Abstract

quinase receptor relacionado com a tropomiosina

B (TrkB) de sinalização, estimulado por factor neurotrófico (BDNF) ligando derivado do cérebro, promove a progressão do tumor, e está relacionada com o mau prognóstico de várias malignidades. Buscou-se analisar a relevância clínica de expressão /TrkB BDNF no cancro colorectal tecidos (CRC), seu valor prognóstico para pacientes de CRC, e seu potencial terapêutico

in vitro

e

in vivo

. Duzentos e vinte e três amostras de pacientes de CRC foram usadas para determinar os níveis de ARNm tanto de BDNF e TrkB. A expressão destas proteínas nos seus tumores primários e metastáticos foi investigada por imuno-histoquímica. linhas CRC celulares e BDNF recombinante e K252a (uma acção farmacológica inibidor seletivo pan-Trk) foram utilizados para a

in vitro

viabilidade celular, migração, invasão, resistência anoikis e

In vivo

ensaios metástase peritoneal. Tissue BDNF mRNA foi associado com a metástase do fígado e peritoneal. Tissue TrkB mRNA também foi associado com metástase ganglionar. A co-expressão de BDNF e TrkB foi associada com metástases do fígado e peritoneal. Os pacientes com maior BDNF, TrkB, e co-expressão de BDNF e TrkB tinha um significativamente mau prognóstico. BDNF aumentou a viabilidade celular do tumor, migração, invasão e anoikis inibidos nas linhas celulares de CRC-expressando TrkB. Estes efeitos foram suprimidos pelo K252a. Em ratinhos injectados com DLD1 co-expressando o BDNF e TrkB, e subsequentemente tratado com K252a, nódulos metastáticos peritoneais foi encontrado para ser reduzida, em comparação com ratinhos de controlo. BDNF sinalização /TrkB pode, assim, ser um alvo potencial para o tratamento de carcinomatose peritoneal decorrentes de câncer colorretal

Citation:. Tanaka K, Okugawa Y, Toiyama Y, Inoue Y, Saigusa S, Kawamura M, et al. Fator neurotrófico (2014) Brain-Derived (BDNF) Induzido por tropomiosina-Related Kinase B (Trk B) de sinalização é um potencial alvo terapêutico para Peritoneal Carcinomatose oriundas de câncer colorretal. PLoS ONE 9 (5): e96410. doi: 10.1371 /journal.pone.0096410

editor: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, Estados Unidos da América

Recebido: 15 de outubro de 2013; Aceito: 07 de abril de 2014; Publicado em: 06 de maio de 2014

Direitos de autor: © 2014 Tanaka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado, em parte, por concessões do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão (KAKENHI 24.591.972 para YI, e 25.462.051 para SS). Nenhum financiamento externo adicional foi recebida para este estudo. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o notável progresso no tratamento de câncer colorretal metastático (mCRC) foi fundada nos últimos quimioterapias de combinação multi-droga, que agora produzem tempos de sobrevivência médios superiores a 20 meses [1]. No entanto, carcinomatose peritoneal (PC) pode surgir a partir de CRC. PC está associada com a sobrevivência extremamente pobre, e muito poucos tratamentos terapêuticos ou paliativas estão disponíveis [2]. Assim, é urgentemente necessária uma melhor compreensão dos comportamentos moleculares e biológicas do PC resultante de CRC para facilitar o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas.

-Cérebro factor neurotrófico derivado (BDNF) é um membro da neurotrofina ( NT) da família. BDNF desempenha um papel importante no desenvolvimento e reparação do sistema nervoso [3]. Ele liga-se aos seus dois receptores principais, o relacionadas com a tropomiosina receptor de quinase B (TrkB) com elevada afinidade e especificidade, e o receptor de p75 de pan-NT (p75

NTR) com baixa afinidade [4]. A ligação de BDNF para TrkB leva a auto-fosforilação de tirosinas no domio intracelular com a activação de vias de sinalização a jusante, tais como RAS /MAPK e PI3K /AKT [4], [5]. BDNF também se liga p75 receptor de baixa afinidade

NTR que exerce diversas funções, tais como a regulação da sobrevivência e diferenciação celular durante o desenvolvimento neuronal [6].

