Sumário

A activação dos receptores Notch baseia-se na sua proteólise intracelular pelo complexo de gama-secretase. Esta clivagem liberta o domínio intracelular entalhe (NIC), permitindo, assim, a translocação de NIC para o núcleo para montar numa plataforma de transcrição. Há pouca informação disponível sobre as medidas regulamentares que operam no NIC após a sua liberação do receptor transmembranar-se à sua associação com parceiros de transcrição. Interferir com estas medidas regulamentares pode potencialmente influencia o resultado nuclear de sinalização Notch. Aqui, nós exploramos um modelo confiável para estudar os eventos moleculares que ocorrem após a clivagem NOTCH1. Em células de cancro do pâncreas, o pulso de activação NOTCH1 levou a um aumento da expressão de genes alvo NOTCH nomeadamente HES1 e c-myc. Descobrimos que, após a sua libertação, o domínio intracelular NOTCH1, NIC1, sofre uma série de modificações pós-traducionais que incluem fosforilação. Mais interessante, verificou-se que a activação da via /ERK MEK promove a expressão HES1. A inibição do complexo de gama-secretase impediu a expressão HES1-ERK induzida MEK /sugerindo um mecanismo dependente de entalhe. Finalmente, os níveis mais elevados de NIC1 foram encontrados associados com os seus parceiros de transcrição [CBF1, Su (H) e LAG-1] (CSL) e MASTERMIND-LIKE 1 (MAML1) sobre MEK /ativação ERK que fornecem um mecanismo potencial pelo qual o MEK /ERK via promove a expressão de genes alvo NOTCH. Pela primeira vez, os nossos dados expostos uma via de sinalização, ou seja, a via /ERK MEK que tenha um impacto positivo sobre o resultado nuclear entalhe.

Citation: Tremblay I, Paré E, Arsenault D, Douziech M, Boucher M-J (2013) O MEK /ERK Pathway Promove sinalização NOTCH em células de cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (12): e85502. doi: 10.1371 /journal.pone.0085502

editor: Irina Lebedeva V, Universidade de Columbia, Estados Unidos da América

Recebido: 30 de agosto de 2013; Aceito: 27 de novembro de 2013; Publicação: 31 de dezembro de 2013

Direitos de autor: © 2013 Tremblay et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado por bolsas de Institutos canadenses de Pesquisa em Saúde (IC1-102949 e MOP-106.456 para MJB). MJB é um estudioso do Fonds de Recherche Santé Québec (FRQ-S) e membro do FRQ-S-financiado Centre de Recherche Clinique Étienne-Le Bel. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Os receptores Notch orquestrar uma série de processos de desenvolvimento além de garantir a homeostase do tecido adulto [1,2]. Esta via de sinalização altamente conservada tem uma arquitectura molecular relativamente simples. Após a ligação do ligante, os receptores transmembrana entalhe (NOTCH 1-4) passam por clivagens sequenciais por Adam-metaloproteases e do complexo de gama-secretase. Este último, bloqueada pelos inibidores de gama-secretase, liberta o domínio intracelular de Notch (NIC) que é livre de se translocar para o núcleo para colaborar com a proteína de ligação de ADN [CBF1, Su (H) e LAG-1] (CSL) e o mentor-LIKE co-ativador 1 (MAML1) para modular a expressão do gene. Os genes alvo mais bem caracterizados da via NOTCH são, certamente, os membros do ENHANCER HAIRY de Split (HES) família, eles próprios reguladores da transcrição [1-3]. Uma característica distinta da via de sinalização de entalhe se encontra, assim, a dupla função do receptor i.e. detecção do sinal e alcançar a resposta. Pouco se sabe sobre as medidas reguladoras que operam no NIC após seu lançamento a partir do receptor transmembranar à sua acção de transcrição. No entanto, o resultado nuclear de sinalização Notch é, muito provavelmente, rigorosamente controlada, a fim de assegurar a regulação precisa da intensidade do sinal e a duração. Estudos adicionais são, assim, claramente necessário para desvendar os mecanismos pelos quais o receptor clivado coordena a expressão de genes. Além disso, a identificação de potencial modulador de sinalização entalhe deve melhorar o nosso entendimento desta via simplista aparente.

