culturas revelam a formação de “dedos” invasoras (seta) que penetra o hidrogel circundante (esquerda). A H E mancha (meio) mostra um núcleo oco. mancha imuno-histoquímica da caspase 8 (direita) confirma células apoptóticas no interior do núcleo (castanho). parcelas (D) de dispersão de tamanho da colônia, número de células e tamanho do núcleo se for o caso analisado a partir de 10 mm de espessura cortes histológicos. Isto mostra que cada tamanho das colónias aumenta linearmente com o número de células. tamanho do núcleo também aumenta linearmente com o tamanho da colónia. Pelo menos três experiências independentes foram realizados para cada análise. Barras de escala: (A, à esquerda, B) de 250 mm, (A, direita) 100 mm e (c) 50 mm

Com base neste estudo proliferação, temos selecionados 2,0% hidrogéis PEG para. a realização de experiências subsequentes. Até à data, a rigidez local no tecido glandular da próstata é desconhecida. No entanto, a rigidez dos géis 2% de 4 kPa estão dentro da faixa relatada de tecidos moles (1-10 kPa) e tecido glandular mamário (4 kPa) [5], [47].

esferóides LNCaP em hidrogéis biomiméticos variar morfológica e fenotipicamente a partir de células LNCaP em culturas 2D

em seguida, examinamos a morfologia das células LNCaP cultivados por até 28 dias em 2% hidrogéis PEG biomiméticos. imagens confocais de faloidina e 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI) hidrogeles coradas (Figura 2B, painel de topo e a Figura S3, esquerda) e de lapso de tempo de videomicroscopia (Vídeo S1) mostrou que as células individuais proliferaram em colónias até 200 mícrons de diâmetro no hidrogel. Estas colônias se assemelhava a morfologia das colónias LNCaP cultivadas em Matrigel ™ (Figura S3, à direita) como nós e outros têm descrito anteriormente [48] – [49]. O tamanho da colônia aumentou a partir do dia 7 ao dia 21 e manteve-se constante a partir daí (Figura 2B, painel inferior). Os agregados de células foram de forma esférica, até ao dia 21, subsequentemente, tornando-se irregular, tal como confirmado por uma diminuição significativa no factor de forma de 28 dias (Figura 2B, painel inferior). O faloidina-DAPI e hematoxilina e eosina (H E) colorações de cortes congelados revelou que o dia 28 colônias formadas estruturas ‘finger-like’ e muitas vezes apresentado um núcleo central oco (Figura 2C). A presença de células apoptóticas nesta região, tal como detectado por meio de caspase 8 de coloração, foi também observada. Este aumento do número de células apoptóticas no interior do núcleo, que tenha sido também descrito em outros

In vitro

culturas tumorais 3D [17], [19]. Além disso exame histológico das culturas em 3D que suporta o aumento no tamanho de cada colónia era proporcional ao número de células e o tamanho dos núcleos formados (Figura 2D). formações de núcleo apoptóticos foram observados mais frequentemente nos dias 28 culturas em comparação com os outros pontos de tempo (dados não mostrados).

Uma vez que a maior parte da caracterização anterior do fenótipo celular LNCaP é baseada em culturas 2D, nos propusemos a examinar a morfologia de células de LNCaP em cultura 3D. Como mostrado na Figura 3A, as células LNCaP em 2D foram espalhados com morfologia fusiforme. Nas culturas em 3D No entanto, as células foram dispostos em agregados celulares compactos, após o que as células individuais adoptou uma morfologia mais arredondada em comparação com células em monocamada. Dentro da colónia de LNCaP, o marcador de E-caderina epitelial (Ecad) co-localizada com os contactos célula-célula, enquanto que em culturas 2D Ecad foi mais uniformemente distribuído na superfície da célula. A seguir, realizada por coloração com marcador hipoxia Pimonidazole em ambas as culturas para avaliar a disponibilidade de oxigénio para as células, a detecção de um nível mais elevado em 3D hipoxia do que em culturas 2D. Esta observação é consistente com xenoenxertos de tumores e tumores clínicos onde hipoxia e a apoptose /necrose central é uma característica comum em tumores sólidos vascularizados mal e culturas anterior esferóides 3D independentes de tipos de células [42], [50] – [54]. O nosso estudo mostrou que nas culturas anteriores 3D (dia 14), onde o tamanho do esferóide foi menor (Figura S4), menos coloração Pimonidazole foi evidente em comparação com o dia 28 culturas (Figura 3). Isto sugere que os agregados multicelulares, dependendo do tamanho das colónias pode influenciar a transferência de oxigénio no interior da colónia. Do mesmo modo, quando as células LNCaP foram cultivadas em géis mais macio (por exemplo colagénio I e Matrigel ™), a hipoxia foi detectado com coloração Pimonidazole no dia 24 de crescimento da cultura (Figura 3B). Esferóides em culturas em suspensão também encontrar depleção de oxigénio, especialmente em direcção ao centro dos esferóides [42], [50], [55]. Isto indica que a limitação de transferência de oxigênio não é específico para a matriz de hidrogel PEG, mas também é susceptível de ser influenciada pelo contato célula-célula estreita e alta densidade celular em culturas 3D.