Embora ambos TrkB e p75

NTR envolvidos na proliferação, a diferenciação, a sobrevivência e a apoptose de tumores neuronais e não neuronais [7], [8], p75

NTR actua preferencialmente como um parceiro de interacção de TrkB, modula a activação TrkB por BDNF, e influências efeito prosurvival por BDNF /TrkB sinalização [ ,,,0],9].

BDNF /TrkB sinalização tem sido relatado para ser associado com a progressão do tumor, metástase, e a resposta à quimioterapia em várias malignidades humanas, tais como o neuroblastoma [10], do ovário [11], da cabeça e pescoço [12 ], pulmonar [13], hepatocelular [14], pancreático [15], da bexiga [16], da próstata [17], mieloma múltiplo [18], e tumores da mama [19]. TrkB tem sido também mostrado para promover a resistência a anoikis (uma forma de apoptose induzida por descolamento) [20], e, assim, para lhes conferir propriedades metastáticas ou epitelial-mesenquimal transição (EMT) [21], [22]. Em contraste com o papel de TrkB no cancro, p75

NTR parece ter ou funções supressoras de tumor-tumor promover ou de acordo com os tipos de tumores [8]

Anteriormente, estudos em nosso laboratório revelaram.: uma associação entre a progressão TrkB níveis tumor eo prognóstico do paciente no câncer gástrico [23]; a associação de TrkB com a resistência à quimioterapia em câncer de esôfago [24]; e envolvimento de TrkB no EMT do cancro colorectal [25]. Mais recentemente, têm demonstrado o envolvimento da via /TrkB BDNF na progressão tumoral no cancro gástrico [26].

No que respeita à sinalização /TrkB BDNF no CRC, BDNF ou TrkB foi sobre-expresso em tumores, tanto clínica amostras e associado com fenótipos tumor agressivo [27] – [30].

In vitro

estudos mostraram que a sinalização de BDNF /TrkB estava envolvida nas propriedades proliferativas ou invasivos [27] – [30], e a eficácia ou a resistência de cetuximab anticorpo monoclonal do receptor do factor de crescimento anti-epidérmico [31] ou gastrina libertando não peptídico do receptor [32]. Estas linhas de evidência indicam que o BDNF sinalização /TrkB promove a progressão tumoral, levando a um mau prognóstico para vários tumores malignos humanos, e que emergiu como um alvo terapêutico potencial [33], [34].

O objectivo deste estudo foi examinar: a associação entre BDNF expressão /TrkB e variáveis ​​clínico-patológicas em uma série de tecidos CRC humanos; o valor prognóstico da BDNF /TrkB sinalização em pacientes com CCR; e seu potencial terapêutico in vitro e in vivo.

Declaração de Materiais e Métodos

Ética

Este estudo foi analisado e aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional e Comitê de Ética local do Escola Universidade Mie Pós-graduação em Medicina (No. 2126). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes (adultos e pais de crianças) inscritos para o estudo.

Os protocolos experimentais de estudos in vivo foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do Animal da Universidade de Pós-Graduação Mie School of Medicine.

os pacientes

Um total de 223 pacientes com CRC, que foram tratados no Departamento de Gastrointestinal e Cirurgia Pediátrica na escola de Pós-graduação da Universidade Mie de Medicina 2000-2008, foram incluídos neste estudo. Pacientes com dados clínicos incompletos, acompanhamento inadequado ou amostragem tecidual inadequada foram excluídos do estudo. Todos os pacientes tinham confirmado histologicamente adenocarcinoma do cólon ou do recto. A idade média dos pacientes era de 67 anos (variação: 12-91 anos). A mediana do tempo de seguimento foi de 30,6 meses (intervalo: 1,5-107,2). Um total de 49 pacientes morreram de causas relacionadas com a CRC durante este período.

