Abstract

Fundo

rearranjos genômicos envolvendo a família de fatores de transcrição ETS ocorrem em 40-70% dos casos de câncer de próstata. ERG e ETV1 são os membros do ETS mais comuns observados nessas alterações genéticas. A alta prevalência desses rearranjos e seu significado biológico representa um novo alvo terapêutico para o tratamento de câncer de próstata.

métodos e resultados

Recentemente, relatou o desenvolvimento de YK-4-279, um pequena molécula inibidora da EWS-FLI1 oncoproteína no Sarcoma de Ewing. Desde ERG e ETV1 pertencem à mesma classe de factores como ETS FLI1, foi testada a capacidade de YK-4-279 para inibir as funções biológicas das proteínas de ERG e ETV1 no cancro da próstata. YK-4-279 inibida ERG e ETV1 mediada por actividade de transcrição em um ensaio da luciferase. YK-4-279 também diminuiu a jusante mRNA alvo e expressão de proteína ERG e ETV1 em

ETV1

-fusion LNCaP positivo e

ERG

células VCaP positivos de fusão. YK-4-279 reduziu a motilidade das células LNCaP num ensaio de zero e o fenótipo invasivo de ambas as células LNCaP e VCaP num ensaio de invasão HUVEC. células PC3 fusão-negativos foram insensível à YK-4-279. SiRNA mediada knockdown ERG em células VCaP resultou em uma perda de capacidade de resposta de drogas. Ao mesmo tempo, a expressão do ERG transiente em células PC-3 resultou em aumento potencial invasivo, que foi reduzido por YK-4-279.

Conclusão

Estes dados demonstram que YK-4-279 inibe ERG e ETV1 atividade biológica em células de câncer de próstata de fusão-positivos que levam à diminuição da motilidade e invasão. Portanto, YK-4-279 pode ter um impacto sobre a metástase do cancro da próstata e que podem ser ainda avaliados para as suas aplicações clínicas no cancro da próstata além de sarcoma de Ewing

citação:. Rahim S, Beauchamp EM, Kong Y, Brown ML, Toretsky JA, uren A (2011) YK-4-279 Inibe ERG e ETV1 celular Mediated do cancro da próstata Invasion. PLoS ONE 6 (4): e19343. doi: 10.1371 /journal.pone.0019343

Autor: James McCubrey, East Carolina University, Estados Unidos da América

Recebido: 20 de dezembro de 2010; Aceito: 28 de março de 2011; Publicação: 29 de abril de 2011

Direitos de autor: © 2011 Rahim et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi generosamente apoiado pela concessão de Apoio P30-CA051008 Cancer Center para o uso de recursos partilhada Interação Biacore Molecular. O suporte para o trabalho também veio dos infantil Cancer Foundation (Baltimore MD), Go4theGoal, Fundação de Dani, Alex Lemonade Levante Foundation, Liddy Shriver Iniciativa Sarcoma, Scientist Award Clínica Burroughs Wellcome na Translational Research (JT), eo NIH R01CA133662 (JT) , R01CA138212 (JT), R01CA108641 (AU). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

Conflito de interesses:. Os autores leram a política da revista e tem as seguintes conflitos: Um pedido de patente tem foram arquivadas pelos autores para o composto YK-4-279. Isto não altera a adesão dos autores para todos os PLoS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

O câncer de próstata é a forma mais comum de câncer ea segunda causa mais líder do câncer mortalidade nos homens. translocações cromossómicas envolvem a família de factores de transcrição ETS estão presentes em 40-70% dos cancros da próstata, incluindo as formas clinicamente mais agressivos [1], [2], [3], [4], [5]. Estas translocações produzir genes quiméricos, que fundem a região promotora de um gene que respondem a androgénios, tais como o

TMPRSS2

, à região de codificação dos factores de ETS, mais frequentemente

ETV1

ou

ERG

[6], [7]. Estes rearranjos levar a andrógeno regulação dependente de factores de transcrição ETS e a sua sobre-expressão. ETS proteínas são proto-oncogenes que têm sido implicados na patogénese [8]. Eles controlar a expressão de genes alvo envolvidos na proliferação celular, apoptose, angiogénese e invasão. A sobre-expressão de factores ETS em células de cancro da próstata aumentar a invasão de células e induz a neoplasia intra-epitelial prostática (PIN) em modelos de ratinho transgénicos [9]. Esgotamento dos fatores ETS

in vitro

reduz a motilidade e invasão. ERG e ETV1 esgotamento também resultar em redução do crescimento tumoral

in vivo

[7]. Resultados recentes também indicam que

TMPRSS2-ERG

expressão é reativado no câncer de próstata resistente à castração [10]. Assim, as proteínas ETS representam um novo alvo para a prevenção ou tratamento da doença metastática.

