Abstract
Introdução
A ataxia telangiectasia mutado e Rad3 Relacionados (ATR) da proteína quinase é um sensor de chave de single-stranded DNA associado com garfos de replicação paralisadas e intermediários de reparação gerados durante o reparo do DNA. XRCC1 é uma enzima crítica no reparo vertente pausa única e reparação por excisão de bases. complexo XRCC1-LIG3 também é um importante contribuinte para o passo de ligação da resposta de nucleotídeos excisão reparação.
Métodos
No presente estudo, investigamos letalidade sintética no XRCC1 deficiente e XRCC1 proficiente Hamster chinês células de ovário (CHO) e humanas do cancro do ovário que usam inibidores de ATR (NU6027). Além disso, nós também investigaram a capacidade de inibidores de ATR para potenciar cisplatina citotoxicidade em XRCC1 deficiente e XRCC1 proficiente CHO e células cancerosas humanas. ensaios clonog�icas, ensaios cometa alcalino, γH2AX imunocitoquímica, FACS para o ciclo celular, bem como análise de citometria de fluxo V FITC-anexina foram realizadas.
Resultados
inibição ATR é sinteticamente letal em células deficientes XRCC1 como evidenciado pelo aumento da citotoxicidade, a acumulação de quebras de DNA de fita dupla, G2 /M paragem do ciclo celular e aumento da apoptose. Em comparação com cisplatina isoladamente, a combinação de cisplatina e inibidores de ATR resulta em citotoxicidade reforçada em células deficientes XRCC1 comparação com células proficientes XRCC1.
Conclusões
Nossos dados fornece evidências de que a inibição ATR é adequado para letalidade sintética aplicação e chemopotentiation cisplatina em células de cancro do ovário deficientes XRCC1
Citation:. Sultana R, Abdel-Fatah T, Perry C, Moseley P, Albarakti N, Mohan V, et al. (2013) Ataxia Telangiectasia Mutated e Rad3 Relacionados (ATR) Protein Kinase inibição é sinteticamente letal em células XRCC1 Deficiência do cancro do ovário. PLoS ONE 8 (2): e57098. doi: 10.1371 /journal.pone.0057098
editor: Todd W. Miller, Dartmouth, Estados Unidos da América
Recebido: 08 de novembro de 2012; Aceito: 17 de janeiro de 2013; Publicação: 25 de fevereiro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Sultana et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Os autores não têm apoio ou financiamento para relatar
Conflito de interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Segmentação de reparo do DNA para a letalidade sintética é um novo e excitante. estratégia para a terapia personalizada no câncer de ovário. de reparação do ADN é essencial para o processamento de danos no ADN induzida por quimioterapia, tais como agentes platinating (carboplatina, cisplatina) [1]. Intra-cadeia aductos de ADN de ligação transversal induzida por agentes platinating, se não reparados, em última análise, resultar em morte celular [2], [3]. DNA ligações cruzadas intra-fio são reparados predominantemente por meio de reparação por excisão de nucleotídeos (NER) em células [4], [5]. agentes Platinating também pode gerar radicais livres de oxigênio que induzem danos de base oxidativo que são processados pela reparação de base de DNA excisão (BER) da via em células [6], [7].