O estadiamento foi baseado na avaliação clínica e análise histopatológica utilizando o sistema de estadiamento TNM da União Internacional Contra o Câncer (UICC). consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes inscritos no estudo, de acordo com as diretrizes de ética locais. Este estudo foi aprovado pelo Institutional Review Board.

coletas

tecidos de câncer foram congeladas em nitrogênio líquido imediatamente após a ressecção cirúrgica e armazenadas a -80 ° C até o uso. O diagnóstico de CRC foi confirmada para todos os 223 pacientes com base nos achados clínico-patológicas.

extração de RNA total, síntese de cDNA

tecidos de câncer foram picadas e homogeneizada com um misturador moinho MM 300 homogeneizador (Qiagen, Chatsworth , CA, EUA). O ARN total foi isolado utilizando um kit RNeasy Mini (Qiagen) de acordo com as instruções do fabricante. O ADNc foi sintetizado a partir de 5 ug de ARN total, com um iniciador de hexâmero aleatório e Superscript III transcriptase reversa (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante.

em tempo real RT-PCR quantitativa (RT -PCR) e níveis de expressão génica relativos

PCR quantitativa (análise qPCR) foi realizada utilizando um TaqMan Universal PCR master mix (Applied Biosystems, Foster City, CA, EUA). Os níveis de expressão dos transcritos do gene alvo, medidos utilizando sondas TaqMan para BDNF (Ensaio ID, Hs00380947_m1) e TrkB (Ensaio de identificação, Hs00178811_m1), foram normalizados para GAPDH (Ensaio ID, Hs02758991_g1) e avaliada usando Applied Biosystems StepOne Software (v2. 1).

O BDNF relativa e os níveis de expressão de genes TrkB foram determinadas utilizando uma curva padrão. A curva padrão foi gerada utilizando uma diluição em série de 5 vezes de ADNc aleatórias-primed qPCR humano Referência (TAKARA BIO INC., Clontech, Japão). Todas as curvas padrão foram lineares dentro do intervalo utilizado para análise, com um coeficiente de correlação correspondente aceitável (R

2). O nível de expressão do gene alvo foi calculada a partir da curva padrão e normalizados contra GAPDH. Finalmente, o nível de ARNm do gene alvo foi expressa como uma proporção em relação ao nível de ARNm de GAPDH. Os ensaios de PCR quantitativa em tempo real foram efectuadas em triplicado para cada amostra e o valor médio foi utilizado para calcular os níveis de expressão de ARNm.

produtos amplificados por PCR foram separados por electroforese, visualizou, e fotografado sob luz UV depois de coloração com brometo de etídio.

a imuno-histoquímica

a imuno-histoquímica foi realizada como descrito anteriormente [25]. Secções de 2-3 mm de espessura foram cortadas a partir dos espécimes (FFPE) fixados com formalina e embebidos em parafina de pacientes de CRC. Após desparafinização e desidratação, as amostras foram fervidas em tampão de citrato de sódio 10 mM durante 15 min para desmascarar os antigénios. As secções foram então bloqueadas com soro normal de cabra (Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, EUA) durante 60 minutos e incubadas com o anticorpo primário durante a noite a 4 ° C. A ligação do anticorpo foi detectada utilizando reagentes Envision (Envision kit /HRP, Dako Cytomation, Dinamarca). Todas as secções foram contrastadas com hematoxilina. Um anticorpo policlonal de coelho contra o BDNF primário (H-117, 1:350; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) e um anticorpo primário monoclonal de ratinho contra TrkB (1:100; R D Systems, Foster City, CA, EUA) foram usadas. Os controlos negativos foram também executados simultaneamente pela exclusão do anticorpo primário respectivo.

linhas celulares de CRC

linhas celulares de cancro colorrectal Humanos DLD1, LoVo, SW480, HT29, e CaCO2 foram obtidos a partir do celular Resource Center for Biomedical Research (Universidade de Tohoku, Japão). O teste de autenticação linha celular foi realizada para estas linhas celulares. Estas linhas celulares foram mantidas em meio RPMI-1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 Ul /mL de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO2.

Reagentes

BDNF humana recombinante foi adquirida a partir de Pepro Tech (Rocky Hill, NJ, EUA) e preparada de acordo com as instruções do fabricante. BDNF humana recombinante foi dissolvida em PBS (10 ug /ml) para o

In vitro

ensaios.