(A) Uma comparação de culturas 2D (dia 6) e cortes histológicos de culturas 3D (dia 28) revela diferenças na morfologia celular e fenótipo. organização do citoesqueleto (actina, vermelho) de células em culturas 2D revela uma propagação para fora e morfologia celular alongado (painel superior). O tamanho da célula e do núcleo (azul) de culturas 2D é maior do que as culturas em 3D. Nas culturas em 3D, as células adotar uma morfologia de paralelepípedos e arranjo celular compacto. Eles também formam extensa contato célula-célula dentro da colônia. marcador epitelial, a E-caderina (Ecad, verde) está localizada na membrana celular e em contactos célula-célula para ambas as culturas (painel do meio). A hipoxia coloração com Pimonidazole (verde) indica que existem menos células hipóxicas em culturas 2D relativas a culturas 3D (painel inferior). A hipoxia é detectada dentro da colónia LNCaP na presença de um núcleo apoptótico (seta). colorações (B) Pimonidazole realizada em células LNCaP cultivadas nos hidrogeles de PEG, colagénio I e Matrigel ™ para 24 dias mostram presença de hipoxia, em todas as matrizes. imagens CLSM foram tomadas na ampliação de 40 × e 1,25 NA. Barras de escala: (a) 75 mm e (B) 100 mm

proteína e mRNA níveis de marcadores LNCaP em culturas 3D diferem das culturas 2D por estimulação com 1 nM R1881 por 48 h

.

Durante a fase inicial da PAC, a grande maioria dos tumores são andrógeno dependente e sensível; Além disso, a via de sinalização AR desempenha um papel importante no desenvolvimento do tumor e é importante em toda a progressão [56] – [57]. Por este motivo, as células LNCaP dependente de androgénio são amplamente utilizados em culturas 2D para o estudo do receptor de androgénio (AR) de sinalização, o qual é activado por androgénios e análogos, tais como R1881. A fim de expandir o nosso conhecimento da resposta LNCaP para R1881 em experimentos baseados em cultura 2D, investigamos os efeitos de R1881 sobre a expressão do marcador PAC em culturas 3D (Figura 4). coloração de imunofluorescência revelou translocação de AR para o núcleo de células em culturas 2D e 3D após 7 h de tratamento 1 nM R1881 (Figura 4A). Está bem estabelecido na cultura 2D, uma vez que se liga a AR R1881, é transportado para o núcleo onde se inicia a transcrição de genes alvo, tais Prostate Specific Antigen /calicreína 3 (PSA) [58]. Nosso estudo preliminar indicou que os genes-alvo AR, tais como PSA, foram induzidos em níveis mais elevados de tratamento R1881 após prolongada (após 36 h), tanto culturas 3D (Figura S5A) 2D e. Por isso, escolhemos para este estudo de 48 h de tratamento R1881 para ambas as culturas. Curiosamente, apesar de culturas 2D e 3D responderam ao tratamento R1881 48 h, como evidenciado por um aumento no ARNm e os níveis de proteína de PSA, a localização de AR no núcleo da célula foi detectado em menor medida nas culturas em 3D, em comparação com culturas 2D. No entanto, nem a localização nem a intensidade do marcador epitelial luminal, Cytokeratin 8 (CK8) foi afetada pelo tratamento R1881 em culturas 2D ou 3D.

(A) colorações de imunofluorescência de células LNCaP após 7 h tratamento com R1881 show de co -localization da AR e da célula núcleo tanto em 2D (dia 6) e as culturas 3D (dia 28) (painel superior). Correspondente localização AR em ambas as culturas é mostrada em imagens em tons de cinza (painel inferior). (B) Os fenótipos celulares de 2D (dia 6, painel esquerdo) e 3D (dias 28, painel da direita) cultivadas em culturas de androgénio empobrecido meios ou R1881 suplementado meios (48 h) foram comparados por colorações imunofluorescentes. Proteínas de interesse estão em verde, agindo em vermelho e núcleo em azul. Em culturas 2D, AR está localizada no núcleo e no citoplasma de PSA após estimulação R1881. Sem tratamento, a AR permanece no citoplasma e o PSA não é detectado. O marcador epitelial luminal, CK8 é detectada em ambas as culturas, independentemente da condição do tratamento. Em culturas 2D, CK8 manchas claramente as fibras de filamento, enquanto em 3D, CK8 está localizada na borda da célula. Nas culturas em 3D, extranuclear AR localização é observada em ambos os não tratados e R1881 tratados agregados multicelulares. PSA também é produzido em abundância em R1881 culturas tratadas com 3D, mas apenas a um nível muito baixo quando não tratada. regiões ampliadas de cada coloração e cultura condição específica (caixas brancas) são mostrados abaixo as imagens correspondentes. CLSM imagens foram tiradas a 60 × ampliação (1,4 NA) para A e 40 × ampliação (1,25 AN) para as barras de B. Escala:. (A) 30 uM, (B) 75? M e 25? M (regiões ampliadas)

