Sumário

TIG3 é uma proteína supressora de tumor que limita a sobrevivência de queratinócitos durante a diferenciação normal. É também importante no cancro, como nível TIG3 é reduzida em tumores e em linhas celulares de cancro da pele, sugerindo que a perda de expressão pode ser necessária para a sobrevivência de células de cancro. Um objectivo importante é identificar como TIG3 limita a sobrevivência da célula. No presente estudo, mostramos que a expressão TIG3 em carcinoma de células escamosas células epidérmicas SCC-13 reduz a proliferação celular e promove a apoptose morfológica e bioquímica. Para identificar o mecanismo que impulsiona essas mudanças, demonstramos que TIG3 localiza perto do centrossoma e que a acumulação pericentrosomal de TIG3 altera microtúbulos e microfilamentos organização e distribuição organela. acumulação organela no centrossoma é uma característica da apoptose e demonstramos que TIG3 promove a acumulação organela pericentrosomal. Estas alterações estão associadas com ciclina D1 reduzida, ciclina E e ciclina A, e aumento do nível de p21. Além disso, Bax nível é aumentado e o nível de Bcl-XL é reduzido, e a clivagem de procaspase 3, procaspase 9 e PARP é aumentada. Propomos que a localização pericentrosomal de TIG3 é um evento chave que resulta em microtúbulos e redistribuição microfilament e clustering organela pericentrosomal e que leva a apoptose de células cancerígenas

Citation:. Scharadin TM, Jiang H, Jans R, Rorke EA, Eckert RL (2011) TIG3 supressor de tumor-Dependent Organela redistribuição e apoptose em células de cancro da pele. PLoS ONE 6 (8): e23230. doi: 10.1371 /journal.pone.0023230

editor: Janine Santos, da Universidade de Medicina e Odontologia de New Jersey, Estados Unidos da América

Recebido: 25 Março, 2011; Aceito: 12 de julho de 2011; Publicação: 17 de agosto de 2011

Direitos de autor: © 2011 Scharadin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde concede ao PR (NIH R01 AR094713 e NIH R01 AR04694). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

TIG3 (gene induzida pelo Tazaroteno 3), que também é chamado de resposta do receptor de ácido retinóico 3 (RARRES3) e o gene 1 (RIG1) retinóide induzível [1] – [5], é uma cento e sessenta quatro proteína aminoácido [6]. TIG3 foi originalmente identificado como o aumento após tratamento de queratinócitos epidérmicos cultivadas ou epiderme psoriática com o retinóide sintético, Tazaroteno [6]. Ela é expressa em níveis baixos no hiperproliferativas da epiderme (por exemplo, carcinoma de células escamosas e psoríase) e a expressão é restaurada por tratamento retinóide [7] – [9]. Na epiderme psoriática tratados com retinóides, o aumento da expressão TIG3 está associada com a restauração da diferenciação normal [6], [10]. A associação do aumento da expressão TIG3 com o fenótipo da epiderme normal, sugere que TIG3 pode actuar como um regulador de pró-diferenciação. Para analisar o mecanismo de acção, foi estudada em função TIG3 queratinócitos humanos normais [10] – [12]. Estes estudos mostram que TIG3 está presente em níveis baixos em infimamente queratinócitos em cultura em monocamada, mas é aumentado em culturas de jangada diferenciadas [12]. expressão mediada por vectores de TIG3 nos queratinócitos resulta em proliferação reduzida e aumento da formação do envelope córneo, sugerindo que TIG3 regula a diferenciação de queratinócitos [10] – [12]. Estudos em andamento mostram que TIG3 opera através de vários mecanismos, mas um mecanismo importante de ação é regulação da actividade transglutaminase [10], [11]. Tipo I transglutaminase (TG1) é uma enzima chave na queratinócitos e outros epitélios de superfície que se expressa em células suprabasais diferenciada [13] – [20]. A transglutaminase catalisa a formação de ∈- (γ-glutamil) lisina ligações cruzadas proteína-proteína para a montagem do invólucro cornificado, um componente essencial da barreira epidérmica [21], [22]. Nossos estudos sugerem que TIG3 co-localiza com TG1 levando ao aumento da actividade de transglutaminase [10], [11]. Estudos adicionais demonstram que TIG3 reduz a proliferação de queratinócitos, mas não provoca a apoptose [10], [11]. TIG3 consiste de um segmento hidrófilo de terminal amino e um domínio C-terminal de ancoragem membrana [6], [23]. estudos de mutagénese indicam que os mutantes sem o domínio de ancoragem a membranas C-terminal não são activos [10], [11], [23]. Em contraste, o truncamento do terminal N TIG3 converte em uma proteína que provoca a apoptose em queratinócitos [12].