K252a foi adquirido de Calbiochem (San Diego, CA, EUA) e armazenado a -20 ° C antes da utilização. K252a foi dissolvida em PBS (10 ug /ml) para a

in vitro

e

in vivo

ensaios.

análise de Western blot

A célula CRC linhas foram lavados em PBS arrefecido em gelo, enquanto no prato. tampão de lise frio (solução salina tamponada com Tris, pH 7,5, contendo 1% de Triton X-100) foi então adicionada directamente ao prato. As células foram, então, raspadas do prato, recolhido e homogeneizado utilizando um misturador de moinho de MM 300 homogeneizador (Qiagen Inc., Chatsworth, CA, EUA). Os sobrenadantes foram recolhidos e congelados a -20 ° C até à sua utilização. A concentração de proteína foi medida utilizando o ensaio de proteína BCA (Pierce, Rockford, IL, EUA). 20? G de lisado de proteína foram misturadas com um volume igual de 2 x tampão de carga Laemmli contendo 2-mercaptoetanol, e aqueceu-se a 100 ° C durante 5 min. As amostras foram separadas por eletroforese em géis de gradiente de poliacrilamida a 12,5% contendo SDS a 0,1%, seguido de transferência semi-seca para uma membrana de PVDF Immun-Blot (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, EUA). A membrana foi então bloqueada utilizando 5% de leite desnatado em solução salina tamponada com Tris, pH 7,5, suplementado com 0,1% de Tween 20 (TBS-T).

As manchas foram então incubadas com anticorpo anti-rato monoclonal de TrkB ( R D Systems, Foster City, CA, EUA) a uma diluição 1:1000, policlonal de coelho anti-FNEC anticorpo (H-117, 1:350; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, EUA) a uma 1:100 diluição, e anticorpo monoclonal de ratinho anti-actina (clone C4) anticorpo (MP Biomedicals, LLC, Solon, OH, EUA) a uma diluição 1:400 em 5% de leite magro em TBS-T durante a noite a 4 ° C. Após lavagem três vezes em TBS-T, as membranas foram incubadas com IgG anti-rato de cabra-fosfatase alcalina conjugada (Promega, Madison, WI, EUA) a uma diluição 1:200 em 5% de leite magro em TBS-T. Após o tratamento com uma solução de detecção de quimioluminescência aumentada, sinais quimioluminescentes foram visualizados em um CS Analyzer e AE-6962 captura de luz (ATTO Corp., Tóquio, Japão).

A viabilidade celular ensaio

Para avaliar foram utilizados o efeito do BDNF sobre a viabilidade celular, a migração, invasão e resistência anoikis, BDNF recombinante humano e o K252a, um inibidor selectivo farmacológica pan-Trk,.

a viabilidade celular, a migração, invasão e resistência anoikis eram comparação entre as células não tratadas (controlo), as células tratadas com BDNF, células tratadas com K252a e K252a seguido de células tratadas com BDNF.

a citotoxicidade foi avaliada usando um WST-8 [2- (2-metoxi -4-nitrofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2, 4-dissulfofenil) -2H- tetrazólio, sal monossódico] ensaio colorimétrico. As células cancerosas (5000 células /poço) foram semeadas em placas de células de 96 poços (Becton Dickinson Labware, Franklin Lakes, NJ, EUA) em 100 ul de meio de cultura durante 24 h. Após pré-incubação, as células foram tratadas com K252a (100 nM) ou meio isento de soro durante 2 h, e, em seguida, tratados com BDNF (100 ng /ml) forma recombinante humana ou isento de soro. 48 h mais tarde, o meio foi descartado e substituído por 90 ul de meio fresco, seguido pela adição de 10 ul (Kit celular Contar, DOJINDO LABORATORIES, Japão) WST-8 solução reagente e incubadas durante 2 h a 37 ° C em uma incubadora .

a viabilidade celular foi determinada por comparação colorimétrica por leitura da densidade óptica (dO) a partir de valores de um leitor de microplacas (SoftMax, Molecular Devices Corporation, CA, EUA) a um comprimento de onda de absorção de 450 nm. A citotoxicidade foi avaliada utilizando o Kit de contagem celular de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram obtidos a partir dos resultados semelhantes de pelo menos três experiências independentes. Os resultados são apresentados como média ± erro padrão (SE).

ensaio de migração

células cancerosas confluentes foram privadas durante 48 h-soro. As feridas foram gerados utilizando uma pipeta estéril ponta 200 uL, após pré-incubação com K252a (100 nM) ou meio isento de soro durante 2 h. forma humana de BDNF (100 ng /mL) ou sem soro recombinante foi adicionado e as células foram incubadas a 37 ° C durante um adicional de 46 h. o fechamento da ferida foi avaliado usando um microscópio Olympus IX71 (Olympus, Center Valley, PA, EUA) a 10 x de ampliação. distância de migração celular foi medida usando o Adobe Photoshop 9.0.2 software e comparados com as medições da linha de base. Cada experiência foi efectuada de, pelo menos, três vezes. Os resultados são apresentados como média ± SE.

