Abstract

O câncer de ovário apresenta desafios terapêuticos devido à detecção tipicamente tarde, metástase agressiva e resistência terapêutica. O factor de factor de transcrição-Krüppel como 4 (KLF4) tem sido implicada em cancros humanos como um supressor de tumores ou oncogenes, embora o seu papel depende grandemente do contexto celular. O papel de KLF4 em cancro do ovário não foi elucidado em pormenor mecanicista. Neste estudo, foram investigados o papel de KLF4 em células de cancro do ovário por transduzir as linhas celulares de cancro do ovário SKOV3 e OVCAR3 com um vector lentiviral KLF4 doxiciclina-indutível. A sobre-expressão de KLF4 reduziu a proliferação celular, migração e invasão. O marcador de células gene da E-caderina epitelial foi significativamente regulada, enquanto que os genes marcadores de células mesenquimais vimentina, twist1and snail2 (lesma) foram reprimidos, tanto KLF4-expressando células SKOV3 e OVCAR3. KLF4 inibiu a β factor de crescimento transformante (TGF) epitelial induzida a transição mesenquimal (EMT) em células de cancro do ovário. Tomados em conjunto, os nossos dados demonstram que as funções KLF4 como um gene supressor de tumor em células de cancro do ovário por inibição induzida EMT-TGFp

citação:. Chen Z, Wang Y, Liu W, Zhao L, Lee S, Um Balogh , et ai. (2014) doxiciclina Induzível Kruppel-Like Fator 4 Lentivirus Vector Medeia mesenquimais para epiteliais de transição em células de câncer de ovário. PLoS ONE 9 (8): e105331. doi: 10.1371 /journal.pone.0105331

editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América

Recebido: 18 Março, 2014; Aceito: 20 de julho de 2014; Publicação: 19 de agosto de 2014

Direitos de autor: © 2014 Chen et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. O autores confirmam que todos os dados subjacentes às conclusões estão totalmente disponíveis sem restrições. Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este projecto foi parcialmente financiado pelo Instituto Nacional de Saúde (HL095957, HD061420 a JY e CA092160 a GT) e financiamento de arranque UTHSC, clínica Ocidental Centro de câncer (JY) e Governo chinês (2010CB530204 para CL, 112.102.310.110 para YG, 2011DFA33290 para WG). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Junming Yue é membro do Conselho Editorial PLOS ONE. Isto não altera a adesão dos autores para PLoS ONE políticas e critérios editoriais. Todos os autores não têm interesse competindo a declarar.

Introdução

O câncer de ovário tem uma alta taxa de mortalidade, supostamente provoca 15.000 mortes por ano em os EUA [1]. Apesar de melhorias significativas foram feitas na detecção de cancros do ovário na década passada, mais do que 20000 novos casos diagnosticados todos os anos [1], [2]. As opções terapêuticas para o cancro do ovário são limitados devido à sua resistência à quimioterapia e terapia de radiação que conduz a frequentes recorrências [3], [4].

KLF4 tem sido demonstrado que regulam a proliferação celular e diferenciação, o seu papel tem sido amplamente investigada em vários cancros humanos usando gain- e abordagens de perda de função. No cancro do cólon e da próstata, KLF4 actua como um oncogene [5], [6]. Em contraste, que desempenha um papel supressor de tumor no neuroblastoma, cancro do pulmão, cancro gástrico, linfoma, cancro do colo do útero, cancro do ducto pancreático e carcinoma hepatocelular [7], [8], [9], [10], [11], [12], [13]. No cancro da mama, KLF4 pode funcionar tanto como um oncogene [14], [15] e um supressor de tumores [16], [17], [18]. O papel da KLF4 no câncer de ovário não foi abordada de forma adequada e mecanicamente. Um estudo anterior indicam que o nível de expressão KLF4 foi significativamente reduzida em comparação com o cancro do ovário epitélio normal do ovário, o que sugere que poderia potencialmente KLF4 actuar como um supressor tumoral no cancro do ovário [19].