TIG3 é expresso em níveis reduzidos em tumores de pele [7]. Assim, um dos principais objetivos do presente estudo é caracterizar o impacto da expressão TIG3 em células de câncer de pele. Nós mostramos que o restabelecimento da expressão TIG3 reduz a sobrevivência de células de carcinoma de células escamosas da epiderme através de um mecanismo que envolve a localização TIG3 pericentrosomal levando a organização de microtúbulos e distribuição alterada organelo. Isto é associado com as mudanças no nível de ciclo e apoptose reguladores celulares.

Resultados

expressão TIG3 diminui o número de células

Começamos por analisar o impacto da TIG3 em SCC- 13 a sobrevivência celular. TIG3 foi entregue por infecção com adenovírus. FIG. 1A mostra que as células infectadas com o vector vazio aumentar em número através de 72 h, mas que o número de células é significativamente reduzida às 48 e 72 h em células que expressam TIG3. FIG. 1B mostra que o nível TIG3 é máxima nas células infectadas por 24 e 48 h após a infecção e é reduzido por 72 h. Em adição ao monómero TIG3, observa-se acumulação de formas de elevado peso molecular que se pensa ser covalentemente reticulada TIG3 [10] – [12]. Como relatado anteriormente, TIG3 é expressa a baixos níveis na maioria das células transformadas [10], [11] e, por conseguinte, não é detectada no tempo zero.

subconfluentes de culturas de células SCC-13, que crescem em 3,8 cm

2 poços, foram infectadas com 10 MOI tAd5-EV ou tAd5-TIG3. Aos 0, 24, 48, e 72 h pós-infecção, as células foram contadas e os lisados ​​preparados. Uma expressão TIG3 diminui número de células. Os valores são média ± SEM, n = 3. Essas comparações marcados com um asterisco são significativamente diferentes, tal como determinado pelo teste t de Student (p 0,001). B TIG3 é detectado por immunoblot em tAd5-TIG3 infectadas células SCC-13. O monómero é visível a 18 kDa e o suporte de peso molecular mais elevado indica TIG3 reticulado [10], [11]. Os pesos moleculares estão indicados à esquerda da mancha em kDa.

TIG3 diminui a proliferação celular por inibição da progressão do ciclo celular

próxima monitorizada a progressão do ciclo celular. Começamos por estimativa da percentagem de células em fase S utilizando marcação com BrdU. células SCC-13 foram infectadas com vírus que expressam TIG3 e após 24 h marcadas com BrdU durante 2 h antes de detecção de BrdU e TIG3. Como mostrado na Fig. 2A, 54 ± 2,8% (média ± SEM) de células infectadas com EV foram positivas para BrdU, em comparação com 23% ± 4% de células que expressam TIG3. Como mostrado na Fig. 2B, os mais proeminentes alterações do ciclo celular são uma redução no G1 e aumentar em eventos subG1. Para investigar o mecanismo responsável por essas mudanças, medimos o nível de proteínas-chave reguladores do ciclo celular. FIG. 2C mostra que (CDK1, CDK2, CDK4, CDK6), os níveis de quinase dependente de ciclina não são alteradas pelo TIG3, mas os níveis de ciclina D1 e Ciclina E são diminuídas e o nível de p21 é aumentada. Estas mudanças são consistentes com a progressão reduzida através da fase G1 e /transição G1 S. FIG. 2D mostra que o nível de ARNm de p21 aumenta em paralelo com o aumento na proteína p21.