O XRCC1 (raio-X de reparação cruz – complementando gene 1) proteína é um fator crítico para BER e único fio via de reparo ruptura (SSBR). complexo XRCC1-LIG3 também é um importante contribuinte para a etapa ligadura da resposta de reparação por excisão de nucleotídeos (NER). XRCC1, uma proteína de 70 kDa, não tem qualquer actividade enzimática conhecida (revisto em [8], [9], [10]). funções XRCC1 como uma proteína de andaime molecular e coordena a reparação do ADN através da interacção com vários componentes de ber /SSBR tais como a PARP-1 [poli (ADP-ribose) polimerases 1], ADN glicosilases, endonuclease AP (APE1) e outros (revisto em [ ,,,0],8], [9], [10]). deficiência XRCC1 em células levar ao acúmulo de DNA rupturas simples dos filamentos (SSB), induzir mutações e resultar em níveis elevados de permuta de cromatídeos irmãos. XRCC1 deficiência em linhas celulares resultar em hipersensibilidade à radiação e quimioterapia [9] ionizante. Em estudos de associação humanos, polimorfismos germinativas em XRCC1 podem influenciar o risco de câncer [11], [12] e resposta influência para a quimioterapia baseada em platina [13], [14], [15], [16]. No câncer de ovário humano temos demonstrado recentemente que os tumores frequentemente sobre-expresso XRCC1 (48%) e significativamente associada com o estágio mais elevado (p = 0,006), tipo de tumores serosos (p = 0,008), sub-óptima-de Agrupamento (p = 0,004 ), um aumento de duas vezes de risco de morte (p = 0,007) e progressão (p 0,0001) [17]. Na análise multivariada, expressão XRCC1 foi independentemente associada com a sobrevivência em pacientes com câncer ovariano [RH 2.3, p = 0,002]. tumores negativos XRCC1 foram associados com a sensibilidade de platina (p 0,0001). Pré-clínica que também confirmou que as células negativas XRCC1 são hipersensíveis à cisplatina em comparação com células positivas XRCC1 [17]. Hipersensibilidade à cisplatina em células negativas XRCC1 foi associada com acúmulo de rupturas dos filamentos de DNA e G2 /M do ciclo celular prisão [17]. Os nossos dados sugerem que, por conseguinte, XRCC1 é um promissor biomarcador no cancro do ovário.
Ataxia Telangiectasia mutado e Rad3 Relacionada (ATR) da proteína quinase é um sensor de chave de ADN de cadeia simples associado com garfos de replicação, bem como paralisadas gerado durante BER e dupla vertente de reparação ruptura como intermediários de reparo do DNA. ATR Activado por sua vez fosforila um número de substratos envolvidos na regulação do ciclo celular, replicação de ADN, reparação de ADN e apoptose (revisto em [18], [19], [20], [21], [22]). Em estudos pré-clínicos, a inibição ATR pode resultar na sensibilização da terapia citotóxica [22], [23], [24]. inibidores de moléculas pequenas de ATR estão actualmente em desenvolvimento para aplicação terapêutica no cancro [20], [21], [22].
A capacidade de inibidores de PARP para induzir letalidade sintética em BRCA deficiente em cancros do ovário [25], [26], [27] sugere que factores adicionais dentro BER /SSBR podem ser adequados para tais abordagens personalizados. XRCC1 é um fator crítico para BER, SSBR e NER. ATR é um sensor de chave de BAAs. No presente estudo foram investigadas e confirmou letalidade sintética em células deficientes XRCC1 tratados com inibidores da ATR. Além disso, em comparação com cisplatina isoladamente, a combinação de cisplatina e inibidores de ATR resultados do tratamento na citotoxicidade reforçada em células deficientes XRCC1 comparação com células proficientes XRCC1.
Materiais e Métodos
compostos e reagentes
inibidores de ATR pequena molécula NU6027 e VE-821 foram comprados de Tocris Bioscience, Reino Unido e Tinib-Tools, República Checa, respectivamente. Os compostos foram dissolvidos em 100% de DMSO e armazenadas a -20 ° C. A cisplatina (1 mg /ml) foi obtida a partir do Departamento de Farmácia, Universidade de Nottingham Hospitais, Reino Unido
Linhas Celulares e Cultura
Anteriormente células bem caracterizadas de ovário de hamster chinês (CHO).; CHO9 (tipo selvagem), EM-C11 (XRCC1-mutante: a substituição C389Y levando a instabilidade XRCC1protein), EM-C12 (XRCC1-mutante: a substituição E98K resultando em integridade proteína XRCC1 reduzida) [28] foram fornecidas pelo professor Małgorzata Z. Zdzienicka , Departamento de Genética Molecular Cell, Universidade Nicolaus Copernicus-em Torun, Bydgoszcz 85-094, Polônia. As células foram cultivadas em Ham F-10 meios (PAA, Reino Unido) [suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (PAA, Reino Unido) e 1% de penicilina /estreptomicina]. células EM9 EM9-V (XRCC1 mutante) e transfectadas de forma estável com um vector humano expressão XRCC1 (células EM9-XH) [29] foram fornecidas pelo professor Keith Caldicott, Genome danos e Centro de Estabilidade, da Universidade de Sussex, Reino Unido. As células foram cultivadas em meio DMEM (PAA, Reino Unido) [suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (PAA, Reino Unido) e 1% de penicilina /estreptomicina]. células de cancro do ovário OVCAR-3 e OVCAR-4 foram cultivadas em meio RPMI (PAA, Reino Unido) [suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) (PAA, Reino Unido) e 1% de penicilina /estreptomicina].
