Abstract

Os pacientes com câncer pancreático geralmente desenvolvem invasão tumoral e metástase na fase inicial. Esses comportamentos malignos pode ser originado a partir de células-tronco cancerosas (CSCs), mas o alvo responsável é menos conhecido sobre CSCs invisíveis especialmente para a invasão e metástase. Nós já examinada a actividade de proteassoma de CSCs e construído um sistema de visualização em tempo real para CSCs pancreáticos humanos. No presente estudo, descobrimos que CSCs foram altamente metastático e predominantemente localizada nas margens do tumor invasor em um modelo de metástase hepática. Microarray e testes de rastreio siRNA mostrou que duplacortina-like kinase 1 (DCLK1) foi predominantemente expresso com modificação das histonas em CSCs pancreáticas com potencial invasivo e metastático. A sobre-expressão de DCLK1 levou a morfologia amebóide, o que promove a migração de células de cancro do pâncreas. Knockdown de DCLK1 profundamente suprimido na metástase do fígado in vivo de CSCs pancreáticas. Clinicamente, DCLK1 foi sobre-expressos em tumores metastáticos em pacientes com câncer de pâncreas. Nossos estudos revelaram que DCLK1 é essencial para as propriedades invasivas e metastáticas de CSCs e pode ser um epigenética promissor e alvo terapêutico no cancro pancreático humano

Citation:. Ito H, Tanaka S, Akiyama Y, Shimada S, Adikrisna R, S Matsumura, et ai. (2016) Expressão dominante da DCLK1 em células-tronco do cancro do pâncreas humano Acelera Tumor invasão e metástase. PLoS ONE 11 (1): e0146564. doi: 10.1371 /journal.pone.0146564

editor: Zhiqian Zhang, Pequim Hospital Institute, CHINA

Recebido: 17 Agosto, 2015; Aceito: 18 de dezembro de 2015; Publicação: 14 de janeiro de 2016

Direitos de autor: © 2016 Ito et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo Projeto de Desenvolvimento de Pesquisa inovativa em Cancer Therapeutics (P-direta), um Grant-in-Aid para a Investigação Científica em Áreas inovadoras, Pesquisa científica (a), desafiando Investigação exploratória do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência Tecnologia do Japão, e um Health Ciências do Trabalho Research Grant do Ministério da Saúde do Trabalho Bem-estar do Japão. Número: 22130005, 25253081, 15H01484, 15K15491. URL:. Https://kaken.nii.ac.jp/d/r/30253420.ja.html

Competir interesses:. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

abreviações : CSC, células-tronco do câncer; ODC, ornitina-descarboxilase; Gdeg, ZsGreen-rotulados degron ODC; H3K4me3, histona H3 lisina 4 tri-metilação; H3K9me3, histona H3 lisina 9 tri-metilação; H3K27me3, histona H3 lisina 27 tri-metilação; FACS, classificação de células activadas por fluorescência; RT-PCR, Reverse reação em cadeia de polimerase; qRT-PCR, RT-PCR quantitativo; GAPDH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase

Introdução

O câncer de pâncreas é o câncer mais letal comum porque geralmente é diagnosticado em um estágio avançado e é resistente à terapia [1]. A sobrevida global em 5 anos após o diagnóstico é de cerca de 5-6%, que é a taxa mais baixa de qualquer tipo de câncer [2]. Apesar de técnicas cirúrgicas recém-concebidos e drogas anti-câncer, a eficácia do tratamento para câncer de pâncreas não melhorou significativamente na última década devido à tendência para a invasão precoce e metástase [3]. Estas características altamente malignas são devido à auto-renovação e diferenciação de uma pequena subpopulação de células cancerosas com propriedades tronco-like, as chamadas células-tronco cancerosas (CSCs) [4, 5], que também são chamados de células-tronco como metastáticos [6, 7]. Estudos recentes revelaram que o destino de células estaminais é determinada por mecanismos epigenética incluindo modificação da histona em células normais quer [8] ou CSCs [9]. Mais importante ainda, é esperado identificação de alvos moleculares de CSCs para acelerar o desenvolvimento de novas terapias direcionadas [10]. Embora vários marcadores de superfície celular foram identificados como característica das CSCs pancreáticas [5, 11], os objectivos terapêuticos do processo invasivo e metastático ainda não são claras no cancro pancreático [12, 13]. Avaliação de estratégias terapêuticas para atingir as CSCs é difícil por causa da complexidade de reconstruir populações mistas com progênie diferenciada de uma maneira hierárquica [14, 15]. Um sistema de monitoramento baseado em funções específicas do CSC poderia ser uma solução para estas dificuldades, e nós utilizou a atividade do proteassoma baixo de CSCs para criar um sistema deste tipo. células da mama e do cancro de glioma humano foram manipuladas para expressarem estavelmente fluorescência verde fundido com o degron de ornitina descarboxilase (Gdeg), o que resultou na acumulação intracelular de proteína fluorescente verde Gdeg como uma consequência da baixa actividade do proteassoma 26S [16, 17] . Ao usar essa propriedade, que previamente construído um sistema de visualização em tempo real para CSCs de fígado humano e demonstraram a sua alta capacidade metastática com a formação de nicho [18]. Nosso sistema de visualização também foi usado para esclarecer as características altamente malignas de CSCs pancreáticos humanos [19]. No presente estudo, foram identificados como duplacortina-quinase 1 (DCLK1) como uma proteína que é predominantemente expressa em CSCs invasivo e metastático. O gene foi associado a epigenética mudanças, incluindo H3K4me3 e modificação da histona H3K27me3. DCLK1 foi previamente relatado para ser um candidato normais marcador de células estaminais no intestino [20, 21]. No entanto, Nakanishi

et al

. experimentos de rastreio de linhagem usadas e mostraram que as células estaminais DCLK1 marca de tumor que produzem continuamente progenitura do tumor [22]. Além disso, Westphalen

et al

. usou a mesma estratégia e relatou a relação entre as células DCLK1-positivos de longa duração e início de câncer de cólon [23]. De acordo com o recente relatório do Bailey

et al

., Neoplasias pancreáticas em camundongos que expressam DCLK1 conter morfológica e funcionalmente subpopulações distintas com propriedades CSC-like [24]. Usando o sistema de visualização acima e pâncreas metastático, nossos estudos revelaram que DCLK1 é altamente expressa em CSCs pancreáticas humanas e em amostras clínicas e pode representar um alvo terapêutico.

Materiais e Métodos

transdução retroviral do repórter degron em células de cancro pancreático humano

a sequência degron da ornitina descarboxilase (ODC) é reconhecido directamente por proteossomas, que leva à destruição imediata da proteína envolvida [16]. O retroviral vector de expressão de pQCXIN-ZsGreen-CODC, contendo fluorescência verde ZsGreen marcado degron ODC (Gdeg), foi gentilmente cedido pelo Dr. Frank Pajonk (Jonsson Comprehensive Cancer Center da UCLA, CA, EUA). O vector foi transfectado em células de empacotamento retrovirais platina [25], e o retrovírus recolhidas a partir do sobrenadante foi usado para infectar células de cancro do pâncreas. Os transfectantes estáveis ​​foram seleccionados com G418 (Geneticin; Promega, Madison, WI, EUA), e a acumulação da proteína ZsGreen-degronODC (Gdeg) foi monitorizada por microscopia de fluorescência e citometria de fluxo (canal FITC). Para verificar a transfecção estável, as células foram expostas ao inibidor de proteassoma MG-132 (Calbiochem, San Diego, CA, EUA) durante 12 horas. microscopia de fluorescência foi realizada utilizando AxioObserver (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha), e as imagens foram adquiridas digitalmente usando software AxioVision (Carl Zeiss).

in vitro migração e invasão celular ensaios

O duplo -chamber ensaio de migração foi realizada usando uma câmara de Transwell [26] (placa de 24 cavidades, poros de 8 ^ m; BD Biosciences, Canaan, CT, EUA). Para o ensaio de invasão, (BD Biosciences) transwells revestidos por matrigel (0,1 mg /mL) foram preparadas por incubação em meio sem soro durante 2 horas a 37 ° C numa placa de 24 poços. A câmara inferior foi preenchida com 0,8 mL de meio de cultura sem antibióticos. Então, expressão DCLK1 alta, do tipo selvagem, Gdeg

alta, e Gdeg

células tumorais alto-siDCLK1 (8 × 10

4 em 0,3 mL de meio isento de soro) foram semeadas na câmara superior e incubadas a 37 ° C durante 24 horas. As células tumorais na superfície superior do filtro foram removidas usando um cotonete de algodão. As células foram então fixadas com metanol a 100% e coradas com solução Giemsa, e o número de células que migram ou invadindo a superfície inferior foi contado em três campos de elevada ampliação seleccionados aleatoriamente (100 ×) para cada amostra. Cada experimento foi realizado em triplicado.