a SCC-13 células cultivadas em lamelas foram infectadas com 10 MOI de vírus ou EV-TIG3 codificação e após 24 h tratados com 10 uM BrdU durante 2 h e, em seguida, fixadas e coradas com anti-BrdU (vermelho) e anti-TIG3 (verde). A incorporação de BrdU é um marcador da fase de síntese do ciclo celular. O número de células positivas para BrdU, como uma percentagem do número total de células é apresentado abaixo de cada painel. Os valores são a média ± SEM (n = 3) e os valores são significativamente diferentes, tal como determinado pelo teste t de Student (p 0,001). Barras = 10 pm. células B SCC-13 foram recolhidos por citometria de fluxo após 24 h após a infecção com vírus ou EV-TIG3 codificação. As células foram coradas com 50 ug /ml de iodeto de propidio antes da análise. TIG3 reduz eventos no G1 e aumenta eventos subG1. C às 24 h pós-infecção, as células foram colhidas e os extractos preparados para a detecção de proteínas reguladoras do ciclo celular. Os pesos moleculares estão indicados à esquerda da mancha em kDa. Células D foram tratadas como acima e, em seguida, colhidas para a detecção de ARNm que codifica a p21 por PCR em Tempo Real. Um resultado semelhante foi observado em cada um dos três experimentos.

TIG3 induz a apoptose

A presença de conteúdo de DNA subG1 pode ser associada a apoptose celular. Por isso, avaliou o impacto do TIG3 na apoptose. Como mostrado na Fig. 3A, a expressão activa TIG3 clivagem de procaspase 9 e procaspase 3 e gera PARP clivada. Além disso, o regulador de pró-apoptótica, Bax, é aumentada e o regulador de prosurvival, Bcl-XL, é reduzida. Aumento da apoptose, também pode ser observada

in situ

. FIG. 3B mostra que muito poucas células de PARP-positiva clivados são observadas em culturas de controlo (1 ± 1%, média ± SD), mas o número que está significativamente aumentada em culturas TIG3-positivo (23 ± 8%). Estes resultados, juntamente com o aumento do teor de DNA subG1 (Fig. 2B), sugerem que TIG3 induz a morte celular por apoptose.

A células SCC-13 foram infectadas com 10 MOI de EV ou vírus TIG3-codificação e depois 24 h lisados ​​foram preparadas para a detecção de marcadores de apoptose. O suporte indica alto peso molecular TIG3 reticulado [10], [11]. Os pesos moleculares estão indicados à esquerda da mancha em kDa. B às 24 h pós-infecção SCC-13 as células foram fixadas e coradas com anti-PARP clivada (vermelho). TIG3 aumentos clivada coloração PARP. A percentagem de células positivas de PARP clivada é apresentado em cada um dos painéis (média ± DP). As setas indicam células clivado PARP-positiva. Resultados similares foram observados em cada um dos três experimentos.

TIG3 localiza em um local pericentrosomal e provoca organela redistribuição

Para obter insights sobre o mecanismo de ação TIG3 acompanhámos TIG3 localização subcelular em células tAd5-TIG3 vírus infectado. Como mostrado na Fig. 4A, TIG3 (verde) acumula-se ao longo da periferia de células perto da membrana plasmática (pontas de seta) e em uma localização perinuclear (setas), e os núcleos de células que expressam TIG3 são reduzidas em tamanho. Para avaliar ainda mais a localização TIG3, as células foram coradas para detectar pericentrin, um marcador centrossoma. As imagens na Fig. 4B revelam coloração TIG3 justapostos com coloração pericentrin (seta branca) adjacente ao núcleo (N). TIG3 (verde) localiza na vizinhança geral da pericentrin (vermelho), sugerindo a acumulação nas imediações do centrossoma.

A células SCC-13 foram infectadas com 10 MOI tAd5-EV ou tAd5-TIG3 e às 24 h pós-infecção foram fixadas e coradas com anti-TIG3 (verde). As setas indicam pericentrosomal e pontas de setas indicam a localização da membrana. Nenhuma TIG3 é detectada nas células infectadas com vector vazio. As células B, infectados como acima, foram fixadas e coradas com TIG3 (verde) e pericentrin (vermelho). As setas indicam pericentrin coloração do centrossoma e n indica os núcleos. Bares = 10 mm.

