Abstract

Um número de cancros mostram aumento da expressão de nicotinamida fosforibosil transferase (Nampt). No entanto, o mecanismo através do qual é regulada positivamente Nampt não é clara. Em nosso estudo, descobrimos que o FK866 inibidor químico Nampt específicos de forma significativa a sobrevivência celular inibida e níveis reduzidos nicotinamida adenina dinucleótido (NAD) em linhas de células LoVo e SW480. As análises Bioinformatics sugeriu que o miR-26b atinge Nampt ARNm. Foram identificados Nampt como um novo alvo de miR-26b e demonstraram que o miR-26b inibe a expressão Nampt na proteína e níveis de mRNA por ligação ao Nampt 3′-UTR. Além disso, descobrimos que o miR-26b foi regulada negativamente em tecidos de câncer em relação ao que em tecidos normais adjacentes em 18 pacientes com câncer colorretal. A correlação inversa estatisticamente significativa entre miR-26b e expressão Nampt foi observada em amostras de pacientes com câncer colorretal e em 5 linhagens de células colorretal (HT-29, SW480, SW1116, LoVo e HCT116). Além disso, a sobre-expressão de miR-26b inibiu fortemente a sobrevivência das células LoVo e invasão, um efeito parcialmente anulada pela adição de NAD. Em conclusão, este estudo demonstrou que a via de biossíntese-salvamento envolvendo NAD Nampt pode desempenhar um papel na sobrevivência de células de cancro colorrectal. MiR-26b pode servir como um supressor de tumor, visando Nampt

Citation:. Zhang C, Tong J, Huang G (2013) nicotinamida fosforibosil transferase (Nampt) é alvo de microRNA-26b em células de cancro colo-rectal. PLoS ONE 8 (7): e69963. doi: 10.1371 /journal.pone.0069963

editor: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, Estados Unidos da América

Recebido: 27 de fevereiro de 2013; Aceito: 13 de junho de 2013; Publicação: 29 de julho de 2013

Direitos de autor: © 2013 Zhang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O estudo foi apoiado por bolsas de investigação da National Natural Science Foundation da China (números 30830038, 30970842, 81071180, 81000929); “973” Projeto (2012CB932604); Discovery Project New Drug (2012ZX09506-001-005); Projeto chave da Comissão de Ciência e Tecnologia de Xangai Município (número 10JC1410000); ea principal Academic Projeto Disciplina Shanghai (número S30203). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

A proteína nicotinamida fosforribosil transferase (Nampt) tem várias funções. Existe em intercelular (iNAMPT) e formas extracelulares (eNAMPT) [1]. Em células, funciona como um enzima limitante da velocidade na via de salvamento para a síntese de um dinucleótido adenina nicotinamida (NAD), que está envolvida no metabolismo celular e a proliferação de [2]. Nampt extracelular foi identificado pela primeira vez como colónia de células pré-B factor de reforço (PBEF), uma proteína de citocinas do tipo que estimulou a formação de células B no início [3]. Foi renomeada recentemente como visfatina por Fukuhara et al., Que identificou-o como um adipocina derivados de gordura visceral que é acreditado para imitar a função da insulina [4]. Nampt tem atraído um interesse significativo não só no campo do metabolismo e a resposta imunitária, mas também no campo do cancro. Um certo número de cancros mostram aumento da expressão de Nampt [5], [6], [7], [8], [9], [10], [11], e inibidores de Nampt oferecer aplicações terapêuticas promissoras no cancro [12] [13], [14], [15]. No entanto, o mecanismo pelo qual Nampt torna-se regulada não é clara.

Os microRNAs (miRNAs) são uma classe de pequenos RNAs não-codificantes. Identificada como uma nova classe de reguladores de expressão de genes, eles alvo mRNAs para a repressão ou degradação [16] translacional. Uma série de estudos têm revelado que miARN pode regular a expressão de uma variedade de genes, incluindo os que são importantes para a proliferação do tumor, invasão, metástase ou [17], [18], [19]. A utilidade de miARN no tratamento do cancro tem sido demonstrada [20], [21], [22].