XRCC1 Knockdown Usando siRNAs
Três XRCC1 siARN constrói (sequências listadas na Tabela 1) e um negativo mexidos controlo e ARNsi para desidrogenase gliceraldeído 3-fosfato (GAPDH) (controlo positivo), foram utilizados nestes estudos. As construções de ARNsi foram adquiridos a Life Technologies Ambion, Reino Unido. O protocolo de transfecção foi tal como descrito anteriormente por Fan et.al [30]. As células foram plaqueadas em placas de 6 poços (2 ml de meio /poço sem antibióticos). A 50% de confluência, transfecção foi realizada utilizando Lipofectamine TM 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Resumidamente, ARNsi (100 pmol) e Lipofectamine (5 mL) foram misturados separadamente com cada 250 ul Opti- MEM1 (Gibco /Invitrogen) sem FBS. Após 5 minutos de incubação à temperatura ambiente, as soluções de siRNA e LipofectAMINE foram combinados e incubados durante mais 20 min à temperatura ambiente. Esta mistura foi depois adicionada às células plaqueadas, cultivadas a 37 ° C durante a noite e depois o meio foi substituído por meio fresco mais penicilina /estreptomicina (1%). Quando as células atingiram 100% de confluência, foram tripsinizadas e subsequentemente transferidos para 75 cm
2 frascos de crescimento e /ou a continuação do tratamento. XRCC1 Knockdown foi avaliada por western blot em vários pontos de tempo após transfecção (dias 3, 5 e 7).
Análise Western Blot
As amostras de proteína foram preparados por células de lise em tampão RIPA (Tris 20 mM, NaCl 150 mM, 1% de Nonidet P-40, 0,5% de desoxicolato de sódio, 1 mMEDTA, SDS a 0,1%) contendo inibidores de protease (Sigma) e inibidor de fosfatase cocktail 2 e 3 (Sigma) e, em seguida, levado a western blot análises tal como descrito anteriormente [29]. anticorpo primário foram um rato anti -XRCC1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, EUA) e de coelho anti-ATR (Novus Biologicals, EUA). anticorpo secundário conjugado com HRP foram um anti-ratinho de coelho e de cabra anti-coelho, respectivamente (Dako, Glostrup, Dinamarca).
Ensaio de sobrevivência clonogénica
Duzentos células por poço foram semeadas em placas de seis poços pratos. As células foram deixadas aderir durante 4 horas. NU6027 ou VE-821 foram adicionados às concentrações indicadas e as placas foram deixadas na incubadora durante 10 dias para as células CHO. Para siARN transfectadas OVCAR-3 e células OVCAR-4, três dias após a transfecção, NU6027 ou VE-821 foi adicionado em concentrações indicadas e as placas foram deixadas na incubadora durante 14 dias. Para os estudos de cisplatina e de combinação de inibidor de ATR, as células foram inicialmente tratadas com cisplatina durante 16 horas e então suavemente lavadas duas vezes com 1X salina tamponada com fosfato e incubadas em meio fresco com ou sem NU6027 (4 uM para células CHO e 6 uM para células OVCAR-3 ) durante 10 dias (células CH) ou 14 dias (células de cancro humano). Após a incubação, o meio foi descartado, fixo (com metanol e a mistura de ácido acético) coradas com violeta de cristal e contadas. Sobrevivendo Fraction = [No. de colônias formadas /(Sem. de células semeadas x eficiência de plaqueamento)]. Todos os ensaios clonogénicos foram realizados em triplicado.