recentemente relatada uma pequena molécula inibidora da proteína quimérica EWS-FLI1 no sarcoma de Ewing [11]. YK-4-279 inibe a atividade EWS-FLI1, induz a apoptose em linhas celulares de sarcoma de Ewing e retarda o crescimento do tumor em modelos de rato de xenotransplante. FLI1, ERG e ETV1 estão Classe I fatores ETS e compartilhar mais de 60% de identidade e 80% de homologia nas suas sequências de aminoácidos [12]. Devido à estreita homologia de FLI1 com ERG e ETV1, testamos a capacidade de YK-4-279 para inibir a atividade do gene ETS em linhagens de células da próstata que demonstram dependente expressão ERG e ETV1 andrógeno. Nossos resultados indicam que YK-4-279 pode inibir ERG e ETV1 dependente atividade transcricional e, consequentemente, leva a motilidade celular reduzida e invasão.

Resultados e Discussão

células VCaP e LNCaP são responsivos aos andrógenos e porto ERG e ETV1 rearranjos

próstata requer androgénios a funcionar correctamente e a capacidade de resposta de androgénio pode ser usado como uma base para o agrupamento de linhas celulares de cancro da próstata para qualquer uma de duas categorias: andrógeno-sensível e resistente androgénio. Na maioria dos casos ETS rearranjo, o gene ETS é colocado sob regulamentação direta de um promotor gene andrógeno-responsivo. Nestes casos, androgénio medeia a sobre-expressão do factor de ETS oncogénica. A fim de estudar o efeito dos inibidores ETS no cancro da próstata, foram selecionados para trabalhar com VCaP LNCaP e linhas celulares. A célula-line VCaP abriga um rearranjo TMPRSS2-ERG, que ocorre através de deleção intersticial da região Mb a 3 entre TMPRSS2 e ERG no cromossomo 21 (Fig. 1a) [6]. A linha celular de LNCaP contém uma translocação genética onde todo o locus ETV1 é inserido no último intrão da região MIPOL1 o específico da próstata no cromossoma 14 (Fig. 1a) [7]. Os rearranjos ERG e ETV1 são mutuamente exclusivos para as células LNCaP VCaP e, respectivamente, e não estão presentes na linha de células PC-3. Assim, a linha celular PC-3 foi escolhido como um controlo negativo para os nossos estudos. Nós validado que as células tanto VCaP e LNCaP de androgênio-sensível, tal como demonstrado por um aumento do antigénio específico (PSA) da próstata expressão após estimulação por o análogo de androgénio sintético R1881 (fig. 1b). células VCaP e LNCaP expressam ERG e ETV1 proteínas em condições basais, devido à presença de

ETS

rearranjos nessas células. tratamento de androgénio destas linhas celulares, mas não PC-3, resulta no aumento da ERG e ETV1 ARNm e de proteína (Fig. 1c e d). Estes resultados estabelecem que ambas as células VCaP e LNCaP são andrógeno responsivo, enquanto as células PC-3 não são. Andrógeno capacidade de resposta das células VCaP e LNCaP traduz em ETV1 reforçada e expressão ERG devido ao câncer de próstata rearranjos cromossômicos específicos.

a) foram analisadas as células da próstata para o status ETS rearranjo através da realização de PCR utilizando o iniciador específico rearranjo. células VCaP abrigar o rearranjo TMPRSS-ERG enquanto que as células LNCaP conter ETV1 reorganizados. células VCaP e LNCaP expressam ERG e proteína ETV1, respectivamente, em condições basais. As células PC-3 não contêm qualquer rearranjo e não expressam ERG ou ETV1. b) células da CV e LNCaP expressam PSA em resposta ao tratamento R1881. As células PC-3 não são andrógeno responsivo. As células foram tratadas com 10 nM de R1881 durante 48 horas e a expressão do PSA foi analisada por qPCR em tempo real. Os resultados foram normalizados para a actina. *; p 0,0001, N.S .; não-significativa. c) estimulação R1881 resulta num aumento de ARNm ERG e ETV1 em células LNCaP VCaP e, respectivamente, mas não em células PC3. O ARN foi isolado a partir de células estimuladas de androgénio e usado para realizar em tempo real qPCR. Os dados foram normalizados para o nível de expressão do gene na ausência de androgénio. d) proteínas ERG e ETV1 são expressos em células LNCaP VCaP e, respectivamente, mas não em células PC-3. estimulação androgênica resultou em aumento da proteína ERG e ETV1 em células VCaP e LNCaP. células da próstata não expressar a proteína FLI1 sob basal ou andrógeno estimulada condições. MOLT4 foi usada como uma linha celular de controlo positivo para a expressão FLI1.