análise Microarray

Para a análise de expressão gênica, 2 × 10

5

células KLM1 recém-ordenados Gdeg alta e Gdeg

baixas foram usava. O ARN total foi extraído a partir de cada tipo de célula com QIAZOL, um Kit RNeasy Micro, e colunas de giro QIAshredder (Qiagen, Hilden, Alemanha). A integridade do ARN foi avaliada obtidos com um espectrofotómetro NanoDrop ND-100 (Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, EUA), um 2100Bioanalyzer, e um Kit RNA6000Pico (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EUA). De acordo com o Kit de GeneChip®3’IVT Express, protocolo P /N702646 Rev.7 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA), de ADN complementar foi preparado a partir de 100 ng de ARN total, utilizando um alvo de rotulagem de ciclo e um kit de reagente de controlo (Affymetrix). A hibridação e a detecção do sinal de HG-U133 mais 2,0 matrizes (Affymetrix) foram realizados. Os conjuntos de dados de microarranjos de Gdeg

células de alta e Gdeg

baixas foram normalizados e anotado com Expression Console Software ™ (Affymetrix). Os níveis de expressão de genes estimados foram obtidos como valores transformados-log2. Genes foram excluídos da análise, se a chamada de detecção foi de “marginal” ou “ausente” em ambos os Gdeg

células de baixa altura e Gdeg

.

silenciamento e superexpressão de

DCLK1

sirna (siRNA) visando os genes candidatos e mexidos siRNAs (siScr) não correspondentes quaisquer genes humanos foram adquiridos a Invitrogen. Recentemente classificados Gdeg

células elevadas (tanto KLM1 e BxPC3) foram semeadas a uma densidade de 2,0 x 10

5 células por poço em placas de 6 poços em meio de cultura de 2 ml. Depois disso, a transfecção com siARN foi realizada usando RNAiMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) de acordo com as instruções do fabricante [27]. Após a transfecção com várias concentrações (10 nM, 20 nM), as células foram incubadas durante 48 horas a 37 ° C em 5% de CO

2 atmosfera. O número de células viáveis ​​e não viáveis ​​foi contado por uma máquina automática de contagem de células utilizando azul de tripano exclusão de corante (CYTORECON; Hirata, Tóquio, Japão). No ponto de tempo de 48 horas após o siARN transfecção, as células foram separadas a partir de cada placa a ser usada para mais experiências. As sequências alvo de siRNA foram os de telas de RNAi de alto conteúdo de todo o genoma [28]. Para construir o vector de expressão shRNA (pSilencer

TM 2,1-U6 Puro; Invitrogen) [29], as células KLM1-Gdeg (2,0 × 10

5) foram transfectadas com 2,5 ug de plasmídeo com Lipofectamine2000 (Invitrogen). O meio foi mudado a cada 2 dias, e os transfectantes estáveis ​​foram isolados por incubação em meio contendo 400 ug /ml de puromicina. Para criar células tumorais transitórios com superexpressão DCLK1, usamos pCMV6-AC-GFP (RG217050 TrueORF

TM cDNA Clones e PrecisionShuttle

TM Sistema Vector, OriGene Technologies, Rockville, MD, EUA). KLM1 células foram transfectadas utilizando Lipofectamine2000 de acordo com o protocolo do fabricante. Após incubação a 37 ° C durante 48 horas, as células positivas para GFP foram classificadas para mais experiências.