Neste estudo, foi demonstrado que a via de biossíntese de NAD salvamento envolvendo Nampt desempenha um papel na colorrectal sobrevivência de células de cancro. Nós mostramos pela primeira vez que Nampt é alvo de miR-26b. Além disso, a expressão de miR-26b e Nampt foi ensaiada em amostras humanas de pacientes com cancro colo-rectal e 5 células de cancro colorrectal. Os papéis de miR-26b e Nampt no desenvolvimento do câncer humano são discutidos.

Métodos

Declaração de Ética

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ren Ji Hospital Ética da Escola da medicina, Shanghai Jiao Tong University. Este estudo foi realizado em estrita conformidade com as recomendações contidas no Guia para o Cuidado e Uso de amostras humanas de Ren Ji Hospital.

linhas celulares e Amostras de Tecido

linhas celulares de cancro colorrectal SW480, SW1116 , HT-29, LoVo e HCT116 foram utilizados neste estudo (obtido a partir de Xangai Instituto de Doenças gastrointestinais, Ren Ji Hospital, Faculdade de medicina da Universidade Shanghai Jiao Tong, China). Todas as linhas celulares foram cultivadas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) numa co 5%

2 incubadora humidificada a 37 ° C.

amostras de tecido de colo-rectal humano e normal adjacente tecidos colorretais foram obtidos de 18 pacientes que se submeteram à cirurgia em Ren Ji Hospital, Faculdade de medicina da Shanghai Jiao Tong University (Xangai, China). Nenhum dos pacientes recebeu quimioterapia ou radioterapia antes da cirurgia. As amostras foram recolhidas e armazenadas a -80 ° C. Os diagnósticos histopatológicos foram avaliados por patologista do hospital usando ambos os critérios morfológicos e imunocitoquímica. Todos os pacientes deram o seu consentimento informado por escrito (conforme descrito no formulário de consentimento PLOS) antes da coleta do tecido, eo estudo foi aprovado pelos comitês de ética do Hospital Ji Ren, da Escola de Medicina da Universidade Shanghai Jiao Tong.

CCK-8 Ensaio

A taxa de sobrevivência celular foi examinada usando celular Counting Kit-8 (CCK-8) (Dojindo). As células foram plaqueadas em placas de 96 poços a 5000 células /poço em meio completo e cultivadas durante 24 h. O meio foi então substituído com meio RPMI-1640 contendo FBS a 10%, com ou sem tratamento. Após a incubação, 10 uL de CCQ-8 foi adicionada a cada poço, e as placas foram ainda incubadas durante 4 horas numa incubadora. A absorvância a 490 nm foi lida espectrofotometricamente utilizando um leitor de microplacas.

Ensaio de Apoptose

apoptose celular foi determinada pelo kit de ensaio de apoptose Vybrant # 2 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Cada amostra foi avaliada por citometria de fluxo com um fluxo Coulter Epics XL citómetro (Beckman-Coulter). Os dados foram processados ​​com a Expo 32 citômetro software (Beckman-Coulter). Experimentos foram realizados três vezes em duplicado.

NAD + e NADH Quantificação

As concentrações de NAD

+ e NADH em células foram detectadas utilizando um NAD

+ /NADH Quantificação Kit ( bio Vision) de acordo com o manual. A quantidade de NAD

+ em cada amostra foi normalizada para o teor de proteína para cada amostra de teste

Previsão de Metas de miRNA

TargetScan baseado em computador (http:. //www.targetscan .org /) foi utilizado para prever os miRNAs que têm como alvo mRNA Nampt.

Knockdown ou sobre-expressão de miR-26b

a expressão de miR-26b em células foi derrubado por transfecção com miR-26b inibidor (GenePharma) ou aumentado por transfecção com imita miR-26b (GenePharma). As células foram colocadas em placas em pratos de cultura ou de placas de 24 poços durante 24 h e, em seguida, transfectadas com o inibidor ou imita usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) durante 24 h. Após a transfecção, as células foram submetidas a novos ensaios ou a extracção de ARN /proteína.