YK-4-279 inibe ERG e ETV1 atividade transcricional

YK-4-279 tem como alvo o EWS-FLI1 oncoproteína no Sarcoma de Ewing [11]. No entanto, o local de interacção com EWS-FLI1 é desconhecido. Considerando a estreita homologia entre FLI1, ERG e ETV1, nós investigamos os efeitos da YK-4-279 em função de ERG e ETV1. O primeiro avaliou a expressão de FLI1 em células da próstata. A linha celular linfoblástica aguda humana leucemia MOLT4 foi utilizado como um controlo para a expressão FLI1, sob condições basais. Nenhuma das células da próstata utilizados neste estudo expressam FLI1 (Fig. 1d). Assim, os efeitos de YK-4-279 em células da próstata não iria ocorrer como resultado de segmentação FLI1. A seguir, validou a interacção directa entre YK-4-279 e ERG recombinante e proteínas ETV1 utilizando ressonância de plasma de superfície (SPR). YK-4-279 ligado a ERG com uma afinidade (K

D) de 11,7 uM e ligado a ETV1 com uma afinidade de 17,4 pM (Fig. 2a, S1). Foram avaliados YK-4-279 para efeitos sobre a actividade de transcrição do ERG utilizando um fragmento de 207 pb transientemente transfectadas do promotor do gene Id2 que dirige a expressão da proteína da luciferase. Esta região promotora mínima Id2 contém dois locais de ETS e tem sido mostrado previamente para ligar ERG [13]. A co-transfecção de ERG e Id2 repórter resultou num aumento da actividade da luciferase. A actividade do promotor foi reduzido por tratamento simultâneo das células com YK-4-279, sem qualquer redução apreciável no teor de proteínas ERG (Fig. 2b).

a) Cinética de ligação de YK-4-279 e a do ERG ETV1 foi determinado por ressonância de plasma de superfície. YK-4-279 obrigado a ERG e ETV1 com um K

D de 11,7 mM e 17,9 mM respectivamente. sensorgramas SPR são fornecidos nas Figuras complementares (Fig. S1). b) Um ensaio de luciferase foi realizada em células COS-7 co-transfectadas com uma construção de ERG e repórter de luciferase Id-2. a actividade do promotor Id-2 foi reduzida após tratamento YK-4-279 sem afectar os níveis de proteína ERG. *; p 0,001. c) células VCaP foram tratadas com 50 nM siERG ou 10 mM YK-4-279 por 48 horas e mRNA e os níveis de metas ERG expressão de proteínas foram avaliados. YK-4-279 tratamento resultou em diminuição da expressão de PLAU, ADAM19 e mRNA PLAT. Os níveis de proteína plau e PLAT foram também diminuiu. Os resultados foram comparáveis ​​aos obtidos por siRNA mediada knockdown ERG. d) as células LNCaP foram expostas a níveis de genes alvo de 1 uM YK-4-279 e ETV1 foram avaliados. YK-4-279 tratamento resultou na diminuição da expressão do gene de MMP13, sem redução significativa nos níveis de ETV1. *; p . 0,01