KLF4 desempenha um papel único na reprogramação de células estaminais mesenquimais por facilitar a transição para epitelial (TEM) [20]. O interruptor fenotípica celular epitelial de células de transição mesenquimal (EMT) é um processo fundamental para a metástase de tumores que é uma característica proeminente dos carcinomas do ovário. O MET ou EMT leva a alterações da epiteliais e expressão do gene marcador mesenquimais, que incluem snail1 2, Zeb 1 2, Twist, vimentina, E-caderina [18], [21], [22]. EMT é regulada por múltiplas vias de sinalização, que incluem WNT, TGF e Notch. [23], [24], [25]. Estudos recentes indicam que miARNs regular EMT ou Met vias alvejando genes epiteliais ou do mesênquima marcador de células que incluem o miR-194, o miR-203 e miR-200 ° C [22], [26]. KLF4 tem sido demonstrado que regulam EMT em várias células cancerígenas diferentes. No carcinoma hepatocelular, da mama, da próstata e células cancerosas, KLF4 activa a transcrição do gene marcador de células E-caderina epitelial e reprime o gene marcador de células mesenquimais caracol 2 (lesma) ligando-se aos seus respectivos promotores. KLF4 nestes cancros promove TEM e inibe o crescimento de células de tumor [10], [24], [27]. No presente estudo, investigamos o papel de KLF4 em células de cancro do ovário usando um doxiciclina (Dox) dependente KLF4-inducible lentiviral vector (Tet-on) e descobriu que a sobre-expressão indutível da KLF4 reduziu a proliferação celular, migração e invasão através da promoção MET em células de cancro do ovário.

Materiais e Métodos

cultura celular

As linhas de células de cancro do ovário SKOV3, OVCAR3 e linha de células de cancro da mama MCF7 foram obtidas a partir de ATCC e cultivadas em de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com FBS 10% (Hyclone, Logan, UT), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina (Invitrogen, Carlsbad, CA). células HEK293 FT foram cultivadas em meio DMEM com 10% de FBS, 100 U /ml de penicilina, 100 ug /ml de estreptomicina, 1% de glutamina, 1% de aminoácido não essencial, e geneticina com uma concentração final de 1 ug /ml.

vector lentiviral produção

O Dox-indutível KLF4, transactivador (rtTA-M3) inverter, e EGFP vectores lentivirais foram empacotados em células HEK293FT e produzido como descrito anteriormente [28]. As linhas celulares estáveis ​​com sobre-expressão de KLF4- EGFP- ou foram gerados por co-transdução de células SKOV3, OVCAR3, e MCF7 com os vectores lentivirais KLF4, EGFP com rtTA-M3 e seleccionado com 5 ug /ml de puromicina. Para induzir KLF4 e expressão EGFP, Dox foi adicionado em meio de crescimento normal, como indicado.

colónia celular ensaio de formação de

células SKOV3, MCF7 e OVCAR3 transduzidas com vírus superexpressão KLF4 ou EGFP (200 células /bem cada) foram plaqueadas em triplicado em placas de 6 poços e cultivadas durante 2 semanas. Eles foram depois coradas com 0,1% de violeta de cristal, e as colónias de células foram contadas como descrito previamente [29].

Ensaio MTT

As células foram plaqueadas 8000 por poço em placas de 96 poços e cultivadas durante 24 h. Em seguida, 10 ul de MTT foram adicionados a cada poço e incubou-se durante ~ 4 horas. A reacção foi terminada pela adição de 100 ul de reagente de detergente; as placas foram incubadas a 22 ° C no escuro durante 2 h; e, em seguida, a absorvância foi medida a 570 nm de comprimento de onda.