Extração de RNA e em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi extraído a partir de células cultivadas e as amostras de cancro colorectal utilizando TRIzol (Invitrogen). Os níveis de ARNm Nampt e miR-26b foram medidos por em tempo real de RT-PCR. Para a detecção de ARNm Nampt, transcrição reversa foi realizada utilizando a Transcriptase Reversa Sistema de M-MuLV, e PCR em tempo real foi realizado utilizando SYBR Green (Takara) com o Prism 7700 Sequence Detection System ABI (Applied Biosystems). Gliceraldeído 3-fosfato desidrogenase (GAPDH) foi utilizado para normalização. Para medir os níveis de miR-26b, análise em tempo real quantitativa de RT-PCR foi realizada utilizando o Kit de Transcrição Reversa TaqMan e microARN TaqMan Ensaios Kit (Applied Biosystems) de acordo com as instruções dos fabricantes. Uma pequena sonda TaqMan de ARN nuclear U6 humano foi utilizado para normalização. As sequências dos iniciadores (frente e verso) estão listadas na Tabela 1.

Western Blot

Um número igual de células sedimentadas foram lavadas com solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS), novamente peletizadas e ressuspensas em tampão RIPA. Subsequentemente, as células foram incubadas a 95 ° C durante 5 minutos e centrifugou-se numa microcentrífuga durante 5 min. Quantidades iguais de proteína total foram carregados para electroforese em dodecilsulfato de sódio géis de poliacrilamida e, em seguida, transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com 5% de TBS-T durante 1 h à temperatura ambiente e incubados com anticorpo primário em TBS-T durante 1 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C. Após lavagem 4 vezes durante 5 minutos cada em TBS-T, as membranas foram incubadas com anticorpo secundário de rábano silvestre conjugado com peroxidase (Tecnologia Kangchen) durante 1 h à temperatura ambiente. Após lavagem 4 vezes durante 5 minutos, as bandas de proteína foram visualizadas por meio de reacção de quimioluminescência e exposto a filme de raios-X. O anticorpo primário, anticorpo anti-Nampt (número de catálogo AP9010c), foi de Abgent. Os dados foram processados ​​usando o método 2-ΔΔCT.

Reporter Constrói

Os elementos miRNA26b de reconhecimento putativas do gene Nampt e mutantes correspondentes foram clonados a região 3 ‘não traduzida (UTR) do o gene da luciferase no vector pEZX-MT01 da luciferase (GeneCopoeia Inc.). Este clone continha a expressão Nampt (Adesão: NM_005746.2) sequência 3′-UTR inserido no vector pEZX-MT01 a jusante de um gene da luciferase de pirilampo sob o controlo de um promotor de SV40. O vector pEZX-MT01 também continham o gene de luciferase de Renilla sob o controlo de um promotor de CMV. Firefly atividade luciferase foi normalizada para a actividade luciferase Renilla. Os clones mutantes para Nampt foram construídos. A região de ligação de sementes (5’-UACUUGAA-3 ‘) foi alterado para 5′-UACUUACA-3’ (2-substituição pb). Todas as construções foram confirmadas por análise de sequência de ADN.

Luciferase Reporter Assay

células SW480 foram cultivadas em placas de 24 poços e transfectaram-se com o imitador de controlo negativo (CN) ou imita o miR-26b (30 nM ou 60 nM; GenePharma) usando Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Na sequência de uma segunda transfecção com um constructo repórter miR-26b ou o seu mutante (50 ng), SW480 células foi incubada durante 24 h. Os ensaios de luciferase foram realizadas utilizando o Combined Reporter Gene Assay Sistema Dual-Light (Promega) e Promega Turner TD-20/20 Luminómetro.

Transwell Ensaio

A migração celular foi realizada por transpoço ensaio (BD Biosciences) de acordo com as instruções do fabricante. Controlo miARN ou imita de células transfectadas de miR-26b foram colhidas 24 h após a transfecção. Em seguida, 3,0 × 10

5 células transfectadas ou células não tratadas em meio livre de soro foram adicionados a cada inserção superior pré-revestidos com matriz Matrigel. Para a câmara inferior correspondente, foram adicionados 500 uL de meio com FBS a 10%. Após a incubação, as células não-invasivos foram removidos a partir da superfície superior da membrana Transwell com uma mecha de algodão, e as células invasivas sobre a superfície da membrana inferior foram fixadas em metanol, coradas com 0,1% de violeta cristal, fotografadas e contadas.