Em seguida, foram avaliados os efeitos de YK-4-279 na expressão de genes alvo endógenas ERG e ETV1 em VCaP e LNCaP linhas celulares. Estamos focados em vários membros da via de ativador do plasminogênio como PLAU, PLAT, MMP13 e ADAM19. Estes genes mediar um fenótipo invasivo em vários tipos de câncer e têm sido relatados como alvos diretos de fatores de transcrição ETS [9], [14], [15]. A exposição das células a 10 uM VCaP YK-4-279 durante 48 horas resultou em reduzida significativamente os níveis de proteína e ARNm de vários genes alvo tais como o ERG, PLAU, Mapa e ADAM29. O nível de regulação negativa foi comparável ao obtido por siRNA mediada ERG knock-down em células VCaP (Fig. 2c). Da mesma forma, YK-4-279 resultou na sub-regulação de ETV1 gene alvo MMP-13 em células LNCaP (Fig. 2d). Deve notar-se que esta inibição da actividade da proteína do ERG e ETV1 foi obtido sem qualquer diminuição significativa nos níveis de proteína ERG ou ETV1. Estes resultados sugerem que YK-4-279 é capaz de inibir ERG e ETV1 actividade de transcrição em células de cancro da próstata, o que leva a uma diminuição da expressão de genes que estão envolvidos na degradação da matriz extracelular e metástase

YK-4-. 279 inibe a ETS mediada invasão de células de câncer de próstata

estudos anteriores sugeriram que

rearranjos ETS

genes medeiam a invasão no câncer de próstata [7], [9]. Para abordar a questão de saber se YK-4-279 é capaz de inibir ERG e ETV1 invasão mediada, utilizamos uma impedância ensaio de invasão de células endoteliais com base [16]. Esta técnica envolve a desafiar uma monocamada confluente de células endoteliais da veia umbilical humanas (HUVECs) com uma segunda camada de células metastáticas que se ligam a, e invadir a monocamada de HUVEC. A retracção das junções de células endoteliais e a invasão de células de cancro da próstata pode ser monitorado em tempo real através da medição da diminuição da resistência eléctrica dos eléctrodos de ouro [17].

Um ensaio de citotoxicidade foi realizado para determinar a dose máxima tolerável de YK-4-279 em diferentes linhas celulares de cancro da próstata. YK-4-279 não mostrou qualquer redução significativa no crescimento celular a 1 M para células de LNCaP e 10 uM para células PC3 VCaP e após 2 dias de tratamento (dados não mostrados). foram seleccionados para estas doses mais ensaios funcionais, a fim de assegurar que os efeitos inibitórios de YK-4-279 na invasão e motilidade, não são, como resultado da morte celular. Quando as células HUVEC foram desafiados com células LNCaP e VCaP, que levou a uma diminuição acentuada das elétrico-resistência indicativo de invasão celular. Tratando estas células com YK-4-279 resultou no diminuiu significativamente a invasão de células HUVEC por células LNCaP e VCaP. O composto sozinho não teve efeito sobre a monocamada de células HUVEC. YK-4-279 não inibiu a invasão por

células ETS

-fusion negativo PC-3. (Fig. 3a e b). Para garantir que os efeitos observados foram devido à inibição de proteínas ETS, reduzimos a expressão da proteína ERG em células VCaP usando siRNA. Isto resultou na revogação da YK-4-279 inibição mediada de invasão (Fig. 3c). A seguir, expressa transientemente ERG em células PC-3 e ensaiadas estas células no ensaio de invasão de células endoteliais. expressão do ERG sozinho em células PC-3 transmitidas sobre essas células um fenótipo mais invasiva. O tratamento com YK-4-279 inibiu significativamente o aumento mediado ERG em invasão (Fig. 3d). Juntos, estes resultados sugerem que YK-4-279 é capaz de inibir a invasão de ETS mediada por células de cancro da próstata, tanto nas células com elevada expressão endógena e exógena de proteínas ETS.

a) células HUVEC confluentes formando um monocamada foram desafiados com LNCaP, VCaP e PC-3 células com ou sem YK-4-279. YK-4-279 VCaP inibida (10 uM) e LNCaP (1 uM) a invasão de células de células HUVEC, enquanto que as células PC-3 não foram afectados. células da próstata foram pré-tratados com YK-4-279. As experiências foram realizadas em duplicado e resistência foi normalizada para o momento da adição de células invasoras. b) A invasão foi quantificada em 10 horas após a adição de células cancerosas da próstata. Os resultados são expressos em relação às condições de não-tratados. *; p 0,01. c) expressão de ERG foi reduzida em células de capnografia, utilizando uma sonda de siRNA C-terminal. ERG knockdown em células VCaP resultou em uma perda de YK-4-279 inibição mediada da invasão. VCaP células foram pré-tratadas com 10? M YK-4-279 durante 2 dias antes de um desafio a monocamada de HUVEC. *; p 0,01, d) A expressão transiente do ERG em células PC-3 transmitidas sobre as células de um fenótipo mais invasiva. Subsequentemente, YK-4-279 tratamento resultou numa diminuição da invasão. PC-3 células foram tratadas com YK-4-279 por 24 h antes de desafiar a monocamada HUVEC.