O centrossoma é um ponto de controle para uma ampla gama de funções celulares. Ele funciona como centro de microtúbulos organizadora (MTOC), que é o local de montagem de microtúbulos [24], [25]. Além disso, ele replica durante a divisão celular e os centrossomas filha servem para organizar os fusos mitóticos que orientam a separação cromossoma [24], [26]. Importante, a MTOC serve como um ponto de controlo para o movimento de carga transportada-motor molecular, incluindo organelos, ao longo dos microtúbulos [27]. Além disso, a disfunção centrossoma está associado a apoptose de células [28]. Nós, portanto, examinar se a acumulação pericentrosomal TIG3 altera a distribuição dos microtúbulos. Como mostrado na Fig. 5A, os microtúbulos em células TIG3-negativas estão espalhados por toda a célula em uma rede do tipo treliça típico que irradia para fora do centrossoma (seta branca). Em contraste, em células que expressam TIG3 (seta preta indica TIG3 pericentrosomal), os microtúbulos localizar como uma banda (setas vermelhas) na periferia da célula e não irradiam para fora a partir do centrossoma, sugerindo que a localização impactos TIG3 microtúbulos e ancoragem. Isto é melhor observado na Fig. 5A (painel inferior), que mostra apenas a coloração β-tubulina. Os microtúbulos na célula TIG3-positivo (à esquerda) não têm de cluster baseada em centrossoma, enquanto a célula TIG3-negativa (direita) tem microtúbulos centrossoma-ancorado (seta branca). Para avaliar o impacto de TIG3 na rede de microtúbulos, o número de células que apresentem os microtúbulos que irradiam a partir do centrossoma foi contado. Como mostrado na trama, a percentagem de células que apresentam redes centrossoma-dirigida é marcadamente reduzida em células TIG3 expressam.

A células SCC-13 foram infectadas com 10 MOI tAd5-EV ou tAd5-TIG3 e 24 h após a infecção as células foram fixadas e coradas com anti-TIG3 (mancha verde) e anti-β-tubulina (mancha vermelha). TIG3 acumula na localização perinuclear esperado (seta preta). β-tubulina acumula num anel atípicos na periferia da célula (setas vermelhas). A rede β-tubulina normais na célula TIG3-negativo é indicado por uma seta que aponta para o branco do centrossoma. Os núcleos foram Hoechst manchado (azul). O painel inferior é idêntica à parte superior, excepto que o sinal apenas o β-tubulina (vermelho) é indicado. Barras = 10 uM. O gráfico mostra o número de células infectadas TAD-EV e tAd5-TIG3 com matrizes de microtúbulos originou-centrossoma. As células foram contadas em vinte campos do microscópio independentes e um mínimo de uma centena de células foram contadas por grupo de tratamento. Os valores são a média ± SEM. A análise do teste t de Student emparelhado revela que os meios são significativamente diferentes (p 0,001). Para avaliar o impacto de TIG3 solubilidade em tubulina, as células foram infectadas com EV-tAd5 ou tAd5-TIG3 e depois fracções de extracto, solúveis e pelotas total de 24 horas, foram preparadas e submetidas a electroforese seguido de imunocoloração para detectar β-tubulina e β-actina. A presença da maioria dos β-actina na fracção solúvel indica que o fraccionamento foi bem-sucedida. expressão B TIG3 causa colapso de filamentos de actina em torno do núcleo. células SCC-13 foram infectadas com adenovirus como acima e após 24 h coradas com anti-β-actina (mancha vermelha) e anti-TIG3 (mancha verde). Os núcleos foram Hoechst manchado (azul). Para as células TIG3-positiva, no painel da esquerda mostra a TIG3 e sinais de p-actina (vermelho e verde), enquanto que o painel direito mostra apenas o canal β-actina (vermelho). A seta preta indica acumulação TIG3 no centrossoma e a seta vermelha indica o anel nuclear microfilament β-actina. Barras = 10 pm. O gráfico mostra o número de células infectadas TAD-EV e tAd5-TIG3 exibindo anéis de actina microfilamentosas que rodeiam o núcleo. As células foram contadas em campos do microscópio dezoito independentes e um mínimo de uma centena de células foram contadas por grupo de tratamento. Os valores são a média ± SEM. análise de teste-t emparelhado de Student revela que os meios são significativamente diferentes (p 0,001).