sinalização Notch aberrante foi demonstrado que desempenham papéis importantes em malignidades hematológicas [4] e alguns tumores sólidos [2] tal como adenocarcinoma ductal pancreático (PDA). Com efeito, a reactivação de sinalização Notch é observado no início PDA patogénese e persiste ao longo da progressão da doença [5-8]. Exome sequenciamento dos tecidos PDA humana forneceu mais apoio de um papel crítico para a sinalização NOTCH na carcinogênese pancreática [9]. Curiosamente, o bloqueio da sinalização de entalhe com inibidor de gama-secretase impediu a progressão de lesões pré-malignas do pâncreas para PDA num modelo de ratinho de PDA-induzida KRAS [10,11]. , A sinalização a jusante KRAS Notável desempenha um papel crítico na carcinogénese do pâncreas como uma mutação oncogénica em KRAS são encontrados em 95% dos PDA [9,12]. Além disso, a redução do sinal de nível em linhas celulares de cancro pancreático humano relacionadas com as taxas de proliferação reduzidos, aumento da apoptose, diminuição do crescimento independente de ancoragem e diminuiu as propriedades de invasão [11,13-16]. Esta ligação entre NOTCH e sinalização RAS não é exclusivo para as células de câncer de pâncreas. Na verdade, RAS e sinalização NOTCH foram mostrados para cooperar na promoção da carcinogênese em células de câncer de mama, melanoma e leucemia [17-19]. Globalmente, tendo como alvo a sinalização NOTCH aparece uma nova estratégia terapêutica atraente especialmente para pacientes PDA [20]. No entanto, uma melhor compreensão da via é crítica para o desenvolvimento de inibidores e /ou antagonistas NOTCH eficazes uma vez que os inibidores da gama-secretase, embora úteis, não são entalhe específico e indiscriminadamente impacto em todas as vias de sinalização regulados pelo complexo de gama-secretase além instigar gastrintestinal toxicidade [21-23].

Neste estudo, exploramos um modelo fiável para estudar os acontecimentos moleculares que ocorrem após a clivagem do receptor transmembranar NOTCH1 até a localização nuclear do fragmento clivado NOTCH1 (NIC1). Nós descobrimos que, após a sua libertação, NIC1 sofre fosforilação hierárquica em células de câncer de pâncreas que se correlaciona com a expressão de genes alvo NOTCH como HES1. O mais interessante, verificou-se que a activação da via /ERK MEK promove a expressão HES1 através de mecanismos dependentes de entalhe.

Materiais e Métodos

Cultura de Células e procedimento de ativação NOTCH

O HEK293T e as linhas celulares de cancro pancreático humano MIA PACA-2 e BxPC-3 foram obtidas de ATCC e cultivadas como previamente descrito [24].

Para induzir um pulso de ativação NOTCH, nós adicionamos etilenoglicol-bis (2-aminoetílico) –

N, N, N

‘,

N’

tetraacético (EGTA) (4 mM) durante 15 minutos para as células em crescimento exponencial MIA PaCa-2. EGTA foi então removido por substituição do meio com meio de cultura normal fresco, (DMEM).

Anticorpos e Reagentes

O anticorpo específico que reconhece somente o NOTCH1 clivado (D3B8) (NIC1) foi obtido a partir de células Sinalização. Os anticorpos contra o (activo) ERK1 dupla fosforilado /2 (pErk1 /2), CSL, MAML1 e GAPDH foram adquiridos a partir de Cell Signaling. HES1 anticorpo foi de Abcam. O anticorpo para a detecção de ERK1 Total /2 foi a partir de Santa Cruz. anticorpos myc e HA foram obtidos a partir de Roche. A gama-secretase inibidor de N- [N- (3,5-Difluorophenacetyl-L-alanil)] – S-fenilglicina

t-butil éster

(DAPT) e a MEK1 /2 U0126 inibidor foram adquiridos a partir de Calbiochem . Todos os outros materiais eram da Sigma, a menos que indicado de outra forma.