Para examinar o efeito de R1881 sobre os níveis de proteínas, que voltada para a expressão de AR, PSA e CK8 através da realização de análise de Western blot. Após tratamento R1881, os níveis de PSA e Ck8 foram reforçadas em culturas 2D e 3D, em comparação com controlos não tratados etanol embora a elevação da proteína CK8 por R1881 não foi aparente em imunofluorescência em culturas 2D e 3D, o qual pode ser atribuída a uma falta de sensibilidade (do anticorpo utilizada) (Figura 5A, B). Curiosamente, em culturas 2D tratados, os níveis de proteína AR estavam elevados quando comparados com os controlos não tratados, indicativo de estabilização de ligando ligado AR e /ou um aumento na produção de AR [59] – [60]. Em contraste, não houve mudanças significativas foram detectadas em culturas 3D. Tomados em conjunto, isto sugere uma regulação diferencial da expressão da proteína AR em culturas 2D e 3D, em resposta a R1881. O efeito de R1881 sobre os níveis de ARNm em culturas 2D e 3D foi adicionalmente investigada por quantitativo em tempo-real da Polimerase Chain Reaction (qRT-PCR). De acordo com os níveis de proteína do aumento, e os níveis de ARNm de PSA CK8 aumentou em ambas as culturas (Figura 5C). À semelhança da análise western blot, o nível de mRNA AR não foi significativamente afetada pelo tratamento R1881 em culturas 3D, mas mostrou uma tendência de queda, quando o tratamento foi prolongado (Figura S5B). Apesar de maior expressão do AR em culturas 2D em comparação com as culturas em 3D, a expressão do PSA foi semelhante entre as culturas, como mostrado na Figura 5C. Curiosamente, em culturas não tratadas, o nível de ARNm de PSA linha de base foi significativamente mais elevada no 3D em relação a culturas 2D. os níveis de AR e de mRNA PSA em xenoenxertos de tumores LNCaP de ratos intactos não obesos diabéticos /Severe Combined imunodeficiência (NOD /SCID) (Figura S5C) foram comparáveis ​​ao R1881 estimulado culturas 3D, mas não as culturas 2D. Assim, nossos resultados indicam que as nossas culturas 3D reflictam melhor os

In vivo

tumores.

(A) Um Western blot representativo revela um aumento do nível de todas as proteínas investigadas em culturas 2D quando tratados com R1881 em comparação com os não tratados (controlos de etanol), enquanto que em culturas em 3D, apenas a PSA e CK8 são significativamente elevada. (B) proporção de sinal de proteínas em relação ao ácido a-tubulina de transferências de Western de R1881 grupos tratados e de controlo (etanol) -R1881 são apresentados como média ± SE. As quantificações proteína apoiar as alterações apresentadas em imunoblots acima. (C) qRT-PCR representando a expressão de marcadores de células LNCaP (média ± SE) onde PSA e CK8 são sobre-reguladas ao nível do ARNm por tratamento em culturas 2D e 3D, quando comparado com os grupos não tratados, em 2D ou 3D. A AR só é elevada em culturas 2D. Diferença significativa (p 0,05) entre as amostras tratadas e não-tratadas dentro de grupos semelhantes (2D ou 3D culturas) é indicado por (*) e entre o tratamento semelhante de diferentes grupos são indicados por (Δ). Triplicatas foram analisados ​​a partir de pelo menos três experiências independentes.

resposta androgênica das células LNCaP em culturas 3D é alterada em comparação com culturas 2D sob um R1881 privados condição

Tendo em conta as referidas diferenças de PSA e de expressão AR e AR localização entre 2D e 3D culturas de células LNCaP, foi realizada análise de microarray para uma avaliação abrangente diferenças de transcrição entre culturas de células em 2D e 3D LNCaP sob andrógeno privados e R1881 tratados condições, com foco em genes responsivos aos andrógenos. Encontramos regulação diferencial de 4157 (1896 para cima, 2.261 para baixo) e 3306 (1304 até 2002 para baixo) genes responsivos aos andrógenos em cultura de células em 2D e 3D LNCaP tratados com R1881, respectivamente. O 2D-tratados R1881 (2D + R1881) e 3D (3D + R1881) culturas compartilhada 2862 genes comumente regulados responsivos aos andrógenos (1165 cima e 1697 genes regulados negativamente) quando comparados com os respectivos controles de etanol (Figura 6A). Curiosamente, a mudança vezes no nível de 898 (31%) de expressão destes genes foram substancialmente reduzidas em 3D + R1881 quando comparado com R1881 + 2D. Isto foi particularmente evidente para os genes regulados positivamente, como mostrado nos diagramas de dispersão (Fig. 6A), o que sugere uma resposta androgénico na ausência de androgénios, quando as células LNCaP foram crescidas em cultura em 3D. Comparação dos controlos em 3D e em 2D etanol (3D + EtOHvs2D + EtOH) revelou que 1469 genes responsivos aos andrógenos foram diferencialmente expressos (Figura 6B). Isto sugere fortemente que a diminuição da mudança de dobrar andrógenos genes regulados em resposta a R1881 na cultura relativa a 2D 3D + R1881 foi causada por uma forte alteração no nível de expressão da linha de base dos andrógenos genes regulados (Fig. 6B).