A redistribuição da tubulina para a membrana celular em células TIG3-positivas e sugere que pode ser insolúvel. Para avaliar isso, preparamos o extrato total de células a partir de células TIG3-negativos e positivos e preparou frações solúvel e particulares (pelotas). Em seguida, ensaiadas para β-tubulina em cada fracção por imunotransferência. Como mostrado na Fig. 5A, a β-tubulina localizada à membrana não aparece na fracção de sedimento, o que sugere que apesar de se localizada na periferia das células à ou próximo da membrana, que permanece solúvel

.

As redes de actina e tubulina interagir extensivamente e assim nós monitorado o impacto da TIG3 sobre a distribuição de filamentos de actina (Fig. 5B). Em células TIG3-negativas (EV), β-actina (vermelho) distribui por todo o citoplasma. Em contraste, em células TIG3-positiva (coloração verde) se forma um anel de filamentos de actina distintas na periferia nuclear (seta vermelha). Isto é mostrado na tanto uma imagem de fusão e coloração β-actina sozinhos (Fig. 5B). O número de células que apresentam um anel de actina nuclear foi contado. O gráfico mostra que a percentagem de células exibindo um anel de actina nuclear é significativamente aumentada em células TIG3 expressam.

Uma vez que o movimento organela e ancoragem dependem das redes de tubulina e actina [29], nós antecipamos que TIG3 pode influenciar distribuição organela. Para avaliar o impacto de TIG3 na localização organelo, as células foram coradas para detectar GM130 (cis-Golgi), receptor de manose-6-fosfato (M6PR, trans-Golgi e endossoma tardio) [30], rab11 (endossomas reciclagem), calnexina ( retículo endoplasmático), e clatrina cadeia pesada (CHC, vesículas de transporte intracelular). FIG. 6A mostra que GM130 (vermelho) localiza numa localização perinuclear nas células TIG3-negativos e positivos; No entanto, parece mais compactada em células TIG3-positivas (coloração verde). M6PR, rab11 e calnexina também apareça compactado no local pericentrosomal TIG3 em células positivas (setas brancas). Isto é facilmente visualizada de calnexina, por comparação da distribuição mostrada na imagem de cor única vermelho (inserção) com o observado em células infectadas com EV (Fig. 6A), como uma concentração pericentrosomal intensa de calnexina é observada em células TIG3-positivos . Além disso, a cadeia pesada de clatrina é um exemplo particularmente dramático, em que a coloração parece distribuído por todo o citoplasma das células infectadas com EV, mas essencialmente todo o CHC acumula nas imediações do centrossoma em células TIG3-positivos. Assim, parece que altera a distribuição TIG3 organelo intracelular de um modo que se concentra e comprime muitos organelos na vizinhança do centrossoma. Esta compactação foi quantificada pela medição da área bidimensional coberto por organelos individuais em microns quadrados usando software ImageJ (Fig. 6B). Essa análise revela uma redução substancial e estatisticamente significativa na área para GM130, M6PR e rab11. Calnexina e distribuição CHC não foi analisado desta forma, uma vez que a condensação foi óbvia. Nós também examinou o impacto de TIG3 no nível de proteína organela. FIG. 7 mostra que a expressão TIG3 provoca uma redução modesta no nível de algumas proteínas de organelos, incluindo calnexin, rab11, GM130 e EEA1; No entanto, o nível de outras proteínas marcadoras não é alterada.

a células SCC-13 foram infectadas por 10 MOI tAd5-EV ou tAd5-TIG3 e após 24 h fixadas e coradas para detectar TIG3 (verde) e várias marcadores de organelas (vermelho). Os marcadores incluem GM130 (cis-Golgi), M6PR (receptor de manose-6-fosfato, ácido trans-Golgi e endossoma tardio), rab11 (endossoma reciclagem), calnexina (ER), e CHC (cadeia pesada de clatrina, vesícula de transporte intracelular). setas brancas indicam a localização pericentrosomal de TIG3. Os núcleos são corados azul. Para GM130, M6PR e rab11, todos os painéis são imagens de vermelho /verde /azul mesclados. Os EV e TIG3 imagens de coloração calnexin são verdes imagens de vermelho /azul /mescladas. As inserções na imagem TIG3 /calnexin são imagens de uma só cor. Para a mancha CHC, apenas a imagem vermelha (CHC) é mostrado. Barras = 10 pm. impacto B TIG3 sobre a distribuição organela subcelular. Para medir organela spread, o microscópio foi focada no plano z exibindo a propagação organela máxima e a área coberta pela organela foi monitorado usando Software ImageJ e apresentado como área organela em mm

2. Os valores são a média ± SEM (n = 30 campos) incluindo a medição de um mínimo de trinta células por grupo de tratamento. Emparelhado análise t de Student identifica os meios como significativamente diferentes (p 0,001).