Western Blot

Como publicado anteriormente [24], as células foram lisadas em tampão Triton (1% de Triton X-100, 50 mM Tris pH 7,5, 100 mM de NaCl, 5 mM de EDTA, 0,2 mM de ortovanadato, 40 mM β-glicerofosfato, 50 mM de fluoreto de sódio, 10% de glicerol, 1 mM de PMSF, 0,5? g /ml de leupeptina, 1 ug /mL de pepstatina e 0,5? g /ml de aprotinina) e limpo de detritos celulares por centrifugação. Uma quantidade igual de proteínas foram separadas por SDS-PAGE (electroforese em gel de poliacrilamida) e as proteínas foram detectadas imunologicamente após electrotransferência para membranas de nitrocelulose.

transfecções transientes

As experiências foram realizadas tal como descrito anteriormente [24-26]. Resumidamente, as células HEK293T foram transfectadas com Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com as recomendações do fabricante. O vector que codifica uma versão marcada com myc do domínio citoplasmático de rato

Notch1

(Plia-NIC1) foi obtido a partir de Addgene (plasmídeo 15131). HA-marcado MEK1 (MEK1 WT) do tipo selvagem e mutante constitutivamente activa de MEK1 (MEK1 CA) -encoding cDNAs foram gentilmente cedidas por N. Rivard (Université de Sherbrooke, Canadá) e foram previamente descritos [27]. As células foram lisadas vinte e quatro horas pós-transfecção e preparado por western blot.

Immunoprecipitation, fosfatase e Quinase ensaios

imunoprecipitações foram essencialmente realizados como previamente descrito [25,26]. Resumidamente, as células foram lavadas duas vezes com PBS gelado, lisadas em tampão Triton e limpa de detritos celulares por centrifugação. O anticorpo primário foi adicionado a 2 mg de lisados ​​celulares apuradas e incubadas durante 3 h a 4 ° C sob agitação. NIC1 endógena foi imunoprecipitada com o anticorpo anti-NOTCH1 clivado (NIC1) enquanto que o anticorpo anti-myc foi utilizado para a immunoprecipate NIC1 sobre-expresso (marcada com myc). Proteína G-Sepharose (GE Healthcare) foi subsequentemente adicionada durante 1 hora a 4 ° C sob agitação. Os imunocomplexos foram lavados três vezes com tampão Triton gelada. Em seguida, ambos os imunocomplexos foram desmanteladas pela adição de tampão de amostra de Laemmli 4x (1X = 62.5mM Tris-HCl pH 6,8, 2,3% de SDS, 10% de glicerol, PMSF 1 mM, 0,005% de azul de bromofenol e 5% β-mercaptoetanol) ou utilizadas para a fosfatase e ensaios de cinase.

Para os ensaios de fosfatase, imunocomplexos foram ainda lavadas duas vezes com 1X NEBbuffer pack para Protein MetalloPhosphatase (New England Biolabs Inc.) suplementado com 1 mM MnCl

2 e 1 mM de PMSF, 0,5 ug /ml leupeptina, 1 ug /ml pepstatina e 0,5? g /ml de aprotinina. As esferas foram, em seguida, dividido igualmente em dois tubos Eppendorf. 400 unidades de fosfatase de proteína lambda (New England Biolabs Inc.) foram adicionados a um deles e ambos os tubos foram incubados durante 30 min a 30 ° C. A reacção foi parada pela adição de tampão de amostra de Laemmli 4x.

Para os ensaios de quinase, imunocomplexos Triton-lavados foram depois lavados duas vezes com tampão de reacção de ERK1 (25 mM Tris pH 7,5, 0,02 mM EGTA, 0,2 mM ortovanadato, 1 mM de PMSF, 0,5 ug /ml leupeptina, 1 ug /ml de pepstatina e 0,5? g /ml de aprotinina). As esferas foram, em seguida, dividido igualmente em dois tubos Eppendorf e incubadas 30 min a 30 ° C em tampão de reacção ERK1 suplementado com 10 mM de acetato de magnésio, 0,1 mM ATP e 2μCi [γ-

32P] ATP contendo ou 0,1 ug de ERK1 não activa ( Millipore). A reacção foi parada pela adição de tampão de amostra de Laemmli 4x. NIC1 radiomarcado foi separado por SDS-PAGE e processadas para autorradiografia.

dados de apresentação

Todos os experimentos foram realizados em pelo menos três experiências independentes. Western blots típicas estão mostradas. análises densitométricos foram realizadas utilizando o programa Image J 1.42.