alcalina do ensaio cometa
Este ensaio foi realizado como descrito anteriormente [31]. Resumidamente, as células sub-confluentes foram expostas a NU6027 (4 uM). Às 24 horas, as células foram extraídas e ensaios de cometa alcalino foram realizadas. tampão de electroforese alcalino consistiu de NaOH a 200 mM, EDTA 1 mM e pH 13. As lâminas foram então coradas com SYBR® verde (1:10,000 diluição) (Molecular Probes) durante 10 minutos, e as imagens foram visualizados sob um filtro de rodamina com uma Olympus BX40 microscópio. Os cometas foram analisados utilizando Ensaio Cometa III software de análise de imagem (Perceptive Instruments, Suffolk, Reino Unido). Um total de 200 imagens cometa foram avaliados para momento de cauda de oliva.
γH2AX Imunocitoquímica
As células foram tratadas durante 48 horas com NU6027 (4 uM para células CHO e 6 uM para células OVCAR-3) e o ensaio foi realizado como descrito anteriormente [31]. Para os estudos de cisplatina e da combinação NU6027, inicialmente, as células foram tratadas durante 16 horas com cisplatina (1,5 uM para células CHO e 1 uM para OVCAR-3 ou células OVCAR-4) e, em seguida, cuidadosamente lavadas duas vezes com 1X tampão de fosfatos salino e incubado em fresco meios de comunicação com ou sem NU6027 (4 uM para células CHO e 6 uM para OVCAR-3 OVCAR-4 ou células) e o ensaio foi realizado como acima. As frequências de células que contêm focos γH2AX foram determinados em 100 células por lâmina em três experiências separadas. Os núcleos contendo mais do que seis focos γH2AX foram considerados positivos.
As análises de citometria de fluxo (FACS) para a progressão do ciclo celular
As células foram tratadas durante 24 horas com NU6027 (4 uM para células CHO e 6 uM para OVCAR-3 OVCAR-4 ou células). As células foram depois recolhidas por tripsinização e centrifugação (1000 rpm durante 5 minutos) e foram realizadas análises FACS como descrito anteriormente [31].
Detecção de apoptose por FITC-anexina V análise citométrica de fluxo
Células foram tratadas durante 48 horas com NU6027 (4 uM para células CHO e 6 uM para OVCAR-3 OVCAR-4 ou células). As células foram depois recolhidas por tripsinização e centrifugação (1000 rpm durante 5 minutos) e foram lavadas duas vezes com PBS frio e, em seguida, re-suspensas em tampão de ligação de células 1X a uma concentração de 1 × 10
6 células /ml. Em seguida, 100 ul de solução (1 × 10
5 células) foi transferida para um tubo de cultura de 5 ml e foram adicionados 5 uL de FITC anexina V e 5 ul PI. As células foram então suavemente vórtice e incubadas durante 15 minutos à temperatura ambiente (25 ° C) no escuro. Após a incubação, 400 uL de tampão de ligação foi adicionada a cada tubo e foi analisada por citometria de fluxo dentro de 1 hora. Para os estudos de cisplatina e da combinação NU6027, as células foram inicialmente tratadas durante 16 horas com cisplatina (1,5 uM para células CHO e 1 uM para OVCAR-3 ou células OVCAR-4) e, em seguida, cuidadosamente lavadas duas vezes com 1X tampão de fosfatos salino e incubado em fresco meios de comunicação com ou sem NU6027 (4 uM para células CHO e 6 uM para OVCAR-3 OVCAR-4 ou células) e o ensaio foi realizado como descrito anteriormente. Os dados foram analisados usando o software FlowJo7.6.1.