Os estudos in vivo de tumorigenicidade e metástase

ratinhos fêmea NOD.CB17-PRkdcScid /J, envelhecido 5-6 semanas, foram adquiridos a Charles River Laboratory (Kanagawa, Japan). A cirurgia foi realizada sob anestesia isoflurano fornecida por inalação nariz-cone. Várias quantidades de células classificadas (1 × 10

2 a 1 × 10

5 Gdeg

high-KLM1 e Gdeg

low-KLM1; 1 × 10

2 a 1 × 10

4 Gdeg

high-BxPC3 e Gdeg

baixo BxPC3) foram misturadas com matrigel, e 100 ul foi injectado por via subcutânea em ambos os flancos dos ratos. em seguida, a formação de tumores foi monitorizado a cada 4 dias para um máximo de 10 semanas. O volume do tumor foi estimada utilizando a equação seguinte: volume = (comprimento) x (largura)

2/2. Cada grupo consistia em 4-6 murganhos. Para a análise de metástases do fígado, da pele abdominal e do músculo, aproximadamente 5 mm de comprimento, foram objecto de uma incisão ao lado da linha média. O baço foi exteriorizada através da incisão através da aplicação de tração suave, e as células ordenadas (Gdeg

high-KLM1, Gdeg

low-KLM1 e Gdeg

high-KLM1-shDCLK1, Gdeg

de alta BxPC3 e Gdeg

baixo BxPC3; n = 6), suspenso em 1 × 10

6 células por 100 ul de PBS, foram injectados apenas sob a cápsula do pólo inferior usando uma seringa de tuberculina com uma agulha de calibre 30 . A hemostase foi obtido através da aplicação de uma ligeira pressão (com um cotonete de algodão) no local da injecção. O baço foi então devolvido para a cavidade peritoneal, e o seu abdómen foi fechado utilizando duas suturas de seda 6-0, tanto através da pele e do músculo simultaneamente [30, 31]. Observou-se estes ratinhos durante 8 semanas, e, em seguida, investigou se metástases tinha ocorrido [32]. Todos os métodos in vivo neste estudo foram aprovados pelo Comitê de Terapia animal de Tokyo Medical and Dental University (permissão No.0150044A).

Pacientes e amostras

Foram incluídos pacientes que se submeteram primário e metastático (fígado e pulmão) ressecção do tumor de adenocarcinoma ductal pancreático no Medical and Dental University Hospital Tokyo entre 2005 e 2013. amostras pareadas foram utilizados para análises de imuno-histoquímica. tecido ressecado foi fixado em solução de formol a 10% e embebidos em parafina para análise histopatológica de acordo com as regras gerais para o Estudo clínico e patológico de câncer pancreático primário. Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética da Tokyo Medical and Dental University (Permissão No.1080) e consentimento informado por escrito foi obtido de todos os pacientes.

A análise estatística

Todos os valores são apresentados como a média ± SD, a menos que indicado de outra forma. O teste t de Student bicaudal (para comparação entre grupos) ou one-way análise de variância (para comparação de três ou mais grupos), seguido de Dunnett

post-hoc

testes foram utilizados para análises estatísticas. foi utilizado o software SPSS versão 21.0 (SPSS, Chicago, IL). A significância estatística foi definida como p . 0,05

Resultados

CSCs pancreáticas visualizados são particularmente capazes de metástase hepática

transfecção estável do repórter Gdeg em duas células de câncer pancreático humano linhas com diferentes potenciais de oncogênicos de metástases; KLM1 como células de alta capacidade com KRAS mutante e BxPC3 como células de baixa capacidade com KRAS tipo selvagem [33-35]. CSCs marcados pelo repórter demonstrou uma Gdeg

alta população que responderam por aproximadamente 1,0% do número total de células (S1 Fig). No ensaio para a esfera formação [36], o número de esferas ( 50 mm de diâmetro) derivada de Gdeg

de células de alta era significativamente mais elevada do que a de Gdeg

células baixas (p 0,01, Figura 1A e 1B). O aumento da tumorigenicidade in vivo também foi utilizado como um elemento de prova crítica para a existência de [4] CSCs. Assim, uma população classificada de Gdeg

células de baixa altas ou Gdeg

foi administrado por via subcutânea em camundongos NOD /SCID. Para Gdeg

células de alta derivadas de ambas as linhas celulares KLM1 e BxPC3, que confirmou o potencial altamente maligno (S2 Fig). Em ambas as linhas celulares KLM1 e BxPC3, Gdeg

de células de alta tinham uma significativamente maior capacidade de migrar e invadem que Gdeg

células de baixa num ensaio de câmara dupla (p 0,01, Figura 1C e 1D). Para investigar se as células Gdeg mediar metástases in vivo, Gdeg