Análise estatística

Os experimentos foram repetidos 3 vezes. Os dados são expressos como média ± DP. Para a comparação dos 2 grupos, foi utilizada uma de duas caudas, teste t não emparelhado. Um valor de p 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Os testes estatísticos foram realizados usando Estado Software 12.0 (Stata Corp).

Resultados

específicos do Nampt Chemical Inhibitor FK866 inibe NAD Síntese e célula de sobrevivência

O aumento da expressão Nampt tem sido relatada no câncer colorretal primário [5], [6], [7]. FK866 é um inibidor específico da química Nampt que inibe a via de biossíntese-NAD recuperação por ligação no local de ligação de nicotinamida-Nampt, desse modo, as células de NAD [23], [24] esgotando. Alegadamente, FK866 é bem tolerado, e inibe significativamente o crescimento celular em algum tipo tumores [13], [15]. No entanto, o efeito de FK866 em câncer colorretal não foi documentada.

Foram analisados ​​o efeito de FK866 na taxa de sobrevivência de células de câncer colorretal humano células SW480 e LoVo por CCK-8 ensaio e citometria de fluxo. Os resultados mostraram que FK866 promoveu significativamente a apoptose de células SW480 e LoVo de uma forma dependente da dose. A IC

50 de FK866 foi de 14,3 nM para células SW480 e 32,7 nM para células LoVo, de acordo com o ensaio CCK-8 (Figura 1A). A citometria de fluxo estudos mostraram que a exposição das células SW480 e LoVo com a concentração diferente de FK866 durante 3 dias aumentou a percentagem de células apoptóticas em fase inicial de 3,37 ± 0,83% para 27,27 ± 1,49% (SW480) e 3,00 ± 0,37% para 21,53 ± 1,76% (LoVo) (Figura 1B).

A. As células foram tratadas com diferentes concentrações de FK866 durante 72 h e, em seguida, avaliada utilizando contagem celular Kit-8. A IC

50 valores foram calculados. Cada ensaio foi repetido, pelo menos, 3 vezes. B. A quantificação de células apoptóticas induzidas por FK866 foi confirmada por análise de citometria de fluxo. Os conteúdos sub-G1 foram designados células apoptóticas. *: Contra o grupo controle negativo; **: Em comparação com 2 grupos de tratamento. níveis C. NAD em células de câncer colorretal foram medidos após a exposição a FK866. Cada barra vertical representa a média ± DP de determinações em triplicado. Para a comparação dos 2 grupos, foi utilizada uma de duas caudas, teste t não emparelhado.

A seguir, determinou o efeito de FK866 em NAD biossíntese em células usando o NAD

Kit + /NADH Quantificação . FK866 exposição durante 3 dias diminuiu o nível de NAD a partir de 5,33 ± 0,96-1,17 ± 0,31 Nm /g (SW480) e 6,63 ± 1,16-2,33 ± 0,85 Nm /g (LoVo) (Figura 1C). Estes resultados sugeriram que Nampt mediada biossíntese-recuperação NAD desempenha um papel crítico na sobrevivência de células de cancro colo-rectal e que FK866 tem propriedades anti-cancerígenos nas células de cancro colorrectal.

miR-26b inibe a expressão de Nampt via ligação a seu 3′-UTR

por análise de sequência com base em computador utilizando o software de detecção de TargetScans (https://www.targetscan.org/), Nampt foi previsto para ser um alvo potencial de miR-26b. A sequência de sementes de madura miR-26b foi conservada entre humano, chimpanzé, rhesus, e as espécies arbusto bebê, entre outros. Portanto, o miR-26b foi seleccionado para posterior caracterização biológica.

por imita o miR-26b, a sobre-expressão de miR-26b suprimida Nampt ARNm (Figura 2A à esquerda) e da proteína (Figura 2B), os níveis em células SW480, como detectada por RT-PCR e análise de western blot, respectivamente. Enquanto isso, imita o miR-26b também suprimiu o nível de NAD +, que foi medido pela NAD

+ /NADH Quantificação Kit (Figura 2D esquerda) expressão. Por outro lado, a transfecção com inibidor de miR-26b aumentada Nampt ARNm (Figura 2A à direita) e os níveis de proteína (Figura 2C), e miR-26b inibidor também aumentou o nível de NAD + (Figura 2D direita).