Avaliação da interação medicamentosa (Índice de Combinação)
Para investigar sinérgica e aditivo de atividade, o índice de combinação foi calculada como descrito anteriormente [30]. As curvas de dose-resposta para a cisplatina ou NU6027 sozinho foram primeiro geradas. O efeito do tratamento combinado foi então analisado para a combinação da droga A (cisplatina) e B (NU6027), através da aplicação da equação seguinte: Ac /AE + BC /Be = D, em que AC e BC correspondem às concentrações das drogas utilizados no tratamento de combinação, e Ae e Be corresponde às concentrações de fármacos capazes de, por si só, produzir a mesma magnitude do efeito. Se D (índice de combinação) é 1 o efeito da combinação é sinérgica, ao passo que se D = 1 e D é 1, o efeito é aditivo ou antagonista, respectivamente [32]
Resultados
.
letalidade
sintético
Para avaliar a letalidade sintética pré-clinicamente, um painel de XRCC1 deficiente e XRCC1 proficiente ovário de hamster chinês e linhas celulares de cancro do ovário humano foram tratados com pequenas moléculas inibidoras da ATR (NU6027 e VE-821 ).
células de Ovário de Hamster chinês (CHO).
CHO9 (tipo selvagem), eM-C11 (XRCC1 deficiente) e eM-C12 (XRCC1 deficiente) foram investigados em ensaios de sobrevivência clonogénicas. Nós inicialmente avaliado XRCC1 e estado expressão ATR nas células CHO9, EM-C11 e EM-C12. A análise Western blot na Figura 1A demonstra que o EM-C11 e EM-C12 não têm expressão da proteína XRCC1 mensurável em comparação com CHO9. EM-C11, EM-C12 e CHO9 são proficientes na expressão ATR. A Figura 1B mostra que as células EM-C11 e EM-C12 são sensíveis ao tratamento em comparação com células NU6027 CHO9. Do mesmo modo, as células EM-C11 e EM-C12 também são sensíveis a VE-821 em comparação com células CHO9 (Figura 1C). Para investigar se a sensibilidade de XRCC1 células deficientes para os inibidores de ATR pode ser corrigido através da expressão de proteína XRCC1 de tipo selvagem em células CHO deficientes em XRCC1, foram realizados ensaios clonogénicos em EM9-V (mutante XRCC1) e EM9-XH (células transfectadas de forma estável com um vector de expressão XRCC1 humano). A Figura 1D mostra que as células EM9-V são sensíveis a NU6027 comparação com EM9-XH.
ensaios clonogénicos de sobrevivência para as células tratadas com CH NU6027 (B) e VE-821 (C) nas concentrações indicadas (ver métodos para detalhes). D. ensaios clonogénicos de sobrevivência para células EM9-V e EM9-XH tratados com NU6027. ensaio E. Alkaline COMET em células CH tratados com NU6027. EM-C11 e EM-C12 demonstrou um momento maior média de cauda em comparação com células CHO9. células F. EM-C11 e EM-C12 acumulam focos γH2AX significativamente mais elevados em comparação com células CHO9 após tratamento NU6027. Os dados representam valores médios ± SEM (n = 6). Os resultados foram analisados utilizando teste t de Student. * P . 0,05
Em seguida, realizou análise funcional nas células. inibição ATR leva ao acúmulo de DNA pausa única vertente (SSB). Portanto ensaio Alkaline COMET foi realizada. Figura 1E resume os resultados para células CHO9, EM-C11 e EM-C12 tratadas com 4 uM de NU6027. Em comparação com as amostras de pré-tratamento, após 24 horas de exposição ao inibidor de ATR, células EM-C11 e EM-C12 demonstrar um momento de cauda média significativamente maior em comparação com CHO9 (p 0,01). Os dados confirmam a acumulação SSB seguinte inibição ATR em células deficientes XRCC1.
DNA double rupturas dos filamentos (LAP) induzir a fosforilação da H2AX na serina 139 (γH2AX). A acumulação de γH2AX focos no núcleo é um marcador de LAP. Portanto, γH2AX imunocitoquímica foi realizada em EM-C11, EM-C12 e as células tratadas com CHO9 4 μΜ de NU6027. Os núcleos contendo mais do que seis focos γH2AX foram considerados positivos. γH2AX imunocitoquímica confirmou que as células XRCC1 deficiente EM-C11 e C12 EM-acumulada focos mais γH2AX às 48 horas (p = 0,02 ep = 0,05) em comparação com células CHO9 (Figuras 1D).