ensaio de invasão

celular invasão foi avaliada utilizando câmaras de invasão Biocoat Matrigel e inserções de controle (Becton Dickinson alimentação laboratoriais). Um total de 50000 células /poço foram semeadas em câmaras de invasão e de controlo, e pré-incubado com 100 nM de K252a ou meio isento de soro durante 2 h. meio fresco sozinho ou meio contendo BDNF recombinante humano (100 ng /ml) foi então adicionado às placas Falcon complementares (BD Biosciences, San Jose, CA). As câmaras de Matrigel invasão e inserções de controlo foram incubadas durante 24 h a 37 ° C. O meio de incubação contendo as células foi removida da câmara de topo, usando cotonetes e meio isento de soro. As membranas foram fixadas em metanol, coradas com hematoxilina de Mayer, desidratados em etanol, e montada em lâminas de vidro. em seguida, foi determinado o número de células que invadiram o lado inferior da membrana. Cada experimento independente foi realizado três vezes. Os resultados são apresentados como média ± SE.

anoikis ensaio

anoikis, a apoptose induzida por desprendimento, é conhecido por ser induzido quando as células tumorais aderentes são forçados a crescer de uma forma não-aderente. resistência anoikis foi avaliado pela proporção de células tumorais viáveis ​​que proliferaram não-aderente em pratos de fixação de baixo.

ensaios

anoikis foram realizadas em seis poços Costar Ultra Baixa anexo microplacas (Corning, NY, EUA). DLD1, LoVo e SW480 células foram suspensas em RPMI-1640 com o BDNF (100 ng /ml), K252a (100 nM), ou o K252a + BDNF a uma concentração de 5 × 10

5 células /ml, respectivamente. As suspensões de células (2 ml) foram adicionados a cada poço e incubou-se durante 24 h, numa atmosfera humidificada (37 ° C e 5% de CO

2).

Após a indução de anoikis, as células foram semeadas a 5 × 10

3 células /cavidade em placas de microtitulação (96 poços, fundo plano) num volume final de 100 uL de meio de cultura por poço. Para avaliar as células tumorais viáveis ​​que proliferaram não-aderente em pratos de fixação de baixo, absorvância espectrofotométrica de cada poço foi medido utilizando uma solução de reagente WST-8 como descrito acima (ensaio de viabilidade celular). Cada experimento independente foi realizada seis vezes. Os resultados são apresentados como média ± SE

Após a indução de anoikis, 5 × 10

5 as células foram lavadas e ressuspensas em 0,5 ml de 1 × tampão de ligação, e anexina V:. Isotiocianato de fluoresceína /iodeto de propídio ( PI) rotulagem realizada de acordo com o protocolo do fabricante (Bio Visão, mountain View, CA, EUA). A análise foi realizada utilizando um citómetro de fluxo FACSCalibur (BD Biosciences, San Jose, CA) para quantificar a percentagem de células tumorais viáveis ​​apoptóticas ou sob condições de crescimento não-aderente utilizando pratos de fixação de baixo. Cada amostra continha 5 × 10

5 células. Os dados foram analisados ​​usando o software Pro CellQuest (BD Biosciences). células tumorais viáveis ​​que foram negativos tanto para anexina V e coloração de PI (quadrante inferior esquerdo) foram considerados como células anoikis-resistentes com crescimento não-aderente. células tumorais apoptóticos que foram positivas para a coloração de anexina V (quadrante inferior direito + quadrante superior direito) foram considerados como células induzidas anoikis-. As células de tumor tratadas com solução de formalina a 2,5% foram usadas como controlo positivo para as células de apoptose induzida. análise de citometria de fluxo foi realizada para confirmar os resultados do ensaio de viabilidade celular para a resistência anoikis.