células de baixa altas ou Gdeg

foram injetadas nos baços de NOD /SCID (n = 6). Após 8 semanas, que visualmente confirmada a presença de tumores no baço e contado o número de metástases do fígado. Encontramos tumores metastáticos significativamente mais hepáticas no Gdeg

grupo de alto do que no Gdeg

grupo de baixo (p 0,05; Gdeg

células de alta-KLM1, 5,3 ± 3,4 tumores contra Gdeg

baixa células KLM1, 0 ± 0 tumores, p 0,01; Gdeg

células de alta-BxPC3, 13,6 ± 5,1 tumores contra Gdeg

células de baixa-BxPC3, 2,2 ± 2,8 tumores) (Fig 2A e 2B, 2F e 2G ). Observamos também alguns micro-metástases no fígado de Gdeg

grupos elevadas (Fig 2C e 2H), mas notamos que há tumores metastáticos foram vistos em ratos injectados com Gdeg

low-KLM1 células. análise de imunofluorescência claramente revelado Gdeg

células de alta que foram localizadas às margens do tumor (Fig 2D e 2I). A proporção de Gdeg

células de alta na área da margem do tumor (MA; 200 mm) foi muito maior do que no tumor área de central (CA) (Gdeg

tumor high-KLM1; 26,1 ± 4,2% versus 4,1 ± 2,5%, Gdeg

tumor de alto-BxPC3, 21,0 ± 1,9% versus 4,1 ± 0,2%, p 0,01) (Figura 2E e 2J). Como no estudo anterior [11], os nossos resultados sugerem que a CSCs tenderam a invadir ainda mais fora do tumor.

(A) imagens microscópicas representativos de esferas são mostrados. Gdeg

high-KLM1 e Gdeg

células de alta BxPC3 formado esferas completas, mas Gdeg

Gdeg

células de baixa-BxPC3 baixo KLM1 e não o fez. Barra de escala, 50 mm. (B) O número de esferas ( 50 mm de diâmetro) observada em cada poço (n = 6). Os dados são a média ± DP. ** P 0,01 em comparação com Gdeg

alta. O teste t de Student dos dois lados foi utilizado para comparar dois grupos independentes. (C e D) migração e invasão celular foram analisados ​​com um ensaio duplo-câmara usando Gdeg

high-KLM1, Gdeg

low-KLM1, Gdeg

high-BxPC3 e Gdeg

low-BxPC3 células. imagens microscópicas representativos são mostrados. A quantificação da migração e invasão é apresentados como a média ± SD de três experiências independentes. ** P . 0,01 em comparação com Gdeg

de células de alta

(A e F) tumores metastáticos do fígado representativas são mostrados em ratinhos de 8 semanas após a injecção. (B e L) Histograma mostra o número médio de tumores no fígado (n = 6; média ± DP). Para ambas as linhas celulares, encontramos uma diferença significativa entre os Gdeg

alto e Gdeg

células de baixa. * P 0,05 em (B) e ** p 0,01 em (G). (C e H) As imagens microscópicas de fígados que foram ressecados, seccionadas e coradas com H E são mostrados. Algumas micro-tumores estavam presentes no fígado. barra de escala, 1000 m. (D e I) imagens microscópicas de fluorescência do tumor principal são mostrados. Para ambas as linhas celulares, Gdeg

células de alta foram localizados preferencialmente nas margens do tumor invasores. barra de escala, de 200 mm. imagens ampliadas das regiões enquadradas são mostrados. Barra de escala, 20 mm. (E e J) O gráfico mostra que a proporção de Gdeg

de células de alta foi significativamente maior na área marginal (MA) do que na zona central (CA; média ± DP). ** P 0,01. Contamos três áreas diferentes para cada região.