O acúmulo de LAP pode atrasar a progressão do ciclo celular. As análises de FACS foram, portanto, realizadas em EM-C11, EM-C12 e as células tratadas com CHO9 NU6027 (4 uM). a progressão do ciclo celular foi avaliada e comparada com amostras de controlo. Às 24 horas, o EM-C11 e EM-C12 foram mostrados para ser preso na fase G2 /M do ciclo celular (p = 0,01 e p = 0,03) em comparação com células CHO9 (Figura 2A e 2B).
B. Quantificação de várias fases do ciclo celular é mostrado para células tratadas com CH NU6027. Os dados representam valores médios ± SEM (n = 6). Os resultados foram analisados utilizando teste t de Student. * P 0,05. ensaio V apoptose C. FITC-anexina é mostrado aqui. A proporção de células em apoptose fase inicial é mais elevada em células deficientes em XRCC1 tratados com NU6027 comparado com células de tipo selvagem.
Acumulação de LAP, se não reparados, induz a apoptose em células. Assim, a análise de citometria de fluxo de FITC-anexina V foi realizada para quantificar a apoptose em células tratadas com 4 uM de NU6027 células apoptóticas e quantificados a 48 horas. Em células EM-C11 da proporção de células em apoptose precoce aumentou para 7,5% ao fim de 48 horas de tratamento com NU6027 em comparação com 1,73%, em células não tratadas. Do mesmo modo, em células EM-C12, percentagem de células apoptóticas precoces aumentou de 2,62% para 9,88%. Por outro lado, em células CHO9, não houve alteração na percentagem de células apoptóticas precoces (3,22% em não tratada e 3,38% após 48 horas de tratamento NU6027 (Figura 2C).
Os dados apresentados no Hamster Chinês células sugere que as células deficientes em XRCC1 são sensíveis a inibidores de ATR. inibição ATR leva a um aumento da acumulação de DSB, G2 /M, a paragem do ciclo celular e apoptose. Isto sugere uma relação letalidade sintética entre XRCC1 e ATR. para confirmar estes dados ainda investigámos em ovário humano linhas celulares de cancro.
células de cancro do ovário humanos.
geramos XRCC1 knockdown linhas celulares de cancro do ovário humano usando três construções de siRNA (Tabela 1). Após transfecção, lisados celulares foram amostrados nos dias 3, 5 e 7 para XRCC1 derrubar por análise western blot. Figura 3A confirma que todas as três construções (siARN-1, siARN-2, siARN-3) induzir knockdown eficiente (mais de 80%) de XRCC1 em OVCAR 3-células no dia 3 em relação ao controle negativo mexidos e controle GAPDH positivo. Em ensaios de sobrevivência clonogénicas, NU6027 tratamento reduziu a sobrevivência em células deficientes em XRCC1 em comparação com células proficientes (Figura 3B). Resultados similares também foram observadas em OVCAR-4 células (Figura S1 A). γH2AX imunocitoquímica confirmou que as células deficientes em XRCC1 acumulado mais focos γH2AX às 48 horas (p = 0,05, p = 0,01 e p = 0,007, respectivamente) em comparação com o controlo scrambled (Figura 3C). Além disso, em 24 horas, as células deficientes em XRCC1 foram mostrados para ser preso na fase G2 /M do ciclo celular (p = 0,05, p = 0,04 e p = 0,05) em comparação com células CHO9 (Figura 3D). Em células deficientes XRCC1 a proporção de células em apoptose aumentou substancialmente em comparação com os controlos após tratamento mexidos NU6027 (Figura 3E).
B. ensaios de sobrevivência clonog�icas para siRNA transfectadas OVCAR-3 células tratadas com NU6027 nas concentrações indicadas é mostrado aqui (ver métodos para detalhes). células deficientes C. XRCC1 acumulam focos γH2AX significativamente mais elevados em comparação com células de controlo mexidos após tratamento NU6027. Os dados representam valores médios ± SEM (n = 6). Os resultados foram analisados utilizando teste t de Student. * P 0,05, ** p 0,01. D. Quantificação de várias fases do ciclo celular é mostrado para ARNsi transfectadas de células OVCAR-3 tratado com NU6027 é mostrada aqui. Os dados representam valores médios ± SEM (n = 3). Os resultados foram analisados utilizando teste t de Student. * P 0,05. E. FITC-anexina V ensaio de apoptose para siRNA transfectadas células OVCAR-3 é mostrado aqui. A proporção de células em apoptose fase tardia é mais elevada em células deficientes em XRCC1 tratados com NU6027 em comparação com células de controlo codificados.