In vivo

metástase peritoneal ensaio

ratinhos nu masculino (BALB /c) às 8 semanas de idade foram adquiridos a Japan SLC Inc (Shizuoka, Japão). Os protocolos experimentais foram revistos e aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso do animal na Escola de Graduação da Universidade Mie of Medicine. DLD1 células (5 × 10

7 células /500 ul de PBS) foram injectados por via intraperitoneal para a formação de metástase peritoneal. De qualquer K252a (500 ug /kg) ou PBS (controlo) foi injectado por via intraperitoneal, três vezes por semana, para examinar o efeito de K252a na formação metastático peritoneal. Quatro semanas mais tarde, os ratinhos foram sacrificados, e em seguida avaliou-se o tamanho e número de nódulos metastáticos peritoneais (cada grupo; n = 5). Os resultados são apresentados como média ± SE.

A análise estatística

Todas as análises estatísticas foram realizadas utilizando JMP versão 5 (SAS Institute Inc. Cary, NC, EUA). Os resultados são expressos como a média ± SE (erro padrão). Diferenças entre os grupos foram estimados por meio do teste do qui-quadrado de Pearson, com medidas repetidas análise de análise de variância (ANOVA) ou teste t de Student não pareado um. As curvas de sobrevida foram obtidos pelo método de Kaplan-Meier, e as comparações foram feitas usando testes de log-rank. Análises univariada e multivariada foram realizadas utilizando o modelo de riscos proporcionais de Cox para investigar os efeitos dos fatores histopatológicos e moleculares (BDNF e expressão TrkB status) presentes na amostra do tumor primário na sobrevida global (OS). As variáveis ​​associadas com a sobrevivência com um P-valor menor que 0,05 na análise univariada foram utilizados para a análise multivariada. Foram considerados estatisticamente significativos valores de P inferiores a 0,05. Frente e verso valores de P 0,05 foram considerados estatisticamente significativa

Resultados

O nível de mRNA BDNF em tecidos CRC

O rácio de expressão de mRNA BDNF, em relação a. GAPDH, em tecidos CRC foi 0,122 ± 0,230 (média ± SD), variando de 0 a 1,357. Para fins de análise estatística os valores de expressão de mRNA BDNF foram dicotomizados em baixo ou alto. Um valor de corte para o nível de mRNA BDNF foi determinada como um valor preditivo máxima usando um sistema operacional baseado em characteristic (ROC) análise da curva operacional receptor. Cento e dois pacientes tiveram alta expressão de mRNA BDNF ( 0,037), enquanto que 121 pacientes tiveram baixa expressão de mRNA BDNF. Como mostrado na Tabela 1, o nível de expressão de ARNm de BDNF em tecidos CRC foi encontrado para ser significativamente associado com a metástase do fígado síncrona (P = 0,007) e metástase peritoneal síncrono (P = 0,026). Não houve associação significativa entre o mRNA BDNF em tecidos CRC e quaisquer outras variáveis ​​clínico-patológicas.

O nível de mRNA TrkB em tecidos CRC

De acordo com a Expressão Gênica TaqMan Assay (Applied Biosystems , Foster City, CA, EUA), sonda de TrkB (Ensaio ID, Hs00178811_m1) destina-se a abranger o exão 6/7 limites. iniciadores correspondentes amplificar os fragmentos contendo os exões 6-7, que codifica a porção extracelular do receptor de TrkB. Portanto, este conjunto de iniciadores e a sonda detecta tanto o TrkB de comprimento completo (TrkB.FL) e o TrkB truncada (TrkB.T1) [35].

O rácio de expressão de ARNm de TrkB, em relação ao GAPDH, em CRC tecidos foi 0,054 ± 0,141 (média ± DP), que vão 0-1,149. análise da curva ROC mostrou que o valor de corte para mRNA TrkB foi de 0,002 (valor preditivo máximo para OS). Cento e setenta e um pacientes tiveram alta expressão de mRNA TrkB, enquanto que 52 pacientes tiveram baixa expressão de mRNA TrkB. Como mostrado na Tabela 1, o nível de ARNm de TrkB nos tecidos CRC foi encontrado para ser significativamente associado com a metástase de nó de linfa (P = 0,022). Não houve associação significativa entre o nível de mRNA TrkB em tecidos CRC e quaisquer outras variáveis ​​clínico-patológicas.

Co-expressão de BDNF e TrkB em tecidos CRC

Noventa e quatro pacientes apresentaram tanto de alta BDNF e a expressão de ARNm TrkB. Este grupo de doentes foi classificado como um co-expressar tanto o BDNF e TrkB. Como mostrado na Tabela 1, a co-expressão de BDNF e TrkB em tecidos CRC foi encontrado para ser significativamente associado com a metástase do fígado síncrona (P = 0,03) e metástase peritoneal síncrono (P = 0,013). Não houve associação significativa entre o nível de mRNA TrkB nos tecidos CRC e quaisquer outras variáveis ​​clínico-patológicas.