A. Quantitative PCR em tempo real de Nampt em linhas celulares SW480 após a transfecção com diferentes concentrações de imita o miR-26b ou inibidores. blotting B e C. ocidental de Nampt em linhas celulares SW480 após a transfecção com diferentes concentrações de imita o miR-26b ou inibidores. D. Os níveis relativos de NAD em linhas celulares SW480 após a transfecção com diferentes concentrações de imita o miR-26b ou inibidores. ensaios de repórter de luciferase E. validando a interação direta de miR-26b com o 3′-UTR de Nampt. Nampt-3′-UTR-pEZX (ou Nampt-3′-UTR-mut-pEZX) foi co-transfectado com mímica miR-26b ou um controlo negativo em células SW480. *: Contra o grupo controle negativo; **: Em comparação com 2 grupos de tratamento. Cada barra vertical representa a média ± DP de determinações em triplicado. Para a comparação dos 2 grupos, foi utilizada uma de duas caudas, teste t não emparelhado.

Para confirmar que Nampt é alvo de miR-26b, o efeito da transfecção com imita miR-26b no foi examinada a actividade repórter do tipo largo e mutado pEZX-Nampt. pEZX-Nampt é uma construção repórter de luciferase dupla contendo um grande segmento ou tipo mutante do Nampt 3′-UTR com a sequência de reconhecimento de miR-26b imediatamente a jusante do repórter de luciferase de pirilampo (Figura S1A). Um diagrama de Nampt com sequências de tipo selvagem ou mutantes, no local de ligação do potencial de miR-26b é mostrado na Figura S1B. Os mapas de sequência de tipo selvagem e mutado Nampt obtida por sequenciação do gene são mostrados na Figura S1C. Tal como mostrado na Figura 2E, a transfecção com uma concentração diferente de imita o miR-26b diminuiu a actividade repórter da luciferase do pirilampo de tipo selvagem pEZX-Nampt por aproximadamente 51,7% ± 3,2% e 64,3% ± 4.0%, respectivamente. A indução da actividade repórter por sobre-expressão de miR-26b por imita o miR-26b, no entanto, não foi detectado quando a sequência de reconhecimento de miR-26b na 3’UTR do ARNm Nampt foi mutada (Figura 2E). Portanto, os resultados das Figuras 2 confirmam que Nampt é alvo de miR-26b.

Os níveis de expressão de miR-26b e Nampt em Colorectal Cancer tecidos e linhas celulares

Os níveis de expressão basal de miR-26b e ARNm Nampt foram medidos por qRT-PCR em linhas celulares de cancro colorrectal (HT-29, SW480, SW1116, LoVo, e HCT116), e os níveis de expressão basal de NAD + também foram medidos pelo NAD

+ /Kit de NADH quantificação em linhas celulares. células SW480 apresentou a menor expressão Nampt e nível de NAD +, e o nível de miR-26b mais alta, seguido de HT-29, HCT 116, LoVo e SW116 células (Figura 3A esquerda). Observou-se uma significativa correlação inversa entre a expressão de miR-26b e mRNA Nampt, e uma correlação positiva entre a NAD + e mRNA Nampt também foi observado (Figura 3A direita).

A. miR-26b, ARNm Nampt e níveis de NAD + foram testados em linhas celulares de cancro colorrectal. A expressão de miR-26b foi inversamente correlacionada com a expressão Nampt em linhas celulares de cancro colorrectal; a expressão de NAD + foi positivo correlacionada com a expressão Nampt em linhas celulares de cancro colorrectal (A direita). níveis B. miR-26b e mRNA Nampt foram ensaiadas em 18 espécimes cirúrgicos de tecidos de câncer colorretal e tecidos humanos colorretais normais adjacentes. níveis Nampt significativamente upregulated em tecidos de câncer colorretal são mostrados em relação aos níveis Nampt em tecidos normais adjacentes colorretal (dobre alterações 6); significativamente regulada negativamente os níveis de miR-26b em tecidos de câncer colorretal são mostrados em relação aos níveis de miR-26b em tecidos normais adjacentes colorretal (dobre alterações 2). C. A expressão de miR-26b foi inversamente correlacionada com a expressão Nampt em tecidos de câncer colorretal (C à esquerda), e os tecidos normais adjacentes colorretal (C direita). Os níveis de ARNm Nampt foram ensaiadas por em tempo real de RT-PCR e normalizadas para GAPDH. Os níveis de miR-26b foram doseados por em tempo real de RT-PCR e normalizada para U6. Cada barra vertical representa a média ± DP de determinações em triplicado. Para a comparação dos 2 grupos, foi utilizada uma de duas caudas, teste t não emparelhado.