YK-4-279 inibe a motilidade ETV1 mediada em células LNCaP

A seguir , testámos os efeitos de YK-4-279 sobre a inibição da motilidade de células LNCaP num ensaio de zero. Todas as experiências em figuras anteriores foram realizados com células LNCaP passagem baixa (p 30). No entanto, as células LNCaP de baixa passagem não eram favoráveis ​​a esta técnica como eles vagamente anexar a superfície prato the-cultura de células. Do mesmo modo, as células VCaP crescer em aglomerados e não formam uma monocamada confluente. Portanto, realizamos ensaios de zero usando células LNCaP alta de passagem (p 60). células LNCaP de alta passagem crescer a uma taxa muito mais rápida e são capazes de formar uma monocamada confluente [18]. Eles também expressam altos níveis basais de ETV1 (Fig. 4a) [19]. Antes de realizar o ensaio de zero, YK-4-279 foi testado quanto à sua natureza citostático e verificou-se ter nenhum efeito sobre a proliferação de células-em concentrações utilizadas para o ensaio de zero (Fig. S2). YK-4-279 tratamento de células LNCaP resultou numa diminuição significativa na motilidade celular no ensaio de zero, enquanto que não foram observados efeitos sobre a motilidade da linha celular de controlo negativo, o PC-3 (Fig. 4b). O ensaio zero também foi realizada com pré-tratamento de células LNCaP com 10 ug /ml de mitomicina C, durante 2 horas antes de riscar a superfície. YK-4-279 foi capaz de inibir a motilidade celular LNCaP em mitomicina condições tratadas, bem como (Fig. S3) Estes resultados sugerem que os efeitos da YK-4-279 em células LNCaP em ensaio de zero não é devido à citotoxicidade, mas apenas devido a inibição da motilidade celular.

a) células LNCaP de alta passagem foram analisadas para os níveis de expressão ETV1. células HP-LNCaP constitutivamente expressam quantidades mais elevadas de ETV1, em comparação com as células PC-3. b) YK-4-279 motilidade inibidas em um ensaio de zero em células LNCaP de alta passagem, enquanto que as células PC-3 foram indiferente. motilidade celular foi quantificada através da medição da distância entre os limites das células que migram. A motilidade foi expressa em relação às condições tratados com veículo. *; p . 0,0001

O EWS-FLI1 oncoproteína é dependente de ligação a RNA Helicase A (RHA) para a sua função oncogénica [20]. YK-4-279 induz a apoptose em células do sarcoma de Ewing, bloqueando a interacção entre EWS-FLI1 e RHA. Como um possível mecanismo para a actividade de YK-4-279 no cancro da próstata, testámos se a interacção entre um membro da família ETS e RHA está presente em células da próstata bem. Enquanto ERG não interagir com RHA em células de câncer de próstata, YK-4-279 é incapaz de bloquear esta interacção (Fig. S4). Também testámos se YK-4-279 é capaz de bloquear o ERG ou ETV1 ligação aos locais ETS no ADN, utilizando ressonância plasmónica de superfície. YK-4-279 não inibiu ADN ERG ou ETV1 de ligação (Fig. S5a). Além disso, a imunoprecipitação da cromatina foi realizada para avaliar a ligação a ERG promotor PLAU na presença de YK-4-279. Os resultados confirmaram as conclusões Biacore que YK-4-279 não interferem com a ligação DNA ERG (Fig S5b). Deve notar-se que as células de Ewing expressar uma proteína FLI1 truncada contendo apenas os exons 6-9 de FLI1. translocações ETS no cancro da próstata, por outro lado, resultar na expressão de um membro de comprimento completo quase família ETS. Portanto, a hipótese de que YK-4-279 pode inibir ETV1 e função ERG em células de câncer de próstata, impedindo interações proteína-proteína que são diferentes parceiros EWS-FLI1 no sarcoma de Ewing. Por isso, mais estudos são necessários para determinar o mecanismo molecular exato da inibição YK-4-279 mediada pelo ERG e função ETV1 em células de câncer de próstata.