O impacto prognóstico da BDNF, TrkB, eo co-expressão de BDNF e TrkB em tecidos de câncer colorretal

a Figura 1 mostra as curvas de Kaplan-Meier para o BDNF (a), TrkB (B), e a co-expressão de BDNF e TrkB (C), respectivamente. pacientes com CCR com alta expressão de mRNA BDNF (n = 102) teve um OS significativamente pior do que aqueles com baixa expressão de mRNA BDNF (n = 121, teste log-rank, P = 0,0066). Da mesma forma, pacientes com CCR com expressão de mRNA alta TrkB (n = 171) teve um OS significativamente pior do que aqueles com baixa expressão de mRNA TrkB (n = 52, teste log-rank, P = 0,0474). pacientes com CCR cujos tumores co-expressa BDNF e TrkB (n = 94) tiveram um OS significativamente pior do que aqueles com outro padrão de expressão (n = 129, teste de log-rank, P = 0,0348).

(A ): Comparação entre a sobrevivência global dos grupos de pacientes com elevada expressão de ARNm de BDNF (n = 102) e aqueles com baixa expressão de ARNm de BDNF (n = 121). (B): Comparação entre a sobrevivência global dos grupos de pacientes com elevada expressão de ARNm de TrkB (n = 171) e aqueles com baixa expressão de ARNm de TrkB (n = 52). (C): Comparação entre a sobrevivência global dos grupos de pacientes com elevado co-expressão de BDNF e TrkB (n = 94) e aqueles sem ele (n = 129). TrkB expressão de ARNm indica ARNm níveis de transcrição de ambos TrkB.FL e TrkB.T1.

BDNF e a expressão da proteína TrkB nos tumores primários e metastáticos

A imuno-histoquímica mostrou que a proteína de BDNF ( a, B) foi expressa no citoplasma de células humanas e de CRC que a proteína TrkB (C, D) foi expressa no núcleo de células de CRC humanos (Figura 2). Em doentes com tanto do tumor primário (A, C) e nódulos metastáticos peritoneal (B, D), as células de CRC humanos nos nódulos metastáticos peritoneais expressas tanto o BDNF e TrkB, assim como aqueles em que o tumor primário. Confirmou-se que o anticorpo anti TrkB (R D Systems, Foster City, CA, EUA) detectado tanto TrkB.FL TrkB.T1 e com base nos resultados da análise de transferência Western usando linhas celulares de CRC humanos (dados mostrados na secção seguinte).

imagens representativas de expressão da proteína imuno-reativa BDNF e TrkB no CRC primária e metástase peritoneal são mostradas (ampliação original: 100 ×). O anticorpo anti TrkB (R D Systems, Foster City, CA, EUA) detectado ambas as proteínas TrkB.FL e TrkB.T1, que foi confirmada por análise de transferência de Western. (A): O BDNF proteína imunorreactiva está localizada no citoplasma das células tumorais do CRC primária. (B): O BDNF proteína imunorreactiva está localizada no citoplasma das células tumorais na metástase peritoneal correspondente. (C): a proteína imunorreactiva TrkB está localizado no núcleo das células do tumor primário do CRC. (D): A protea TrkB imunorreactivo está localizado no núcleo das células tumorais na metástase peritoneal correspondente. Estes padrões de expressão para as proteínas de BDNF e TrkB foram confirmados em pacientes com CCR (n = 5), cujo primário e nódulos metastáticos peritoneais estavam disponíveis para imuno-histoquímica.