Além disso, estendemos nossa investigação com amostras de pacientes com câncer colorretal. Nossos resultados mostraram que a expressão Nampt foi significativamente aumentada em tecidos de câncer (6,3 vezes) quando comparado com o que nos tecidos normais adjacentes emparelhados no painel de 18 pacientes com câncer colorretal (Figura 3B direita), que foi consistente com os resultados dos outros [5 ], [6], [7]. Além disso, encontramos o tecido canceroso mostrou uma perda notável de miR-26b (~45.45%) em comparação com os tecidos normais adjacentes colorectal câncer no grupo de 18 pacientes com câncer colo-retal (Figura 3B esquerda), que não foi avaliado antes . Observou-se uma correlação inversa entre miR-26b e expressão Nampt em tecidos cancerosos (Figura 3C esquerda) e tecidos normais adjacentes (Figura 3C direita).

miR-26b Inibe a célula de sobrevivência e Invasion, e isso pode ser parcialmente abolida pela adição de NAD

o Nampt é conhecida para regular uma variedade de actividades biológicas, incluindo a sobrevivência celular e invasão. Uma vez que o miR-26b é acreditado para segmentar Nampt, o efeito de miR-26b na sobrevivência celular e invasão foi investigada. células Além disso, co-transfectadas com mímico miR-26b, em seguida, 1,0 mM /L de NAD + (eficácia máxima) foi adicionado para determinar se os efeitos de miR-26b são mediadas por biossíntese NAD Nampt-mediada.

Usando o ensaio CKK-8, as células tratadas com inibidor de miR-26b tinha a proliferação de células mais elevada, seguido por células tratadas com o controlo negativo, imita o miR-26b mais NAD, e imita o miR-26b sozinho (Figura 4A). Um aumento de 21,1% no crescimento celular foi observada em células LoVo 4 dias após a transfecção com o inibidor de miR-26b, quando em comparação com o crescimento no controlo negativo. No entanto, a transfecção com imita o miR-26b suprimiu o crescimento de células LoVo por 31,48% em comparação com o controlo negativo. A transfecção com imita o miR-26b mais NAD aumentou o crescimento das células LoVo por 26,85% em comparação com o grupo transfectadas com apenas imita o miR-26b.

. células LoVo foram tratados com imita o miR-26b et al., e a viabilidade celular foi determinada utilizando contagem celular Kit-8. B. A quantificação de células apoptóticas induzidas por imita o miR-26b (com e sem NAD) ou inibidor de miR-26b foi confirmada por análise de citometria de fluxo. Os conteúdos sub-G1 foram designados células apoptóticas. micrografias C. representativos de ensaios de invasão celular (à esquerda) e quantificação (direita) de tratamentos diferentes (* P 0,01). As células invasoras coradas foram fotografados em um microscópio de luz invertida (100 vezes). *: Contra o grupo controle negativo; **: Em comparação com 2 grupos de tratamento. Cada barra vertical representa a média ± DP de determinações em triplicado. Para a comparação dos grupos 2, foi usada uma bicaudal, teste t não emparelhado.

A citometria de fluxo, os resultados do ensaio estão apresentados na Figura 4B. Expondo as células LoVo a inibidores de miR-26b durante 4 dias reduziu significativamente a percentagem de células apoptóticas em fase inicial (3,03 ± 0,72% em comparação com o 7,33 ± 0,60% no grupo de controlo negativo). Transfecção com imita miR-26b e NAD diminuiu consideravelmente a taxa de apoptose em estágio inicial (12,23 ± 0,35% em comparação com 24,2 ± 0,79% no grupo transfectadas apenas com imita miR-26b).