SCC-13 células foram infectadas em 10 MOI tAd5-EV ou tAd5-TIG3 e depois de lisados ​​de células 24 h foram preparado para a detecção de imunotransf erência das proteínas indicadas. expressão TIG3 reduz o nível de rab11, GM130 e EEA1, mas não altera o nível LAMP1. pesos moleculares estão indicados à esquerda da mancha em kDa.

Discussão

TIG3 foi originalmente identificado como aumentou após o tratamento de queratinócitos de epiderme cultivadas ou psoriática (gene 3 induzida por Tazarotene) epiderme com o retinóide sintético, Tazarotene [6], e mais tarde foi identificado em células cancerosas gástricas e chamou RIG1 [5]. Estudos subsequentes revelaram ARNm TIG3 numa variedade de tecidos e células em cultura [1], [5], [31] – [33]. TIG3 nível é aumentado por tratamento retinóide [4], [34] e, em alguns tipos de células TIG3 a expressão do gene é suprimido pela sinalização MAPK [35].

TIG3 é um membro da superfamília de NIPC /P60 de proteínas [ ,,,0],36]. O domínio N-terminal (aa1-134) codifica as regiões que são conservadas entre os membros da aciltransferase lecithin:retinol (LRAT) e H-REV famílias supressores de tumor [37] – [39]. A análise funcional da estrutura TIG3 indica que o domínio hidrofóbico (aa135-164) funções C-terminal como uma âncora na membrana [6], [23], e que o N-terminal de região codifica independente de cálcio 2 fosfolipase A1 actividade /[31] [32], [40]. Além disso, a fosfolipase A1 actividade /2 não exige que o hidrófobo domínio C-terminal [40]. TIG3 foi mostrado para reduzir a sobrevivência celular em vários tipos de células [6], [10], [11], [34], [41], [42], mas o mecanismo responsável pela supressão não é bem compreendido. Em alguns tipos de células, TIG3 pode actuar através da regulação da MAPK e PI3K /Akt sinalização [1], [3], [41].

TIG3 na epiderme

TIG3 é expresso na suprabasal camadas diferenciadas de culturas de queratinócitos jangada [12] e na epiderme suprabasal [7], [8], e expressão TIG3 é reduzida na doença hiperproliferativa da pele e células de cancro da pele em [6] – [9]. tratamento retinóide aumenta o nível de TIG3 e isto está associado com a proliferação celular reduzida [6] – [9]. TIG3 não é expresso em queratinócitos normais mantidas em cultura em monocamada e expressão TIG3 mediada por vector é associado com o número de células reduzido [8], [10] – [12]. estudos sobre os mecanismos em queratinócitos mostram que é necessária a membrana c-terminal domínio de ancoragem para a actividade [10], [11], [23] e eventos relacionados à diferenciação que a expressão de TIG3 em cultura de queratinócitos humanos normais ativa seleccionados [10] – [ ,,,0],12]. Em particular, TIG3 interage com transglutaminase tipo I (TG1) para aumentar a actividade catalítica TG1 [10], [11]. TG1 é uma enzima chave na diferenciação de queratinócitos que catalisa a formação de ligações cruzadas de proteína-proteína que conduzem a montagem do invólucro cornificado, um importante componente da barreira de permeabilidade da pele [43]. proteína TIG3 Full-length estimula a actividade transglutaminase associada à diferenciação nos queratinócitos. Em contraste, as formas truncadas no terminal amino causar apoptose e o nível de apoptose é mais pronunciada à medida que o terminal N é encurtado [12]. Outros estudos apontam para efeitos exclusivos de vários subdomínios TIG3 [40], [42], [44]. O padrão suprabasal de expressão TIG3 na epiderme é consistente com um papel de TIG3 como um controlador de eventos relacionados à diferenciação dos queratinócitos.