A expressão de BDNF e TrkB em células in vitro CRC

Como se mostra pelos resultados acima, tanto o BDNF e TrkB expressão em células de tumor parece estar envolvido em progressão tumoral, tanto primário e metastático na CRC humano. Para explorar o envolvimento de um BDNF sinalização /TrkB autócrino na progressão CRC, primeiro analisou a expressão BDNF e TrkB em 5 linhas celulares de CRC incluindo CaCO2, DLD1, HT29, LoVo e SW480.

expressão de mRNA BDNF foi detectada 5 em todas as linhas de células por análise de RT-PCR (Figura 3A). Em contraste, a expressão de ARNm de TrkB (contendo tanto TrkB.FL e TrkB.T1) foi detectada em 3 de 5 linhas celulares (DLD1, LoVo e SW480)

(A):. A ​​análise de RT-PCR de os níveis de BDNF e mRNA TrkB em CRC linhas celulares CaCO2 (pista: 1), DLD1 (pista: 2), HT29 (pista: 3), LoVo (pista: 4), e SW480 (pista: 5). Os níveis de ARNm de GAPDH foi usada como um controlo interno. Os níveis de ARNm TrkB conter tanto TrkB.FL e TrkB.T1 mRNAs. (B): análise de transferência de Western dos níveis de proteína de BDNF e TrkB em linhas celulares de CRC CaCO2 (Lane: 1), DLD1 (pista: 2), HT29 (pista: 3), LoVo (pista: 4), e SW480 (Lane: 5). O full-length TrkB (TrkB.FL, 145 kDa) e a TrkB truncada (TrkB.T1, 95 kDa) foram detectadas. Actina foi utilizado como um controlo interno.

análise de transferência de Western (Figura 3B) mostrou que TrkB.FL (145 kDa) foi detectada em 3 linhas celulares (CaCO2, LoVo e SW480) e que TrkB .T1 (95 kDa) foi também detectada em linhas celulares de 4 (CaCO2, DLD1, LoVo e SW480). HT29 não têm nem proteína TrkB.FL nem TrkB.T1. proteína BDNF foi detectado em todas as linhas 5 celulares, bem como a expressão do mRNA.

Com base em nossos resultados e dados de relatórios anteriores, foram selecionados 3 linhas celulares (DLD1, LoVo e SW480) que mostraram tanto BDNF e TrkB expressão de mRNA ou com a expressão da proteína TrkB.FL ou TrkB.T1 para uma análise mais aprofundada.

BDNF aumenta a viabilidade celular das células CRC-expressando TrkB

para explorar a possibilidade de uma sinalização autócrina BDNF /TrkB ciclo que ocorre no CRC, nós investigamos o efeito do BDNF sobre a viabilidade das células de tumor em células que expressam CRC TrkB. Como mostrado na Figura 4, DLD1 (A), SW480 (B), e células LoVo (C) foram cada um tratados com BDNF (100 ng /ml), K252a (100 nM), ou o K252a seguido de BDNF durante 48 h. BDNF aumentou significativamente a viabilidade destas linhas celulares, em comparação com controlos não tratados. K252a reduziu significativamente a viabilidade destas linhas celulares, em comparação com os controlos não tratados. K252a seguido de BDNF viabilidade celular inibida destas linhas de células, em comparação com o tratamento com BDNF ou controlos não tratados.

células

BDNF /-expressando TrkB DLD1 (A), SW480 (B) e (C) LoVo foram utilizados para examinar o efeito do BDNF, K252a, e a sua combinação sobre a viabilidade das células de tumor. Cada célula DLD1, LoVo e SW480 foi tratada com BDNF (100 ng /ml), K252a (100 nM), ou o K252a seguido de BDNF durante 48 h. BDNF exógeno aumentou a viabilidade celular do tumor em células BF-expressando trkB e o K252a inibiu a viabilidade das células de tumor. Os dados foram obtidos a partir dos resultados semelhantes de pelo menos três experiências independentes. Os resultados são apresentados como média ± SE. *; P . 0,05

Estes resultados sugerem que o BDNF exógena aumenta a viabilidade das células de tumor em células BF-expressando trkB e que o bloqueio dos receptores TrkB pode proporcionar um meio potente de inibição do crescimento tumoral

BDNF promove a migração em células CRC-expressando TrkB

para examinar o efeito do BDNF na motilidade das células tumorais, foram utilizadas células DLD1 para

in vitro

ensaios de migração. Quarenta e oito horas mais tarde, o BDNF aumentou significativamente a migração de células DLD1, em comparação com os controlos não tratados. K252a reduziu a capacidade migratória das células DLD1, que era quase idêntico ao dos controlos não tratados. K252a seguido de BDNF inibiu a capacidade migratória das células DLD1, em comparação com o tratamento com BDNF. As imagens representativas dos resultados acima são apresentados na Figura 5A.