A migração celular ensaio

células transduzidas (3 × 10

5 culas por po) foram semeadas em triplicado em placas de 6 poços e cultivadas durante 24 h. A superfície celular foi riscada com uma ponta de pipeta e lava-se três vezes com PBS. meio de crescimento fresco foi adicionado durante um adicional de 24 h. A taxa de migração foi calculada utilizando a fórmula seguinte: (a área da área da ferida, a 0 h – a área da ferida em 24 horas) /área da ferida, a 0 h. O ensaio de migração Transwell foi realizada usando uma câmara modificado (BD Falcon, San Jose, CA). Estas câmaras foram inseridas numa placa de 24 poços. Células (3 x 10

4) em 300 ul de DMEM isento de soro foram adicionadas à câmara superior. O quimioatraente em DMEM foi adicionado para dentro da câmara inferior de cada poço e as células foram incubadas durante 24 h. As células que não migraram médio e na câmara superior foram removidas enquanto que, as células migradas no lado inferior das membranas foram fixadas com metanol e coradas com violeta de cristal. Fotos foram tiradas a 10X de ampliação. As células em pelo menos três campos diferentes foram contados.

invasão celular ensaio

células

SKOV3 e OVCAR3 (5 × 10

5) transduzidas com vírus superexpressão EGFP e KLF4 foram semeadas em sérica DMEM livre para insertos pré-revestidas com Matrigel (BD BioCoat, 24 bem tumor do sistema invasão (BD Biosciences, San Jose, CA). DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado à câmara do fundo do sistema de invasão como o quimioatractivo. Após 24 h, as inserções Transwell foram coradas utilizando 4 ug /ml de Calceina AM (Life Technologies, Grand Island, NY) a 37 ° C durante 1 h. a intensidade de fluorescência foi medida utilizando o BioTek Sinergia (Winooski, VT) leitor de placas a excitação e emissão comprimentos de onda de 485 nm e 528 nm, respectivamente.

agar mole ensaio

para o ágar de fundo, 0,6% de agar Noble em DMEM contendo 10% de FBS foi adicionado a placas de 6 poços. dois milhões células em DMEM contendo 10% de FBS e 0,35% de agar Noble foram adicionados a ágar de fundo. o meio de crescimento foi então adicionada à parte superior de agar, uma vez que tinha solidificado e as células foram alimentadas com meio de crescimento fresco a cada 5 d, e as colónias foram contadas sob um microscópio de luz depois de 2 semanas.

imunofluorescente coloração

para detectar a expressão de genes marcadores EMT-associados, KLF4-expressar e controlar células SKOV3 foram fixadas durante 10 min, utilizando 4% de PFA, lavada três vezes com 0,1% de Tween 20 em PBS (PBST), e incubadas com tampão (5% de soro de cabra normal, 3% de albumina de soro bovino e 0,1% de Triton X-100 em PBS) de bloqueio, durante 1 h. Os anticorpos primários para E-caderina, snail2, e vimentina (1:200 diluição, Cell Signaling, Danvers, MA), foram incubados com células fixas durante a noite. Após lavagem três vezes durante 5 min com PBST, Alexa 488 ou 594 de cabra anti-coelho conjugado (1:200 diluição, Life Technologies) foram adicionados anticorpos durante 1 h a temperatura ambiente. os núcleos das células foram contrastadas com DAPI (Vector Laboratories, Inc .; Burlingame, CA). As imagens foram tiradas com um microscópio de fluorescência Nikon invertido.

cromatina imunoprecipitação (CHIP)

chip foi realizada utilizando o kit ChIP-IT Expresso enzimática (Motif Ativo, Carlsbad, CA) de acordo com o fabricante do instruções. Resumidamente, KLF4-expressam e controlam células SKOV3 foram reticulado com 1% de formaldeído, durante 10 min à temperatura ambiente. As células foram colhidas e sonicada para cortar o ADN cromossómico. A imunoprecipitação foi realizada por ligação de 10 ug de anticorpo de coelho anti-IgG ou KLF4 (Santa Cruz Inc., Dallas, Texas) aos lisados ​​e incubados a 4 ° C com rotação durante a noite. complexos de cromatina foram eluídos a partir de contas magnéticas por reversa-reticulação. ADN cromatina foi purificado utilizando o kit de purificação PCR QIAquick (Qiagen, Valência, CA) e eluída em 40 ul de água. ADN (4 ul) foi usado para a reacção de PCR quantitativo para detectar a presença do promotor de E-caderina. Os iniciadores utilizados para detectar o promotor de E-caderina foram 5′-TAG AGG GTC ACC GCG TCT AT-3 ‘(directo) e 5’-GTG TCA CAG CTT TGC AGT TC-3 (inverso), tal como descrito anteriormente [16].