O resultado da inibição ETV1 parece ser mais potente do que a inibição ERG, em termos de células-motilidade e invasão. No entanto, este fenómeno não pode ser definitivamente atribuídas a melhor inibição ETV1, como uma comparação válida dos dados é complicada pelo facto de ERG e ETV1 são expressos em diferentes linhas celulares. Assim, a qualidade da resposta também pode ser um factor de diferenças entre as células LNCaP e VCaP. Experiências adicionais, tais como a medição da magnitude da resposta ERG e ETV1 na mesma linha celular, seria necessário para tratar de forma conclusiva deste ponto.

relatórios recentes sugeriram que o ETS knock-down em células de cancro da próstata pode resultar na proliferação diminuída em células que expressam estas oncoproteínas [21], [22]. Embora as experiências neste manuscrito foram realizados a doses e os intervalos de tempo que não foram tóxicas para as células, não parece haver uma correlação directa entre a expressão de proteínas e ETS YK-4-279 citotoxicidade. ETS-rearranjo PC-3 negativo e células DU-145 mostram resposta mínima ao tratamento YK-4-279 (IC50 100? M). Pelo contrário, YK-4-279 é mais tóxico para ambos VCaP (CI50 = 9,55 ^ M após 72 h) e células LNCaP (2,75 uM) após 72 h. Assim, YK-4-279 também pode ser avaliada por seus potenciais citotóxicos em células cancerosas da próstata positivas ETS-rearranjo em estudos futuros.

O dependente sobre-expressão da proteína ERG e ETV1 em células de câncer de próstata andrógeno foi implicada directamente a um aumento da invasão e metástase. Além disso, vários estudos têm correlacionado o aumento da expressão dessas proteínas com mau prognóstico, escores de Gleason maiores e uma menor incidência de sobrevida livre de recorrência. Atualmente, andrógenos vias de sinalização dependentes no câncer de próstata são direcionados através de antagonistas de castração e do receptor de andrógeno. Os efeitos desses tratamentos pode ser atribuída em parte à infra-regulação dos factores de ETS rearranjados. Assim, o êxito do desenvolvimento de inibidores de moléculas pequenas de ERG e ETV1, tais como YK-4-279, representará uma linha nova de agentes terapêuticos destinados a prevenir ou tratar a doença metastática, poupando pacientes os efeitos a longo prazo de terapias orientadas para o androgénio pathway.

Materiais e Métodos

Cultura de células

VCaP, LNCaP, PC-3 e DU-145 células foram obtidas de ATCC (American Type Culture Collection, Manassas, VA ). As HUVECs foram obtidos a partir de Lonza Biosciences (Allendale, NJ). VCaP células foram mantidas em meio DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino. LNCaP, PC-3 e células de DU-145 foram mantidas em meio RPMI suplementado com 10% de FBS e 1% de HEPES. As células HUVEC foram cultivadas em EBM-2 media (Lonza) suplementado com kit EGM-2 bala (Lonza) contendo fatores de crescimento, antibióticos e 5% FBS.

Western-borra

lisados ​​de proteína foram preparados e western-blots realizados como previamente descrito [23]. ERG (SC-354), ETV1 (sc-1953) FLI1 (SC-356), Mapa (sc-5241) e actina (sc-1615) Os anticorpos foram adquiridos a partir de Santa Cruz Biotechnology Inc. (Santa Cruz, CA). O anticorpo anti-PLAU foi adquirido de Calbiochem (Gibbstown, NJ).

isolamento de ARNm e qPCR

O ARNm foi isolado utilizando TRIzol (Invitrogen, Carlsbad, CA) e o ADNc foi preparado utilizando transcriptor primeiro- Strand kit de síntese de cDNA (Roche, San Francisco, CA) de acordo com o protocolo do fabricante. qRT-PCR foi realizada utilizando SYBR Green (Roche) numa realplex

4 instrumento Mastercycler (Eppendorf, Nova Iorque, Nova Iorque). A expressão de genes foi normalizada para a actina. Os pares de iniciadores estão listados na Tabela Suplementar S1.

Rearranjo estado

O ADN genómico foi isolado a partir de PC-3, LNCaP e VCaP células utilizando o kit de extracção de ADN genómico Wizard (Promega, Madison, WI) de acordo para os protocolos do fabricante. A PCR foi realizada utilizando iniciadores que flanqueiam locais de rearranjo. As sequências dos iniciadores podem ser encontrados em Suplementar Tabela S1.