Resultados

O cálcio quelação ativa o receptor NOTCH1

Para a ativação estudo NOTCH1 oportuna, nós exploramos um modelo que permite a ativação síncrona do receptor NOTCH1. Devido à natureza dos receptores Notch os quais são constituídos por duas subunidades mantidas unidas de forma não covalente por interacções dependentes de cálcio, [1,2], que foi previamente demonstrado que o cálcio dissocia exaustão e activa os receptores Notch [28]. Esta estratégia foi comprovado um método confiável para a ativação NOTCH [29-34]. Assim, procedeu-se a um pulso de ativação NOTCH expondo células que expressam Notch1 câncer pancreático ao EGTA quelante de cálcio. Como esperado, um pulso de 15 minutos EGTA resultou na clivagem do receptor [28,31] que conduz a um aumento da expressão do fragmento clivado NIC1 (Figura 1A). Após a exposição de EGTA, o meio foi removido e as células foram devolvidas para diferentes períodos de tempo (isto é, 30 a 240 minutos) para a sua condição de cultura normais, que continha cálcio. Foram observados níveis aumentados de genes alvo NIC1 HES1 e c-myc, embora com perfil temporal ligeiramente diferente (Figura 1A). Esta observação está de acordo com um estudo recente demonstrando os perfis de RNA distintos de genes responsivos nível; membros da

E

(

spl

) genes da família (

Drosophila

homólogos do ser humano

HES

família) ser único na rapidez da sua resposta à activação NOTCH [30].

A. células MIA PaCa-2 foram deixados sem tratamento (-) ou tratadas com EGTA (4 mM) durante 15 min (+). meio contendo EGTA foi removido e substituído por meio de cultura normal (Ca

2+) para os períodos de tempo indicados. B. células MIA PaCa-2 foram pré-tratados (+) ou não (-) com DAPT (25 uM) durante 30 min. As células foram então expostas a EGTA (4 mM) durante 15 min (+). meio contendo EGTA foi removido e substituído por meio de cultura normal (Ca

2+) contendo DMSO (-) ou DAPT (25 uM) durante 90 min. C. células MIA PaCa-2 foram deixados sem tratamento (-) ou tratadas com EGTA (4 mM) durante 15 min (+). meio contendo EGTA foi removido e substituído por meio de cultura normal (Ca

2+) contendo DMSO ou actinomicina D (1 ug /ml) durante os períodos de tempo indicados. As análises de Western blot foram realizadas utilizando os anticorpos apropriados.

Para apoiar os mecanismos dependentes de NOTCH envolvidos na expressão HES1 induzida por EGTA, nós pré-tratadas as células com o DAPT inibidor da gama-secretase, bem conhecido para bloquear a clivagem NOTCH. Pré-tratamento das células com DAPT impediu a NIC1 induzida por EGTA, HES1 e da proteína de c-myc (Figura 1B e dados não mostrados) de suporte que impactos EGTA HES1 expressão através da activação dos receptores Notch. Além disso, a adição do inibidor de transcrição actinomicina D exposição seguinte EGTA não teve impacto significativo sobre a expressão induzida por NIC1 EGTA, mas impedido de expressão HES1 e c-myc (Figura 1C e dados não mostrados). Tomados em conjunto, os nossos dados estão em linha com o que foi anteriormente mostrado em outras linhas celulares [29-34] ou seja, a exposição transitória a EGTA conduz à activação NOTCH1 soltando o NIC1 domínio intracelular, permitindo-se translocar para o núcleo para modular a transcrição de genes . fraccionamento subcelular confirmou que NIC1 encontra-se predominantemente dentro do núcleo, após a exposição de EGTA (Figura S1).

NIC1 é fosforilada em células de câncer de pâncreas

Curiosamente, foram detectados diferentes formas de peso molecular de NIC1 após um pulso de ativação NOTCH1 por EGTA com formas de peso molecular principalmente elevados gradualmente observados ao longo do tempo (Figura 1A ). Digno de nota, 240 minutos após a exposição de EGTA, NIC1 expressão voltou aos níveis comparáveis ​​às células não tratadas, sugerindo uma rápida mudança de NIC1 subsequente à sua acção transcricional. Por conseguinte, HES1, uma proteína de curta duração [3], foi expresso apenas transitoriamente, atingindo um máximo de 90-120 minutos a seguir à exposição de EGTA e o retorno sobre os níveis de controlo depois de 240 minutos.