Western blot

células de ovário e câncer de mama foram recolhidos em tampão RIPA (Thermo Scientific, Rockford, IL) contendo 1% de Halt proteinase Inhibitor Cocktail (Thermo Scientific, Rockford, IL). Uma quantidade igual de proteína (40 pg /pista) foi carregada sobre géis de 10% SDS-PAGE e transferidos para membranas de nitrocelulose. As membranas foram bloqueadas com leite não gordo a 5% durante 1 h e incubou-se com anticorpos primários contra KLF4 (Cell Signaling), GAPDH (Sigma; St. Louis, MO), vimentina, E-caderina, ou snail2 (Cell Signaling).

a análise estatística

As diferenças significativas foram determinados a partir de duas ou três experiências independentes realizadas em triplicado e apresentados como médias ± SD usando de

t

-test Student.

p

. 0,05 foi considerado significativo

Resultados

A superexpressão de KLF4 em células de cancro do ovário usando o sistema Tet-on

Para determinar o papel de KLF4 em células de cancro do ovário, construímos um vector lentiviral indutivel, em que o gene KLF4 foi conduzido por tetraciclina (Tet) ou um promotor responsivo-Dox (TRE estanque). O activador de transcrição reversa rtTA-M3 foi conduzido por um promotor ubíquo C humana constitutiva clonado num vector lentiviral separada (Figura S1A). KLF4 expressão pode ser activado por rtTA-M3 na presença de Dox de uma forma dependente da dose. Um vector lentiviral EGFP-indutível foi construído e serviu como controlo. Para examinar a expressão induzida de KLF4 e EGFP nas linhas celulares do cancro do ovário SKOV3 e OVCAR3, Dox foi adicionado a uma concentração final de 1 ug /ml, e a expressão da EGFP KLF4 e em diferentes pontos de tempo foi detectado por Western blot. Expressão de EGFP e KLF4 aumentada gradualmente ao longo de um período de 24 h (Figura S1B). expressão EGFP em SKOV3 e OVCAR3 células de cancro do ovário foi visualizada utilizando microscopia fluorescente 48 h após a adição de Dox (Fig. S2A, B). tratamento Dox causou alterações na morfologia celular de células SKOV3. A morfologia das células do tipo epitelial arredondada foi observada em células SKOV3 KLF4-transduzidas em comparação com a forma epitelial multipolar achatada tipo célula de células de controlo de EGFP ou KLF4 às 48 e 72 h (Fig. S1C e a Fig. S2C). No entanto, a morfologia das células OVCAR3-KLF4 transduzidas não foram alterados após o tratamento Dox comparação com células de controlo (dados não apresentados).

KLF4 inibe a proliferação celular e formação de colónias

Para investigar o papel de KLF4 na proliferação de células de cancro do ovário, o ensaio de MTT foi realizado em células SKOV3 e de controlo KLF4-transduzidas. A seguir ao tratamento Dox, proliferação em células que sobre-expressam KLF4 foi significativamente inibido em comparação com EGFP ou KLF4 células de controlo (não-Dox) (Figura 1A). Também realizamos ensaios de formação de colónias em células SKOV3 e OVCAR3 transduzidas com vetores de controle KLF4 e EGFP. O número de colónias em células que sobre-expressam KLF4 foi significativamente reduzido em comparação com células de controlo de EGFP e KLF4 (Figura 1B, C). Além disso, também foram realizados os ensaios de formação de colónias em agar mole para determinar se KLF4 afecta o crescimento celular independente de ancoragem. Da mesma forma, os nossos resultados indicaram que KLF4 inibe a proliferação celular no meio de cultura semi-sólidas, em comparação com células de controlo (Figura 1D).