A superexpressão de DCLK1 em associação com a modificação da histona é responsável pela potencial invasivo de CSCs pancreático

Para esclarecer os marcadores invasivos e metastáticos de pâncreas CSCs, foram comparados os padrões de expressão gênica entre Gdeg

células de alta e Gdeg

células de baixa por hibridação microarray (S1 Data). análise Scatterplot dos 25,572 sondas para o qual a chamada de detecção foi de “presente” mostrou que 483 genes foram regulados positivamente e 1.138 genes foram reprimidos por mais de 2 vezes na Gdeg

células de alta-KLM1 comparação com Gdeg

low-KLM1 células. Com base na classificação mudança vezes nos Gdeg

células de alta (Tabela 1), a triagem siRNA para genes candidatos foi avaliada de acordo com os efeitos inibidores sobre Gdeg

migração elevada e invasão celular utilizando o ensaio de câmara dupla. Consequentemente, apenas o siRNA contra DCLK1 diminuiu significativamente a migração celular e invasão em relação aos controles, tanto KLM1 e BxPC3 Gdeg

células de alta (p 0,01, Fig 3A e 3B). DCLK1 foi identificado como uma molécula-alvo que está sobre-expressos em Gdeg

células de alta com a migração ea capacidade invasiva em comparação com Gdeg

células de baixa. QRT-PCR e análises de Western blotting revelou que o ARNm e proteínas DCLK1 foi sobre-expresso em Gdeg

células de alta, mas não em Gdeg

células de baixa (S3 Fig). Análise imunocitoquímica demonstrou proteínas DCLK1 foi localizada principalmente no citoplasma (Fig 4A e 4B), e redução da expressão de DCLK1 foi confirmada pela utilização de siRNA (Fig S3, Fig 4C e 4D). Em seguida, examinamos aspectos epigenéticas de

DCLK1

expressão através da realização de imunoprecipitação da cromatina (ChIP) análise de três marcadores histonas metilação chave, H3K4me3, H3k9me3 e H3K27me3, em ambas as linhas celulares Gdeg. Como mostrado na Fig 4E, Gdeg

de células de alta expressaram níveis mais elevados de H3K4me3, que está associada com promotores activos, do que H3K27me3, que está associada com os promotores silenciados. Gdeg

células de baixa foram quase bivalente. Estes resultados implicam que

expressão DCLK1

em linhas celulares Gdeg foi regulamentado pela modificação da histona de H3K4 e H3K27. Nós não encontramos nenhuma diferença nos níveis de H3K9me3 entre Gdeg

alto e Gdeg

baixo nestas linhas celulares.

(A) ensaio duplo-câmara de migração e invasão para ambos os Gdeg

Linhas de alta celulares depois do tratamento. imagens microscópicas representativos são mostrados. (B) O número de migrar e invadir as células, em comparação com o controle foi notavelmente suprimidos em ambos os Gdeg

linhas celulares de alto siDCLK1. # não significativo, ** p . 0,01, através da análise de uma via de variância seguido de Dunnett testes de comparação múltipla

(A e B) analisa imunocitoquímica de DCLK1 em ambas as linhas celulares (ampliação original × 200) são mostrados. Gdeg

células de alta proteína expressa DCLK1, que foi localizado no citoplasma, mas Gdeg

células de baixa mostrou apenas fraca expressão. Barra de escala, 10 | im. (C e D) Análise imunocitoquímica das células tratadas com

DCLK1

siARN espec�ico é mostrado (ampliação original x 200). a expressão da proteína DCLK1 foi diminuída em Gdeg

células de alta após a transfecção com siDCLK1. Barra de escala, 20 mm. (E) a análise chip é mostrado. Ambos os Gdeg

linhas de células altas foram fortemente enriquecido para H3K4me3 comparação com H3K27me3 na região promotora

DCLK1

. Histona H3 e IgG foram usados ​​como controles positivos e negativos para a análise de chip, respectivamente.

DCLK1 promove alterações morfológicas, migração e invasão em células cancerosas pancreáticas humanas

Para investigar o papel do DCLK1 em células de cancro pancreático humano, adotamos uma estratégia de ganho de função usando células KLM1 que transitoriamente sobre-expressos DCLK1 GFP. Como reportado anteriormente para as linhas de células neuronais, a análise de imunof luorescência de KLM1-DCLK1-GFP demonstrou padrões de sobreposição de expressão DCLK1 com microtúbulos usando um anticorpo α-tubulina [37] (Figura 5A). A função de DCLK1 em células de cancro pancreático humano pode assim ser o de controlar a acção dos microtúbulos. Movimento e alterações morfológicas incluindo pseudópodos de alongamento foram claramente observados em imagens microscópicas de lapso de tempo (Fig 5B). Durante um período de observação de 15 horas, a distância de migração de células KLM1-DCLK1-GFP foi maior do que a de células KLM1 de tipo selvagem (p 0,01, Figura 5C). No ensaio de duplo-câmara, o número de migrar e invadir células KLM1-DCLK1-GFP foi maior do que a de células KLM1 de tipo selvagem (p 0,01, Figura 5D). Além disso, as células KLM1-DCLK1 GFP-trans-localizado a via rápida alternância de ciclos de expansão e contração morfológica chamados migração amebóides (S1 Video) [38].