Para explicar o perfil de peso molecular diferente de NIC1, testámos se NIC1 sofre modificações pós-traducionais após a sua libertação a partir do receptor transmembranar. Mais especificamente, foram analisados ​​os níveis de fosforilação de NIC1 em células de câncer de pâncreas ou seja MIA PACA-2 e BxPC-3. Estas linhas de células exibem activação basal do receptor NOTCH1 como indicado pela expressão do fragmento NIC1 NOTCH1 clivado (Figura 2). crescimento exponencial células notável, MIA PaCa-2 mostrar mais baixo nível de ativação NOTCH1 em comparação com BxPC-3. Os ensaios revelaram que fosfatase NIC1 é fosforilada em crescimento exponencial MIA PaCa-2 e BxPC-3 de células (Figura 2). Além disso, a que se seguiu a activação induzida por NOTCH1 EGTA em MIA PaCa-2, NIC1 foi predominantemente encontrada num estado fosforilado (Figura 2).

NIC1 foi imunoprecipitada (IP NIC1) a partir de lisados ​​totais de crescimento exponencial MIA PaCa-2 (MIA), MIA PaCa-2 células tratadas com EGTA (4mm) para 15min e depois voltou para o seu meio de cultura normal para 90min, ou em crescimento exponencial BxPC-3 (Bx). Após imunoprecipitação NIC1, ensaios foram realizados de fosfatase (+), utilizando a fosfatase lambda (λ fosfatase). O NIC1 IP não incubadas com o fosfatase lambda é indicado como pNIC1. Um Western blot representativa, utilizando um anticorpo contra NIC1 é mostrado.

Em nosso esforço para identificar potenciais quinases que modulam a fosforilação NIC1, procedeu-se transfecções transitórias em células HEK293T. Curiosamente, observou-se formas de peso molecular mais elevado de um NIC1 exógeno quando as células foram co-transfectadas com uma forma activa constitutiva de MEK1 (MEK1 CA) que levam à activação de ERK1 2 /(Figura 3A). Os ensaios de fosfatase fornecida evidência de que NIC1 é fosforilada quando expresso em células HEK293T (Figura 3B esquerda, NIC1 + MEK1 WT). No entanto, os níveis de fosforilação NIC1 foram grandemente aumentada quando a via /ERK MEK foi activado pela presença de MEK1 um CA (Figura 3B direita). estados de fosforilação NIC1 semelhantes foram detectados quando as células foram co-transfectadas com um RAS oncogénicos (dados não mostrados). Estes resultados sugerem que a via de MEK /ERK poderia influenciar os níveis de fosforilação de NIC1. O ERK1 /2 são bem conhecidos para fosforilar um número de proteínas citoplasmáticas e nucleares, incluindo reguladores da transcrição [35,36]. Por isso, testámos se NIC1 poderia ser um alvo directo da ERK1 /2. Curiosamente, um ERK1 ativo foi capaz de fosforilar NIC1 em

in vitro

ensaios de quinase (Figura 3C). Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que NIC1 é fosforilada em células de câncer de pâncreas. De acordo com nossa observação de que NIC1 estados de fosforilação aumentou ao longo do tempo após a exposição EGTA e simultaneamente diminuir em expressão, é tentador especular que NIC1 pode passar por eventos de fosforilação hierárquicos após seu lançamento a partir do receptor transmembranar que coordenam a expressão NIC1, bem como a ativação da transcrição dependente de NIC1 e atenuação. Além disso, em consequência de nossos resultados, o potencial envolvimento da via /ERK MEK na regulação da função NIC1 certamente merece mais atenção.

A. HEK293T foram transfectadas com Plia-NIC1 (etiquetado-MYC) construir em conjunto com um cDNA que codifica para uma de tipo selvagem (WT) ou versão constitutivo activo (CA) de MEK1 (marcada com HA). As células foram lisadas 24 h pós-transfecção. NIC1 expressão foi analisada por Western blot utilizando um anticorpo anti-myc. O nível da expressão MEK1 exógeno foi avaliada por transferência de Western utilizando um anticorpo anti-HA. níveis de ERK1 /2 uma expressão dual-fosforilada e no total foram avaliados utilizando anticorpos específicos. A forma de peso induzido por CA MEK1 molecular mais elevado de NIC1 é indicado por um asterisco *. B. HEK293T foram transfectadas com Plia-NIC1 construir em conjunto com um cDNA que codifica MEK1 WT ou MEK1 CA. As células foram lisadas e imunoprecipitadas NIC1 foi (IP NIC1) utilizando um anticorpo anti-myc. Os ensaios de fosfatase foram então realizadas (+), utilizando a fosfatase lambda (λ fosfatase). As formas fosforiladas de NIC1 são denotados pNIC1. A forma de peso induzido por CA MEK1 molecular mais elevado de NIC1 é indicado por um asterisco *. NIC1 expressão foi analisada por Western blot utilizando um anticorpo anti-myc. C. NIC1 foi imunoprecipitada (IP NIC1) de Plia-NIC1 HEK293T transfectadas, utilizando um anticorpo anti-myc. Os ensaios de quinase foram então realizados como descrito nos procedimentos experimentais. A auto-radiografia que descreve NIC1 fosforilada (pNIC1) é mostrado. Após electrotransferência do gel, a quantidade de NIC1 imunoprecipitada foi confirmada por Western Blot (WB), utilizando um anticorpo anti-myc.