De interesse, miR- supressão 26b afetado não só a sobrevivência da célula, mas também a invasão (Figura 4C). A transfecção com o inibidor de miR-26b notavelmente aumentada a eficiência invasão de células LoVo (1,7 vezes) de acordo com o ensaio Transwell. A transfecção com imita o miR-26b, no entanto, reduziu a eficiência de invasão de células LoVo para 34,53%, e isto foi parcialmente resgatado pela adição de NAD (aumentada para 66,10%). Os resultados da Figura 4, por conseguinte, indicam que o miR-26b inibiu a sobrevivência celular e invasão em células LoVo. A adição de NAD revogada parcialmente este efeito.

Discussão

Estudos têm mostrado que Nampt é significativamente aumentada no cancro colo-rectal primário [5], [6], [7] e outros cancros [8 ], [9], [10], [11]. Assim, Nampt pode ser um bom biomarcador de potencial maligno e fase de progressão [1], [8], [25], [26]. mediada por Nampt biossíntese NAD desempenha um papel fundamental no metabolismo celular, funções de sobrevivência, e resistência à tensão por meio de SIRTUINAS e outros reguladores de consumo de NAD [1]. O FK866 inibidor químico específico Nampt-esgota células de NAD intracelular por ligação ao local de ligação de nicotinamida de Nampt e inibição da via de salvamento NAD [23], [24]. Em células cancerosas, FK866 exibe anti-tumoral [27], anti-metastático [15], e as actividades anti-angiogénicas [28] e um efeito quimio-sensibilizadores [27]. Em contraste, alguns estudos mostraram células não tumorigénicas não foram afectadas por FK866 [29], [30]. Estes podem ser explicadas pelo facto de que as células cancerosas necessitam de níveis de NAD + superiores para acomodar com alta taxa metabólica do que as células normais. Por conseguinte, há uma diferença de dose-resposta entre as células malignas e normais como para os níveis de NAD celular + conteúdo. Portanto, FK866 é bem tolerado, e inibe significativamente o crescimento do tumor in vitro e in vivo. Estes resultados são suportados por muitas pesquisas [12], [13], [14], [15]. Neste estudo, mostraram pela primeira vez que FK866 sobrevivência celular e inibiu significativamente reduzidos níveis de NAD nas células LoVo e SW480, o que sugere que o mecanismo biossintético NAD Nampt mediada é activa em células de cancro colorrectal. Interessante, havia pouca correlação entre a diminuição do NAD + e o aumento da apoptose utilizando FK866 de acordo com os nossos resultados (r = -0,8544,

p

= 0.3479). Pode haver duas conjecturas diferentes como para o resultado. Em primeiro lugar, pode haver um efeito limiar, devido à elevada concentração de FK866. Em segundo lugar, Thakur, B. K. relatado FK866 é capaz de induzir apoptose em células leucémicas indirectamente através da activação da proteína p53 tumor-supressor [13], e esta via também pode funcionar em células de cancro colorrectal. Embora houvesse pouca correlação entre NAD + e apoptose de acordo com nossos resultados, isso não afetaria o fato de que FK866 pode ser um agente promissor para o câncer colorretal. Os mecanismos moleculares responsáveis ​​pela expressão elevada de Nampt no cancro colorectal não são completamente compreendidos.