(A) Análise imunocitoquímica mostrou que DCLK1 era predominantemente co- localizada com α-tubulina em células KLM1-DCLK1-GFP. Barra de escala, 20 mm. imagens ampliadas das regiões enquadradas são mostrados na segunda fila. Barra de escala, 10 | im. (B) células Quatro KLM1-DCLK1-GFP foram observados com a fotografia de lapso de tempo de 15 horas. Eles adotaram uma morfologia amebóides enquanto se moviam. Barra de escala, 20 mm. Uma imagem ampliada das regiões enquadradas é mostrado no canto. setas brancas marcar alongamento pseudópodos. Barra de escala, 10 | im. Suas faixas (mostrados como linhas pontilhadas do vermelho) foram medidos. (C) Histograma mostra a distância média de migração de células do tipo selvagem KLM1 (células de controlo) e células KLM1-DCLK1-GFP (n = 4 cada, média ± SD). células KLM1-DCLK1-GFP migrou significativamente mais tempo do que as células de controlo. ** P 0,01. (D) O número de migrar e invadir células KLM1-DCLK1-GFP foi também mais elevada do que a de células de controlo. ** P . 0,01

DCLK1 knockdown leva a uma redução na capacidade metastática de CSCs pancreáticas

Para confirmar a análise in vivo de perda de função, knockdown estável de DCLK1 foi avaliada em células Gdeg-KLM1 usando

DCLK1

shRNA. A qualidade de transfecção foi confirmada por qRT-PCR, transferência de Western e análise imunocitoquímicos (Fig 6A-6C). A população de shDCLK1-Gdeg

células de alta KLM1 foi menos do que 0,5% do número total de células (Fig S1). Nós injetamos shDCLK1-Gdeg

células de alta KLM1 recém-ordenados em baços de NOD /SCID (n = 6). metástases hepáticas significativas foram detectadas após a injecção de controle Gdeg

células de alta, mas, curiosamente, não há lesões metastáticas foram identificados após a injecção de shDCLK1-Gdeg

células de alta, conforme determinado por exame macroscópico e microscópico (Fig 6D). Estes resultados implicaram que DCLK1 desempenha um papel essencial na metástase hepática em câncer pancreático humano.

(A e B)

DCLK1

espec�ico shRNA (shDCLK1) diminuiu significativamente mRNA DCLK1 e expressão da proteína em Gdeg

células de alta-KLM1. ** P 0,01. (C) A diminuição acentuada na DCLK1 imunorreatividade foi observada após a transfecção com shDCLK1 comparação com Gdeg

alta (controle). Barra de escala, 20 mm. (D) Alguns tumores ao longo da borda do fígado eram visíveis no Gdeg

grupo de alto KLM1, mas nenhum tumor foram vistos na shDCLK1-Gdeg

alta grupo. O número médio de tumores do fígado (n = 6 ratinhos) é mostrado (média ± DP). Observou-se uma diferença significativa entre o grupo controle eo grupo shDCLK1. * P . 0,05

expressão dominante da DCLK1 em tumores metastáticos é reconhecida clinicamente em pacientes com câncer de pâncreas

Entre 135 pacientes com câncer pancreático que se submeteram à ressecção cirúrgica 2005-2013 em nosso hospital, seis tumores metastáticos foram ressecados síncrona ou metachronously. Estes seis pares de tumores primários e metastáticos foram avaliados quanto à expressão de DCLK1. Os tumores primários e metastáticos foram ressecados sincronicamente em três casos, e tumores primários e metástases à distância metacrônicos foram ressecados separadamente nos outros três casos (Tabela 2). Interessantemente, as células cancerosas que foram positivamente coradas para a proteína DCLK1 raramente foram detectados nos tumores primários, mas foram claramente detectadas em tumores metastáticos (figura 7A-7F), e em todos os casos, o marcador de coloração foi maior em tumores metastáticos do que em tumores primários (Figura 7G). Em casos 5 e 6, em particular, os tumores primários foram completamente ressecado e sem recidiva local ocorreu. No entanto, embora estes pacientes foram tratados com quimioterapia adjuvante, metástase distante apareceu. Nestes dois casos, a expressão DCLK1 foi muito maior no tumor metastático do que no tumor primário. Estes resultados sugerem que os tumores metastáticos são resistentes à quimioterapia convencional e que DCLK1 é um marcador de tumores metastáticos.