A activação da via de MEK /ERK promove Notch

a seguir, os destinatários se o caminho /ERK MEK poderia influenciar a sinalização NOTCH particularmente em nosso modelo de células de câncer pancreático MIA PaCa-2, que exibe basal expressão NOTCH1 activação /NIC1, mas a ativação NOTCH1 inducible (ver Figura 1A). Digno de nota, como a maioria das células de cancro do pâncreas, células MIA PaCa-2 portadoras de uma mutação KRAS basal conduzindo a activação de ERK1 2 /, o último sendo essencial para a proliferação de células MIA PaCa-2 e sobrevivência [37]. Para estimular fortemente e de forma sustentável da via MEK /ERK, que trataram células MIA PaCa-2 com forbol 12-miristato 13-acetato (PMA). Como mostrado na Figura 4A, a adição de PMA rapidamente levou à activação sustentada ERK1 /2, o que se correlacionou com um aumento HES1 e os níveis de expressão da proteína c-Myc. Para garantir que o efeito era dependente da NOTCH, nós pré-tratados com as células para soltar DAPT expressão NIC1 (Figura 4A) e para inibir a clivagem mais provável dos outros receptores Notch. Pré-tratamento com DAPT preveniu significativamente a expressão HES1 induzido por PMA, ao passo que o impacto sobre c-myc foi parcial (Figura 4A). Isto poderia potencialmente ser explicada pelo facto de que, apesar de c-myc foi identificado como um gene alvo NOTCH1 directa [38,39], c-myc é também conhecida para ser regulada directamente pela ERK1 /2 [35,36]. Portanto, pode ser possível que c-MYC é regulada por dois mecanismos NOTCH- e ERK-dependentes em nosso modelo. Notável, em nosso modelo, DAPT revogada completamente a expressão HES1 induzida por PMA sugerindo que PMA promove em grande parte expressão HES1 através dos receptores Notch contrastando com estudos anteriores sugerindo uma regulação NOTCH independente MEK-dependente de HES1 [40,41].

A. MIA PaCa-2 As células foram pré-tratadas (+) ou não (-) com DAPT (25 uM) durante a noite. As células foram então tratadas com PMA (100 nM) para os períodos de tempo indicados. B. células MIA PaCa-2 foram deixados sem tratamento (-) ou tratadas com EGTA (4 mM) durante 15 min (+). meio contendo EGTA foi removido e substituído por meio de cultura normal (Ca

2+) contendo DMSO, PMA (100 nM) ou PMA + U0126 (10 uM) para os períodos de tempo indicados. A. e B. As células foram lisadas e as análises de Western blot foram realizadas usando os anticorpos indicados. C. A partir de experiências semelhantes apresentados em B., uma representação gráfica que descreve a expressão HES1 relativo, para cada período de tempo, em células tratadas (PMA, PMA + U0126), em comparação com células de controlo (tratados com DMSO) é mostrado. D. A partir de experiências similares apresentadas em B., uma representação gráfica que descreve a expressão relativa de c-myc, para cada período de tempo, em células tratadas (PMA, PMA + U0126) em comparação com células de controlo (tratados com DMSO) é mostrado. C. e D. Os resultados são a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05, ** p 0,005, *** p 0,0005 em comparação com o período de tempo correspondente nas células tratadas com DMSO. # P 0,05, ## p 0,005, ### p 0,0005 em comparação com o período de tempo correspondente em células tratadas com PMA.