expressão TIG3 em células de cancro da pele reduz a proliferação e aumenta a apoptose

Estudos anteriores indicam que TIG3 ARNm está presente em níveis reduzidos em cancro da pele e em linhas celulares de cancro da pele [8]. No entanto, pouco se sabe a respeito de se TIG3 regula a sobrevivência da célula câncer de pele e progressão tumoral. Nós mostramos que a expressão de TIG3 provoca uma redução acentuada no número de células SCC-13, que está associada à redução G1 e eventos de fase S e aumento do teor de ADN sub-G1. Estas alterações do ciclo celular está associada com alterações dependentes do nível TIG3 em proteína reguladora do ciclo celular. expressão TIG3 reduz os níveis de ciclina D1 e E ciclina e aumenta o nível do inibidor de quinase dependente de ciclina p21. Estas descobertas são consistentes com uma diminuição na progressão da célula através da transição G1 /S. Além disso, demonstra-se que TIG3 aumenta a apoptose de células SCC-13, conforme evidenciado pelo aumento da produção da caspase 9 e 3 activado e aumento de PARP clivada. Além disso, estudos revelam imunocoloração PARP clivada acumula nas células TIG3-positivos. Estes resultados são particularmente interessantes como TIG3 não causa apoptose em queratinócitos humanos normais. Em vez disso, faz com que as células TIG3 para sofrer diferenciação [10] – [12]. Em contraste, as formas mutantes de TIG3 causar apoptose em queratinócitos humanos normais [12]. O facto de TIG3 provoca a apoptose em células de cancro sugere um mecanismo de acção diferente em células normais contra transformadas. Além disso, algumas destas alterações estão associadas a alterações no nível de ARNm do gene alvo. Por exemplo, o aumento dependente da TIG3 em proteína p21 está associada com um aumento paralelo em ARNm que codifica a p21, indicando que TIG3 regula a transcrição do gene de p21 ou a estabilidade do ARN. Nós atualmente não sabemos se esta ação é direta ou indireta.

TIG3 expressão está associada com o clustering organela pericentrosomal

Uma questão importante é onde TIG3 está localizada na célula. Um estudo anterior interessante em células de cancro do colo do útero HeLa sugere que TIG3 localiza na cis- e trans-Golgi e que esta localização é necessário para estimular a apoptose [2]. Como mostrado na Fig. 6A, co-coloração com anticorpo de células SCC-13 sugere que TIG3 localiza na cis- e trans-Golgi (GM130, M6RP), o endossoma tardio (M6PR), o endossoma reciclagem (rab11), retículo endoplasmático (calnexina) e as vesículas de transporte intracelulares (CHC). No entanto, pensamos que é improvável que TIG3 está localizada principalmente nestas estruturas, por diversas razões. Em primeiro lugar, TIG3 só aparece para localizar com a organela única nas imediações do centrossoma e não mais perifericamente. Em segundo lugar, nós mostramos que TIG3 altera microtúbulos e distribuição microfilament e isso está associado ao acúmulo de organela pericentrosomal. Em terceiro lugar, em outro relatório que estão a estudar a distribuição de TIG3 nos queratinócitos humanos normais e estes estudos sugerem fortemente um local TIG3 pericentrosomal (não mostrado). Com base nestes resultados, nós argumentam que o principal efeito do TIG3 está no centrossoma e que o aparecimento de co-localização de TIG3 com marcadores organela é um artefato devido ao agrupamento organela pericentrosomal.