. A proliferação celular de células SKOV3, quer transduzidos com EGFP ou KLF4 foi examinado por ensaio de MTT em diferentes pontos de tempo após o tratamento Dox. A sobre-expressão da proliferação celular significativamente reduzida em comparação com KLF4 que em células de controlo tratados com Dox (*

P

0,05). B. 200 SKOV3 células transduzidas com vectores de controlo ou KLF4 EGFP lentivirais foram semeadas em cada poço de uma placa de 6 poços e cultivadas durante 14 d. colónias de células foram contadas após coloração com violeta de cristal. O número de colónias em células que sobre-expressam KLF4 foi significativamente reduzida comparada com a de células de controlo tratados com Dox (***

P

0,001). C. O número de colónias em células OVCAR3 KLF4-sobre-expressam foi significativamente reduzida comparada com a de células de controlo tratados com Dox (**

P

0,01). ensaio de formação de colónia D. agar mole foi realizado em triplicado utilizando células SKOV3. As colónias foram fotografadas e contadas após 3 semanas. O número de colónias em células-superexpressão KLF4 foi significativamente reduzida comparada com a de células de controlo tratadas com Dox (***

p Art 0,001).

KLF4 reduz a migração celular e invasão

Uma propriedade fundamental das células cancerosas invasoras é a sua maior mobilidade. Para investigar se KLF4 afecta a migração celular na linha celular de cancro do ovário SKOV3, ensaio de cicatrização da ferida foi realizada utilizando células de controlo e SKOV3 KLF4-transduzidas. Como mostrado na Figura 2A, a taxa de migração celular foi significativamente reduzido em células que sobre-expressam KLF4 em comparação com as taxas em EGFP- e células de controlo transduzidas KLF4. quimiotaxia celular foi examinada utilizando o ensaio de migração Transwell. Tal como mostrado na Figura 2B e C, as células migradas foram significativamente reduzidos em KLF4 que sobre-expressam células SKOV3 e OVCAR3 comparação com os controlos de células e KLF4 EGFP. Para examinar se KLF4 afecta a invasão de células, um ensaio de invasão de células foi realizada em células transduzidas KLF4-SKOV3 e OVCAR3 utilizando placas Transwell revestidas com Matrigel. A sobre-expressão de KLF4 significativamente reduzida a invasão de células comparada com a de controlos em ambas as linhas celulares (Figura 3A, B).

. ensaio de cicatrização de feridas foi realizada para examinar a taxa de migração de células SKOV3 e transduzidas com KLF4 EGFP vectores lentivirais. As fotografias foram tiradas em 0 e 24 h após a zero inicial. As taxas de migração foram quantificadas através da medição de três áreas de ferida diferentes. Foram realizadas três experiências separadas. taxa de migração foi significativamente reduzida em células que sobre-expressam KLF4 comparada com a de controlos tratados com Dox (**

P

0,01). B, C. Transwell ensaio de migração foi realizada em células SKOV3 e OVCAR3. Superexpressão de KLF4 reduziu significativamente a migração de células em SKOV3 (B) e as células OVCAR3 (C) em comparação com os controles tratados com Dox (***

p Art 0,001).

a, B. ensaio de invasão celular foi realizada utilizando placas Transwell revestidas com Matrigel para SKOV3 (a) e células OVCAR3 (B). A taxa de invasão foi significativamente reduzida em células que sobre-expressam KLF4 comparada com a de células de controlo tratados com Dox a partir de ambas as células OVCAR3 e SKOV3 (**

P

0,01). Os dados foram coletados a partir de três experimentos separados e analisados ​​utilizando Student

t

-Testes.