Tomados em conjunto, os dados a partir de células CHO e linhas de células humanas fornecem evidências convincentes de que os inibidores de ATR induziu letalidade sintética em células deficientes XRCC1.
cisplatina Chemopotentiation
Temos demonstrado anteriormente que as células deficientes XRCC1 são sensíveis a cisplatina [17]. No presente estudo, nós primeiro confirmada esta observação em células EM-C12 XRCC1 deficiente EM-C11 e em comparação com CHO9 células do tipo selvagem (Figura 4A). Em seguida, avaliou estratégias de combinação. A citotoxicidade de cisplatina foi reforçada por NU6027 em células deficientes em CH XRCC1 em comparação com células proficientes XRCC1. A fim de avaliar a interacção entre cisplatina e NU6027, índice de combinação foi calculada como descrito anteriormente [32]. As células foram cultivadas na presença de doses crescentes de cisplatina (intervalo de 0,5-3 uM), em combinação com uma concentração de NU6027 capaz de induzir uma inibição de crescimento de 50%. NU6027 potenciou o efeito citotóxico da cisplatina em células deficientes em XRCC1 (Tabela 2). Se o índice de combinação (D) é de 1 o efeito da combinação é sinérgica, ao passo que se D = 1 e D é 1, o efeito é aditivo ou antagonista, respectivamente [32]. No estudo corrente, o índice de combinação era um em células EM-C11 e EM-C12. Concluiu-se que o reforço da citotoxicidade por cisplatina NU6027 em células CHO foi aditivo ao invés de sinérgico. Passamos então a realizar análises funcionais nas células. A cisplatina sozinha tratamento aumentou a acumulação de DSB nas células deficientes em XRCC1, que foi ainda aumentada pela NU6027 (p = 0,01 e p = 0,02) (Figura 4B). A acumulação ORL visto em células deficientes em XRCC1 também foi associado com a acumulação de células apoptóticas, como mostrado na Figura 4C.
eixo X designa o aumento da concentração de apenas cisplatina. NU6027 foi fixada em 4 mm. B. XRCC1 CH células deficientes acumulam focos γH2AX significativamente mais elevadas em comparação com as células XRCC1 CH proficientes em cima do tratamento com cisplatina isoladamente ou de uma combinação de cisplatina e NU6027. Os dados representam valores médios ± SEM (n = 6). Os resultados foram analisados utilizando teste t de Student. * P 0,05, ** p 0,01. ensaio V apoptose C. FITC-anexina é mostrado aqui. A proporção de células em fase precoce, bem como a apoptose fase tardia é mais elevada em células deficientes em XRCC1 tratados com cisplatina isoladamente ou de uma combinação de cisplatina e NU6027, em comparação com as células de tipo selvagem.
então conduzidos estudos semelhantes em células transfectadas siARN OVCAR-3 OVCAR-4 ou humanos. Semelhante aos resultados observados em células CH, deficientes OVCAR-3 OVCAR-4 ou células XRCC1 foram sensíveis a cisplatina. NU6027 reforçada citotoxicidade da cisplatina em células deficientes em XRCC1 OVCAR-3 em comparação com células proficientes XRCC1 (Figura 5A). Resultados similares também foram observadas em OVCAR-4 células (Figura S1 B). estudos de índice de combinação (Tabela 2) demonstraram que na maioria das células foi um, excepto para as células OVCAR-3 tratadas com Si RNA_3 (D = 0,93) e OVCAR-4 células SiRNA_1 (d = 0,99). Tomados em conjunto, conclui-se que as células cancerosas do ovário humano o efeito potenciador é susceptível de ser aditivos. A cisplatina sozinha tratamento aumentou a acumulação de DSB nas células que foi ainda aumentada pela NU6027 (p = 0,02, p = 0,007 e p = 004) (Figura 5B). A acumulação ORL visto em células deficientes em XRCC1 foi associada com a acumulação de células apoptóticas substanciais como mostrado na Figura 5C.