Recentemente, foi relatado que a expressão inapropriada de miARNs contribui para a patogénese de cancro. diminuição dos níveis de miR-26b são observados em uma ampla variedade de tumores [17], [31], [32], [33], [34], [35], [36], [37]. Nos nossos estudos, mostrou que a expressão de miR-26b foi significativamente regulada negativamente em 18 amostras cancerosas de doentes com cancro colorectal. Em pacientes com cancro colo-rectal, o miR-26b foi 2,2 vezes mais elevada em tecidos normais adjacentes do que em tecidos cancerosos (p 0,0001). Nós originalmente identificada como um alvo Nampt de miR-26b por análises de bioinformática, ensaios de repórter da luciferase, e ensaio facção por transfecção de miR-26 imita ou inibidores. A sobre-expressão de miR-26b através de transfecção de miR-26 imita diminuiu significativamente Nampt ARNm e os níveis de proteína in vitro. O nosso estudo mostrou que imita o miR-26b são mais eficazes na apoptose do que nos ensaios de proliferação. Os resultados consistentes com outros estudos que a inibição da Nampt causou citotoxicidade geral [13]. Knockdown de miR-26b através de transfecção de inibidores de miR-26b aumentou significativamente Nampt ARNm e os níveis de proteína. Isso indica que o miR-26b regula Nampt principalmente através da repressão translacional. Enquanto isso, os nossos resultados em vias reguladoras do miR-26b foram associados com capacidade de invasão e metástase em células de cancro colorrectal. Ma et al. mostraram que a sobre-expressão de miR-26b inibida no crescimento do tumor in vivo em ratinhos injectados com células LoVo [38]. Além disso, verificou-se que a inibição da sobrevivência celular e invasão por sobre-expressão de miR-26b pode ser parcialmente resgatado pela adição de NAD. Este resultado indica que a inibição de miR-26b da sobrevivência de células tumorais e invasão envolve mediada por Nampt biossíntese NAD. Assim, nossos resultados fornecem uma visão sobre a função de miR-26b na regulação tumorigênese colorretal. Além disso, dado que as funções Nampt no metabolismo e respostas imunes, miR-26b também pode afetar estes processos atenuando a tradução de Nampt. Isto sugere uma explicação mecanicista para a regulação negativa de miR-26b em ratos diabéticos [39].

No entanto, o mecanismo pelo qual o miR-26b e Nampt regular tumorigénese pode não ser assim tão simples. Quando a concentração de NAD + foi maximamente eficaz, a recuperação não foi totalmente recuperado. A via alternativa poderia ser possível envolvimento. Primeiro, estudos recentes indicam que o miR-26b tem muitos outros alvos directos, tais como o EphA2 [40], SLC7A11 [32], Lef-1 [41], proteína pRb [42], e a COX-2 [36]. Em segundo lugar, outros do que o miR-26b miARN alvo pode Nampt expressão. Por exemplo, miR-182 subregulado expressão Nampt em induzida por Tat do HIV-1 repetição terminal longa (LTR) transativação [43]. Em terceiro lugar, embora seja relatado que o regulamento da glicose estimulada secreção de insulina e mTORC1 e via de sinalização ERK1 /2 estão envolvidos na síntese de NAD de salvamento Nampt-media [12], [44], outras vias de sinalização envolvendo Nampt, tais como PI3K /Akt [45] e STAT3 [46], [47], também participam na formação de tumores, a transformação, e a angiogénese. Tomados em conjunto, a via de sinalização miR-26b-Nampt-NAD contribui para a sobrevivência de células de câncer colorretal e de invasão, mas não é o único caminho.

Conclusão

Em resumo, o nosso estudo sugere que o miR-26b regula negativamente a expressão Nampt ao nível pós-transcricional por se ligar ao seu 3′-UTR. Além disso, o miR-26b inibiu o crescimento tumoral e a invasão, e este efeito foi parcialmente anulada pela adição de NAD. Nós também descobrimos que os níveis de miR-26b em tecidos de tumor colo-rectal de pacientes eram muito mais baixos do que em tecidos normais adjacentes, e que a expressão de miR-26b inversamente correlacionada com a expressão de ARNm Nampt em linhas celulares de cancro colo-rectal e cinco amostras de doentes. Estes resultados indicam que nossos resultados são clinicamente relevantes: a sobre-expressão de miR-26b e inibição da via de sinalização Nampt-NAD pode ser uma justificativa para intervenções terapêuticas em câncer colorretal no futuro

Informações de Apoio

Figura S1. .

luciferase ensaios de repórter de validação a interação entre miR-26b e Nampt. A. Construção do repórter pEZX-MT01 da luciferase (Luc-Nampt 3′-UTR). hLuc, vaga-lume gene repórter luciferase; hRLuc, gene repórter da luciferase de Renilla. expressão da luciferase do pirilampo é regulada através da ligação da miARN alvo para a sequência de 3′-UTR. Firefly atividade luciferase foi normalizada para a actividade luciferase Renilla. B. Diagrama de Nampt com o tipo selvagem e sequências mutantes no potencial local de ligação de miR-26b. mapas C. sequência de tipo selvagem e sequências Nampt mutantes estabelecida por sequenciação genética

doi:. 10.1371 /journal.pone.0069963.s001

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