KLF4 promove MET em células de cancro do ovário

Para investigar se KLF4 regula EMT em células de cancro do ovário, a e-caderina e marcadores mesenquimais gene genes marcador de células epiteliais snail2 e vimentina foram examinados em células SKOV3 e OVCAR3 KLF4-transduzidas utilizando Western blot. O marcador de E-caderina epitelial foi significativamente regulada positivamente, ao passo que a vimentina marcadores mesenquimais e snail2 foram significativamente reduzidas em células que sobre-expressam KLF4-EGFP em comparação com controlos e KLF4 (Figura 4A, B). Também realizamos imunomarcação nas células KLF4-superexpressão e de controlo para examinar marcadores TEM. Ambos E-caderina e vimentina coloração eram proeminentes nas membranas celulares, enquanto snail2 manchado os núcleos celulares. Da mesma forma para as transferências de Western, imuno mostraram que a expressão de E-caderina foi regulada positivamente, ao passo que a vimentina e snail2 foram regulados negativamente (Figura 4C, D e E). Também examinamos a expressão de TWIST1 usando em tempo real RT-PCR em células SKOV3 KLF4 transduzidas e descobriu que TWIST1 foi significativamente regulada negativamente em KLF4 expressando células SKOV3 em comparação com o controle (Fig. S4). Estes resultados suportam a hipótese de que KLF4 promove MET em células de cancro do ovário. Para analisar se a regulação positiva de E-caderina foi causada pela activação da transcrição, foi realizada cromatina imunoprecipitação em KLF4-expressar e controlar células SKOV3, e a região do promotor de E-caderina foi amplificado a partir de ADN cromática enriquecido por PCR em tempo real como descrito anteriormente [ ,,,0],16]. KLF4 expressão em células SKOV3 levou a um enriquecimento de aproximadamente 15 vezes de E-caderina em comparação com os controlos (Figura 4F), indicando que KLF4 se liga ao promotor de E-caderina e activa a expressão de E-caderina nas células de cancro do ovário.

A. B. manchas de Western foram realizadas em células transduzidas e KLF4–EGFP SKOV3 (A) e (B) OVCAR3 com ou sem indução Dox. expressão de E-caderina foi significativamente regulada (***

p Art 0,001), enquanto vimentina (**

p Art 0,01) e snail2 (***

p

0,001) foram regulados negativamente em células que sobre-expressam KLF4- SKOV3 em comparação com células de controlo (a). E-caderina (**

p Art 0,01) foi regulada, enquanto vimentina (*

p Art 0,05) e snail2 (***

p Art 0,001) foram regulados negativamente em KLF4 que sobre-expressam OVCAR3 células em comparação com células de controlo tratados com Dox (B). E-caderina (C) e vimentina (D) foram imunocoradas em membranas celulares em KLF4-expressar e controlar células SKOV3. E. Snail2 foi com detalhes em núcleos celulares em KLF4-expressar e controlar células SKOV3. F. de ligação ao promotor de E-caderina nas células SKOV3 KLF4 foi analisada por imunoprecipitação da cromatina utilizando anticorpo KLF4 e detectado por PCR em tempo real utilizando iniciadores de E-caderina específicos de. Os níveis de ADN enriquecido-chip foram normalizados para DNA de entrada, seguido por subtração de ligação não específica determinada por IgG de controlo (***

p Art 0,001)

KLF4. inibe EMT induzida por TGF em células de cancro do ovário

Para examinar o mecanismo se KLF4 regula TGF EMT induzida em células de cancro do ovário, células SKOV3 e OVCAR3 foram tratados com diferentes doses de TGF. A expressão das proteínas marcadoras EMT E-caderina, vimentina, e snail2 foi examinada utilizando Western blot. Os nossos dados indicam que o TGF-p em células de EMT promovido cancro do ovário por regulação negativa da E-caderina e upregulating snail2 e vimentina (Figura 5A, B). Por outro lado, quando tratada KLF4-expressar e controlar células SKOV3 e OVCAR3 com doses crescentes de TGF-p, expressão KLF4 inibiu significativamente EMT-TGFp induzida em ambas as linhas celulares (Figura 6A, B).

linhas celulares de cancro do ovário humano SKOV3 (A) e OVCAR3 (B) foram tratadas com doses diferentes de TGFp por 48 h. genes marcadores associados a EMT, incluindo E-caderina, snail2, e vimentina foram examinados através de Western blot. Significados foram determinados pela comparação TGFp tratada para não-tratamento (* p 0,05, ** p 0,01, *** p 0,001).