Organela deslocalização é um bem conhecido fenómeno que ocorre durante a apoptose [45]. Pensa-se para melhorar a membrana organela mistura para facilitar a propagação de efectores pró-apoptóticos [45] – [50]. No entanto, como estes organelos e fragmentos de organelos unem-se durante a apoptose não é bem compreendido, mas pensa-se que envolve o centrossoma e microtúbulos. O centrossoma serve como um centro organizador de microtúbulos (MTOC) em células em interfase e como um organizador do aparelho mitótico em células mitóticas. Como um centro de nucleação dos microtúbulos, a função do centrossoma é necessário para tráfico intracelular organelo [24], [51]. Organelas mover ao longo dos microtúbulos associados com motor proteínas específicas [27], [51]. Relatórios anteriores implicam motores de microtúbulos em trazer fragmentos de organelas e organelas ao centro de microtúbulos organizadora (centrossoma) durante a apoptose [45], [52]. Estes incluem o aparelho de Golgi, endossomas, retículo endoplasmático, mitocôndria e outros organelos [45], [47], [53], [54]. O melhor exemplo é caracterizado redistribuição das mitocôndrias para o centro organizador dos microtúbulos de Golgi proximal, em células expostas a TNF, o stress oxidativo ou infecção viral [45]. Vários relatos sugerem que este processo ativa MAPK sinalização para fosforilar cinesina cadeia leve para deter mitocôndrias dispersão anterógrada levando ao acúmulo dessas organelas perto do centrossoma [45].

Estes relatórios anteriores descrevem agrupamento organela pericentrosomal em resposta ao tratamento com factores de crescimento, o stress oxidativo ou outros estímulos [45]. Os nossos estudos presentes são únicos na medida em que o agrupamento organelo é desencadeada por expressão de uma proteína supressora de tumor. Além disso, o facto de TIG3 acumula perto do centrossoma sugere que possa ter um papel directo na regulação da circulação organelo durante a apoptose. Os nossos estudos revelam que a presença TIG3 altera a localização subcelular normal dos microtúbulos e microfilamentos, que pode ser um mecanismo pelo qual ele altera localização organelo. Estudos futuros terão de enfrentar se TIG3 também altera microtúbulos transporte dependente do motor da organelas. Nossa hipótese de trabalho é que TIG3 podem alterar tanto a distribuição de microtúbulos e função motora baseada no microtúbulos para causar agrupamento organela pericentrosomal. Com base em nossa análise, TIG3 promove acúmulo de organelas no centrossoma incluindo retículo endoplasmático, aparelho de Golgi, endossomas de reciclagem, endosome tarde, e vesículas de transporte. No entanto, nem todos os organelos são transportados para o centrossoma. Por exemplo, lisossomas, tal como medido por detecção de LAMP1, distribuir em matrizes de microtúbulos ao longo e, em células TIG3-positivos, este padrão é intensificada (não mostrado). Assim, estudos adicionais serão necessários para compreender o papel da TIG3 na regulação da função dos microtúbulos e transporte organela.

Materiais e Métodos

infecção

Cultura de Células e adenovírus

SCC-13 As células foram obtidas da American Type Culture Collection (Rockville, MD) e foram mantidas em meio DMEM de glicose elevada (Gibco, 11960-044) suplementado com 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml estreptomicina e soro bovino fetal a 5% (Sigma, St. Louis, MO). Os adenovírus foram produzidos como previamente descrito [10]. tAd5-TIG3

1-164, é um vírus de tetraciclina induzivel que codifica a proteína de comprimento completo TIG3 e um elemento potenciador responsivo a tetraciclina-[10], [11]. O vírus Ad5-TA codifica o transactivador de tetraciclina (TA). tAd5-EV é um vírus vazia utilizada como um controlo. Para a infecção, as células foram lavadas com PBS, incubadas com 10 MOI de TIG3 de codificação ou vírus vazio na presença de 5 MOI de Ad5-AT em DMEM contendo 6 ug de polibreno /ml (Sigma, H9268). Após 5 h, o meio foi substituído com meio isento de vírus e a incubação foi continuada durante um adicional de 24-72 h antes da preparação dos extractos de células e para imuno-histologia e imunotransferência.

métodos imunológicos

para imunotransferência, os extractos foram preparados em tampão de lise celular (Tris-HCl a 20, pH 7,5, contendo 150 mM de NaCl, 1 mM etilenoglicol-bis (aminoetílico) -tetraac�ico, 1 mM de EDTA, 1% de Triton X-100, 2,5 mM pirofosfato de sódio, glicerofosfato 1 mM, 1 vanadato de sódio mM, 1 ug /ml de leupeptina (Cell Signaling, 9803, Danvers, MA) e 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonilo. a concentração de proteína foi determinada utilizando o ensaio de proteína de Bradford da Bio-Rad (Bio-Rad,