Para explorar também a influência de ERK1 /2 activação após um pulso de ativação NOTCH1, nós adicionamos PMA na mídia após lavagem EGTA. A adição de PMA promoveu a HES1-EGTA e induzida a expressão de c-MYC, um efeito que foi anulada pela presença do inibidor MEK U0126 (Figura 4B-D). Vale ressaltar que denotava um aumento na ERK1 2 fosforilação /que diminuiu ao longo do tempo depois de substituir o meio de células tratadas com EGTA com meio de cultura normal (ver Controle () células tratadas com DMSO; Figura 4B). Este ligeiro aumento pode representar uma limitação do método (que requer a remoção de EGTA) e só pode ser a consequência de substituir os meios de comunicação de EGTA contendo com meio de cultura fresco, ERK1 /2 fosforilação de ser bastante sensível à mudança de meio. Foram excluídos um papel para sinalização de Notch na modulação ERK1 2 actividades /porque i) tratamento DAPT impediu a expressão NIC1 induzida por EGTA (Figura 1B), sem afectar ERK1 2 fosforilação /(dados não mostrados) e ii) a inibição da sinalização de Notch por tratamento DAPT não modular significativamente a fosforilação de ERK1 2 /(Figura 4A). Tomados em conjunto, os nossos resultados apontam para uma regulação positiva da expressão HES1 dependente de NOTCH pela via /ERK MEK.

Nós estabelecemos que as induzida por EGTA expressão HES1 necessários eventos de transcrição (Figura 1C) que suportam um modelo em que a NIC1 libertado transloca para o núcleo para impactar a expressão do gene (

HES1

). Inerente a este, a associação de NIC1 com a sua CSL parceiro de ligação de ADN e o co-activador MAML1, portanto, a formação de uma unidade de transcrição funcional, é, certamente, um pré-requisito para a modulação do gene [1,2]. Portanto, para começar a delinear os mecanismos que explicam o impacto positivo da via MEK /ERK sobre a sinalização NOTCH, investigamos se a ativação da via /ERK MEK poderia promover a associação de NIC1 com a CSL ou MAML1. Ao contrário de NIC1, CSL e os níveis de expressão foram MAML1 não modulada por tratamento de EGTA (Figura 5A). Consequentemente, nós imunoprecipitadas CSL e MAML1 e testado associação NIC1. Após um pulso de activação NOTCH1, níveis mais elevados de NIC1 foram encontrados associados com a CSL ou MAML1 (Figura 5B) de novo reforço nosso modelo no qual, após a activação NOTCH1 EGTA-mediada, o NIC1 libertado monta em um complexo transcricional activa para modular a expressão do gene. Curiosamente, em comparação com as células tratadas com DMSO, o tratamento com PMA promovido por quase 2 vezes a associação de NIC1 com a CSL (Figura 5C) ou MAML1 (Figura 5D). A adição de U0126 impediu tanto a NIC1 /CSL induzida por PMA e de associação NIC1 /MAML1 (Figura 5C-D) o apoio a mecanismos MEK-dependentes.

MIA PaCa-2 As células foram deixadas sem tratamento (-) ou tratadas com EGTA (4 mM) durante 15 min (+). meio contendo EGTA foi removido e substituído por meio de cultura normal (Ca

2+) contendo DMSO, PMA (100 nM) ou PMA + U0126 (10 uM) durante 90 min. A. NIC1, MAML1 e os níveis de expressão CSL foram avaliadas por transferência de Western utilizando os anticorpos apropriados. B. CSL e MAML1 foram imunoprecipitados (IP) antes de análises de Western blot utilizando os anticorpos indicados. C. CSL foi imunoprecipitada (IP) seguido por análises de Western blot de NIC1 (esquerda). Uma representação gráfica que mostra a quantidade relativa de NIC1 co-imunoprecipitada com a CSL (NIC1 /CSL) é mostrado (direita). D. MAML1 foi imunoprecipitada (IP) seguido por análises de Western blot de NIC1 (esquerda). Uma representação gráfica que mostra a quantidade relativa de NIC1 co-imunoprecipitada com MAML1 (NIC1 /MAML1) é mostrado (direita). C. e D. Os resultados são a média ± SEM de pelo menos três experiências independentes. * P 0,05 comparado com células tratadas com DMSO.