linhas celulares de cancro do ovário SKOV3 (A) e OVCAR3 (B) transduzida com lentivírus KLF4 sobre-expressão e controlo de vector foram tratados com TGF-p durante 48 h, e as expressões de proteínas de genes marcadores associados EMT-e-caderina, snail2 e vimentina foram examinadas utilizando Western blot. Diferenças significativas foram comparados entre KLF4 expressar e grupo controle (** p 0,05, *** p 0,001)

Discussão

Neste estudo, nós investigamos o papel de. KLF4 em células de cancro do ovário usando vector lentiviral mediada expressão indutível. Estudos anteriores mostraram que KLF4 foi regulada negativamente em cancros do ovário e comparados com os controlos que KLF4 não afectou a proliferação celular, mas um aumento da proporção de Bcl-2 /Bax e inibiu a apoptose [19]. Em contraste, descobrimos que KLF4 inibe a proliferação das células SKOV3 na formação de colónias e os ensaios de MTT (Fig. 1A, B, e C). A discrepância pode ser causado pela baixa eficicia de transfeco em que o estudo em comparação com a nossa altamente eficiente induzível transdução lentiviral. Nós também descobrimos que KLF4 inibe a proliferação celular em células OVCAR3 (Fig. 1C). Os nossos dados demonstram que KLF4 inibe a proliferação celular, migração e invasão, portanto, funciona como um supressor de tumor em células SKOV3 e OVCAR3.

KLF4 pode ter um duplo efeito, quer como um oncogene ou um supressor de tumor no cancro da mama células de câncer [14], [16], [18], [30]. Para comparar as ações de KLF4 no cancro da mama MCF7 com que, em células de cancro do ovário, realizamos experimentos semelhantes com o mesmo lentiviral Tet-on inducible vector transduzidas em células MCF-7. Descobrimos que KLF4 inibe a proliferação de células MCF7 (Fig. S3A). A nossa descoberta é semelhante aos resultados mostrados na MCF10A células por Yori et ai. [16]. Yu et al., No entanto, mostrou que KLF4 funciona como um oncogene em células MCF7 [14], que é oposta à nossa constatação.

A morfologia em KLF4 expressando células SKOV3 na presença de Dox foi claramente alterado a partir de as células de controlo sem Dox aos diferentes pontos temporais (Fig S2C); no entanto, não foi observada alteração morfológica evidente em células OVCAR3 após a indução da expressão KLF4. Uma das razões causando esse fenômeno é que KLF4 também induziu apoptose celular em células de câncer de ovário com base em nossos dados não publicados. As diferenças morfológicas pode ser causado pelas diferentes respostas a KLF4 apoptose induzida em ambas as linhas celulares. Em ambas as células SKOV3 e OVCAR3 a célula epitelial marcador gene da E-caderina foi regulada positivamente, e a mesenquimais genes marcadores vimentina e snail2 foram reprimidos após a indução da sobreexpressão KLF4 (Fig. 4A, B). Em conjunto, esses dados sugerem que KLF4 promovido principalmente MET em células de cancro do ovário. A expressão de genes marcadores associados EMT em células de cancro do ovário são semelhantes ao que foi observado em células do cancro da mama MCF7, embora a expressão endógena de vimentina em células MCF7 não foi detectável em células que sobre-expressam KLF4 ou de controlo. Isto pode ser causado pela baixa nível de expressão endógeno da vimentina em células MCF7. Os nossos dados suportam a hipótese de que KLF4 é um regulador chave promover TEM e inibir EMT em células de cancro do ovário e da mama.