B. XRCC1 células deficientes acumulam focos γH2AX significativamente mais elevados em comparação com XRCC1 células proficientes em cima do tratamento com cisplatina isoladamente ou de uma combinação de cisplatina e NU6027. Os dados representam valores médios ± SEM (n = 6). Os resultados foram analisados utilizando teste t de Student. * P 0,05, ** p 0,01. ensaio V apoptose C. FITC-anexina é mostrado aqui. A proporção de células em apoptose fase tardia é mais elevada em células deficientes em XRCC1 tratados com cisplatina isoladamente ou de uma combinação de cisplatina e NU6027 comparado com células de tipo selvagem.
Os dados aqui apresentados não só fornece evidência adicional de que células deficientes XRCC1 são sensíveis à quimioterapia com cisplatina, mas também sugere que a inibição ATR aditiva aumenta a toxicidade da cisplatina em células deficientes XRCC1 comparação com células proficientes XRCC1.
Conclusões
proteína quinase ATR é um sensor de chave da única DNA -cordas associado com garfos de replicação paralisadas e intermediários de reparação gerados durante BER e DSB reparo. activação ATR regula vários processos celulares, incluindo regulação do ciclo celular, replicação de DNA, reparo de DNA e apoptose. XRCC1 é essencial para BER e SSBR e contribui para o passo de ligação da resposta NER. Nós hipótese de que a inibição ATR poderia ser sinteticamente letal em células deficientes XRCC1.
No estudo atual temos confirmado que os inibidores de ATR são sinteticamente letal em células deficientes XRCC1. Concluímos letalidade sintético, pelas seguintes razões. Primeiro, as células CHO, bem células cancerosas humanas deficientes em XRCC1 eram altamente sensíveis a inibidores de ATR. Em segundo lugar, análises funcionais demonstraram que a inibição ATR em células deficientes em XRCC1 conduziu a uma acumulação de DSB de ADN, G2 /M do ciclo celular e detenção aumento da apoptose. Estes dados são consistentes com um estudo por Peasland et al [22] que demonstraram que NU6027 sinteticamente é letal em células tratadas com um inibidor de PARP que bloqueia BER. Além disso, os autores também demonstraram que células de hamster chinês que faltam EM9 XRCC1 também são sensíveis à NU6027 [22]. Os dados, incluindo o nosso, portanto, fornece evidências convincentes de que a inibição ATR é sinteticamente letal em células deficientes BER. Nós apresentamos um modelo de trabalho para a inibição ATR como uma estratégia de letalidade sintética em células deficientes XRCC1. Em resumo, a inibição ATR leva ao acúmulo SSB. As células deficientes em XRCC1 são incapazes de processar SSBs que, eventualmente, são convertidos para LAP tóxicos em garfos de replicação. LAP esmagadora não só pode saturar o reparo DSB, mas a inibição ATR também é conhecido por modulação da reparação DSB diretamente [33], [34] contribuindo para letalidade sintética observada em células.
Nós também descobrimos que células deficientes XRCC1 são sensíveis de cisplatina. A sensibilidade cisplatina em células deficientes XRCC1 observados em nosso estudo é consistente com um estudo recente em células HepG2 em que a sensibilidade a cisplatina foi demonstrada após a depleção XRCC1 [35]. Nós não observamos qualquer potenciação da citotoxicidade de cisplatina por inibidor da ATR em células de tipo selvagem XRCC1. Isto está em contraste com estudos pré-clínicos anteriores em que a ATR inactivação (ou geneticamente com inibidores) demonstrou aumento da sensibilidade de platina num painel de linhas de células [22]. No entanto, uma limitação do nosso estudo é que a nossa investigação era restrita a apenas alguns tipos de células. No entanto, nossos dados sugerem que o fundo genético (como o status XRCC1) pode influenciar a sensibilidade de platina. Em conclusão, demonstrámos uma aplicação letalidade sintética para os inibidores de ATR em células deficientes em XRCC1. inibição ATR também podem influenciar a sensibilidade de platina em células deficientes XRCC1.