(A, C, e E) Nas lesões primárias, algumas células cancerosas foram positivos para DCLK1, e a coloração intensidade foi fraca (esquerda; 100 ×, certo; 400 ×). (B, D, e F) Em lesões metastáticas (fígado ou pulmão), o número de células que expressam DCLK1 foi maior do que em tumores primários, e a intensidade da coloração foi mais forte (esquerda; 100 ×, direito; 400 ×). (G) A comparação dos escores de positividade entre lesões primárias e lesões metastáticas. Em todas as seis amostras clínicas, DCLK1 foi mais altamente expresso na lesão metastática do que na lesão primária.

Discussão

DCLK1 consiste de um N-terminal que é de 65 % semelhante a duplacortina (DCX) ao longo de todo o comprimento de DCX, mas DCLK1 também contém um adicional de 360 ​​aminoácidos no domínio C-terminal, a criação de um putativo de Ca

2 + /dependente de calmodulina-proteína-quinase.

DCLK1

está localizada na região do cromossoma 13q13.3 [37]. O

DCX

gene, que está localizado na região cromossoma Xq23, é uma proteína associada a microtúbulos necessária para a migração de células progenitoras neurais para o córtex cerebral.

Mutações em DCX levar a defeitos de laminação corticais no cérebro em desenvolvimento que são chamados subcortical heterotopia banda em fêmeas e Lissencefalias clássicos em homens [39]. Um estudo anterior do rato em que DCLK1 e /ou DCX foi nocauteado revelou que ambas as proteínas têm um papel geneticamente compensatórias na migração neuronal; isto é,

DCLK1

funções de genes numa via parcialmente redundantes com DCX na formação de projecções axonais através da linha média e a migração de neurónios corticais [40]. Descobrimos que overexpressed DCLK1 promove migração e invasão em linhas celulares, e knockdown suprime essas habilidades. Nós cuidadosamente considerados como os nossos resultados referentes ajuste DCLK1 com resultados passados ​​sobre um papel neuronal para DCLK1. existe alguma evidência para o potencial envolvimento de genes de orientação dos axônios na carcinogênese pancreática [41], e estes resultados são consistentes com a nossa constatação de que altamente expresso DCLK1 está intimamente relacionado com invasão e metástase em câncer pancreático. epigenética controlo da expressão do gene desempenha um papel importante na determinação do destino das células. Em particular, a estrutura da cromatina de ordem superior está a emergir como um importante regulador da diferenciação de células estaminais [8], incluindo o desenvolvimento mesmo pancreático [42]. Durante a indução da pluripotência, remodelação da cromatina apropriada é necessária para a expressão de genes específicos de células estaminais. Além disso, vários estudos sobre tumores cerebrais, carcinoma hepatocelular e câncer de mama têm demonstrado que a modificação da histona é responsável pela estrutura hierárquica que compreende células-tronco cancerosas no ápice [43-45]. Rheinbay

et al

. relatou a perda de H3K27me3 ativa uma via de sinalização necessária para a manutenção e tumorigenicidade de CSCs glioblastoma [43]. Knockdown de H3K20 metiltransferase PR-SET7 no fígado induzidos desenvolvimento espontâneo de carcinoma hepatocelular com propriedades de células-tronco do câncer [44]. Westcott

et al

. relatou uma subpopulação epigenetically distinta de células tumorais da mama com uma melhor capacidade de invadir coletivamente [45]. Neste estudo, a análise ChIP revelou que o

DCLK1

local de início da transcrição em ambos os Gdeg

Linhas de alta celulares foi mais fortemente marcada com a modificação da histona para a ativação do gene (H3K4me3) do que a repressão (H3K27me3).