Estudos anteriores mostraram que se liga a KLF4 as regiões do promotor de E-caderina e snail2, portanto, pode activar o expressão de e-caderina ou reprimir a expressão de snail2 em fibroblastos e várias linhas celulares de cancro [18], [24], [27], [31]. A expressão do marcador de células epiteliais da E-caderina é necessário para reprogramação de células estaminais. KLF4 facilita o processo MET ativando a expressão da caderina-E [31]. Em células de cancro do ovário, foi observada uma regulação positiva dependente de KLF4 da caderina-E e uma regulação negativa da vimentina e snail2. Os nossos dados indicam que se liga KLF4 transcricionalmente para os promotores de E-caderina, conduzindo assim para a activação da expressão de E-caderina nas células de cancro do ovário.

O EMT ou MET é fortemente regulada por várias vias de sinalização. Vários estudos têm mostrado que as múltiplas vias de sinalização, incluindo WNT, Notch, NFkB, e TGF, estão envolvidos na transição EMT ou MET em cancros, [33], [34], [35] [32]. Estudos anteriores também demonstraram que o TGF-p promove EMT em células de cancro do ovário [36], [37]. No entanto, não existem estudos relacionados, descrevendo o mecanismo como KLF4 está envolvido em EMT e interage com esses percursos em células de cancro do ovário. Os nossos estudos actuais indicam que inibe KLF4 EMT induzida por TGF-p em ambas as células OVCAR3 (Fig. 6A, B) e SKOV3, sugerindo que KLF4 atenua o EMT induzida TGFp em cancros do ovário. Portanto, sinergicamente superexpressão de KLF4 e inibição de TGF via irá fornecer uma nova abordagem no desenvolvimento de novas drogas terapêuticas para o tratamento de câncer de ovário.

Em resumo, este é o primeiro relatório que mostra que as funções KLF4 como um tumor supressor através da inibição da proliferação celular, migração e invasão em células de cancro do ovário através atenuando EMT induzida por TGF.

Informações de Apoio

Figura S1.

Indução de expressão KLF4 em células de cancro do ovário usando lentiviral Tet-on vetor. A. Lentivirus Tet-on sistema de vector. transactivador reverso (rtTA-M3), foi conduzido por ubiquitina C humana (promotor UBC), e EGFP ou KLF4 foi conduzida pelo promotor induzível Dox TRE-apertada. Para induzir a expressão da EGFP ou KLF4, Dox é necessária para activar o promotor Tet após ligação ao elemento rtTA Tet-sensível na região promotora. expressões B. EGFP e KLF4 foram induzidas por Dox em células de cancro do ovário SKOV3 e detectadas através de Western blot. células C. SKOV3 com superexpressão de exibição KLF4 arredondado morfologia das células-like epitelial

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s001

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Figura S2.

Dox induzida por expressão EGFP em células SKOV3 e OVCAR3. expressões EGFP em SKOV3 (A) e células OVCAR3 (B) transduzidas com vector EGFP lentiviral foram visualizados sob microscopia de fluorescência com ou sem indução de Dox. morfologias celulares foram examinadas sob microscopia de luz. C. morfologias celulares foram fotografadas em diferentes momentos em microscopia de luz

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s002

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Figura S3.

KLF4 promove MET em células MCF-7 de cancro da mama. formação A. Colony foi realizada em células MCF-7 transduzidas com vetores lentivirais superexpressão EGFP e KLF4. O número de colónias em células que sobre-expressam KLF4 foi significativamente reduzida comparada com a dos controlos tratados com Dox (***

P

0,001). análise de mancha B. ocidental de KLF4 (**

p Art 0,01), E-caderina (**

p Art 0,01), e snail2 (*

p

0,05) em células MCF-7 com superexpressão KLF4 e EGFP com ou sem tratamento Dox

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s003

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Figura S4.

KLF4 regula negativamente TWIST1 expressão em células SKOV3 câncer de ovário. TWIST1 expressão em KLF4 expressando células SKOV3 e de controlo foi detectado pelo tempo real de RT-PCR após a indução KLF4 durante 24 horas utilizando 1 ug /ml de doxiciclina (*

P

0,05)

doi:. 10.1371 /journal.pone.0105331.s004

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texto S1.

doi: 10.1371 /journal.pone.0105331.s005

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