Discussão

De acordo com estudos anteriores [29-34], nossos resultados demonstram que a exposição transitória a EGTA é um modelo útil e confiável para a ativação estudo NOTCH1 oportuna em NOTCH1- expressando células. Na verdade, ele nos permitiu descobrir que, após a libertação do receptor transmembranar, NIC1 sofre uma série de modificações pós-traducionais que incluem fosforilação. É também corroborada conceito previamente estabelecido pelo qual NIC1 é uma curta duração de proteínas [1] como, dentro de um período de tempo 4 h, a expressão do NIC1 recentemente clivado desapareceu quase completamente. Juntamente com o aumento da expressão NIC1, modificações pós-traducionais e rotatividade, fomos capazes, pela primeira vez, para detectar um aumento da expressão de alvos endógenos NOTCH sugerindo que a expressão induzida por NIC1 EGTA traduz-se numa unidade de transcrição funcional em células de cancro pancreático. A principal novidade da nossa pesquisa é a demonstração de que a via /ERK MEK promove a expressão de HES1 alvo do entalhe. Embora será definitivamente necessários mais estudos para determinar se os /ERK ativação impactos MEK todos ou apenas um subconjunto de metas de qualidade, nossos dados fornecem evidências de que a via /ERK MEK fortalece expressão HES1 provavelmente através de mecanismos dependentes dos receptores Notch, porque pré o tratamento das células com um inibidor de gama-secretase (DAPT) impediram a expressão HES1 induzido por PMA. Estudos anteriores também relataram impacto da via RAS sobre a sinalização Notch [18,42]. Estes estudos, realizados principalmente sob a ativação RAS prolongados ou inibição de MEK, sugeriu que a sinalização RAS promove receptor NOTCH1 clivagem /ativação. Nossos resultados são inovador, uma vez que revelam que a via de sinalização /ERK MEK é eficiente para, minutos depois da clivagem NOTCH1, influenciam diretamente a função de transcrição NIC1. Uma das hipóteses decorrentes de nossos resultados é que a via MEK /ERK promove a montagem de uma unidade de transcrição NIC1 funcional com CSL e MAML1. No entanto, mais estudos são necessários para delinear os mecanismos precisos pelos quais a via MEK /ERK promove sinalização Notch.

Curiosamente, foi sugerido anteriormente que as modificações pós-traducionais, especialmente fosforilação, é quase certo que a modulação dependente de NIC1 transcrição [1]. Inicialmente no

Drosophila

[43], mas mais tarde, em mamíferos, hyperphosphorylation do domínio intracelular de NOTCH1 e NOTCH2 foi detectado depois da sua saída do receptor transmembranar [44,45]. , Hyperphosphorylation de NIC1 foi associada com i) acumulação notável NIC1 nuclear [45-48], ii) interacção NIC1 com CSL [44], iii) aumento da transcrição dependente de CSL [44,47,48] e iv) NIC1 transformando capacidade [ ,,,0],48]. Estes resultados sugerem que a fosforilação NIC1 pode promover o potencial de transcrição do complexo NIC1 /CSL. No entanto, até à data, a maioria quinases que regulam negativamente a função NIC1 ter sido identificada: AKT foi mostrado para promover NIC1 localização citoplasmática [49], a fosforilação de NIC1 por DYRK1A sinalização Notch atenuada [50], e fosforilação NIC1 NLK-dependente diminuiu a formação de o complexo NIC1 /CSL [51]. grupo Capobianco recentemente forneceu evidências de que antes ou durante NIC1 /CSL /MAML1 associação complexa, NIC1 é fosforilada por CK2 permitindo o acesso a um sítio de fosforilação subsequente [52]. Ambos os eventos de fosforilação pareceu necessário para a dissociação do complexo de ADN. Além disso, o complexo /CDK8 CYCC é pensada para desempenhar um papel importante na destruição do complexo NIC1 /LEC /MAML1 por fosforilação NIC1 dentro do seu domínio PEST C-terminal que se seguiu ubiquitinação NIC1 FBW7-mediada e degradação [53]. No entanto, até à data, não há reguladores NIC1 positivos (cinases) foram identificados e quase todos os locais de fosforilação no NIC1 continuam a ser determinado. Os nossos resultados agora proporcionar a base para investigar a contribuição positiva da via de MEK /ERK em sinalização Notch particularmente no contexto de células de cancro do pâncreas. Digno de nota, que foi previamente demonstrado que a expressão forçada de NIC1 no epitélio pancreático do rato promove a formação de lesões pré-malignas do pâncreas, iniciadas por uma oncogénica

KRAS

[54] sugerindo que KRAS e Notch cooperar para promover a carcinogénese pancreática.