Ligação Cinética

afinidades de ligação no estado estacionário foram medidos num instrumento Biacore T100. proteínas ETV1 (Origene, Rockville, MD) e recombinante ERG foram imobilizadas em chips CM5 por acoplamento de amina e 6 diferentes concentrações de YK-4-279 foram injectadas sobre a superfície em duplicado. sensorgramas SPR e K

D valores foram obtidos utilizando o software Biacore T100.

Luciferase Assay

células COS-7 foram co-transfectadas com um plasmídeo lentiviral expressando o mais comumente encontrados truncado-ERG mRNA, e um vector contendo o promotor do gene Id2 expressão de um gene de luciferase de condução. A transfecção foi realizada utilizando Fugene 6 (Roche) de acordo com os protocolos do fabricante. Um vector lentiviral expressando LacZ foi utilizada como um controlo negativo. As células foram deixadas para expressar ERG durante 48 horas e, subsequentemente, elas foram tratadas com 10? M YK-4-279. A actividade de luciferase foi medida após 24 h usando um kit de ensaio de luciferase duplo de acordo com o protocolo do fabricante (Promega, Madison, WI). Os resultados foram normalizados para a concentração de proteína total. A análise estatística foi realizada utilizando GraphPad Prism 4.0.

andrógeno e YK-4-279 tratamento

Para o tratamento de andrógeno, as células foram semeadas em meios de comunicação livres de fenol-vermelha contendo 10% de FBS despojado carvão e permitidos para anexar ao dia para o outro prato de cultura de células. Subsequentemente, as células foram privadas de soro durante 48 horas em meio isento de vermelho de fenol e, em seguida estimuladas com 10 nM R1881 (Sigma, St-Louis, MO) durante 2 dias.

YK-4-279 foi dissolvido em DMSO para preparar estoque de 10 mM. Logaritmicamente crescentes células foram tratadas com 1? M ou 10? M YK-4-279 durante 48 horas antes da avaliação para a expressão do gene.

siARN ERG knockdown

transientes ERG knockdown foi realizada utilizando um siRNA costume (5′-CGACATCCTTCTCTCACAT-3 ‘) dirigido contra o terminal C do ERG (Dharmacon, Lafayette, CO) [21]. 50 nM de ARNsi foi transfectadas utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com os protocolos do fabricante. As células foram analisadas por ERG knockdown cinco dias após a transfecção com siARN.

transientes ERG Expressão

PC-3 foram transfectadas com um plasmídeo pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen) que expressa o mais comumente- encontrado truncado ERG isoforma. A transfecção foi realizada utilizando Fugene 6 reagente (Roche) de acordo com os protocolos do fabricante durante 48 horas.

HUVEC Invasão

O potencial anti-invasiva de YK-4-279 foi medida usando o técnica de detecção elétrica de impedância da célula (ECIS) em ECIS Z instrumento (Biofísica Aplicada, Troy, NY) e sistema de xCELLigence (Roche). Resumidamente, 250.000 células HUVEC foram semeadas em 8W10E + matrizes com circuito de eletrodo no fundo bem para medir resistência elétrica. Após a formação de uma monocamada confluente de HUVEC (aprox. 21-24 horas), as células de cancro da próstata invasores foram adicionados a uma densidade de 100.000 células por poço em meio DMEM ou RPMI contendo as concentrações de droga indicadas. As células tumorais foram pré-tratados durante 24-48 horas com YK-4-279 antes da adição. Este ponto de tempo da adição de células tumorais foi aceito como 0 h de tratamento e invasão foi monitorizada durante as 12 horas seguintes, medindo mudanças na resistência na interfase de células-eletrodo. Os experimentos foram realizados em duplicado. Resistência foi normalizado em tempos de adição de células invasoras.

Risco Ensaio

As células foram cultivadas e permissão para formar um confluente de mono-camada. A superfície celular foi riscado utilizando uma ponta de pipeta P-200. As células foram deixadas para preencher a área riscada e monitorizados ao longo de 72 horas. As imagens foram tiradas utilizando um microscópio Nikon Eclipse Ti (Nikon, Melville, NY). motilidade celular foi quantificada através da medição da distância entre os limites das células que migram.

imunoprecipitação da cromatina (ChIP)

células PC-3 foram transfectadas com um plasmídeo pLenti6 /V5-DEST (Invitrogen) que expressa o mais comumente encontrados truncada isoforma ERG. A transfecção foi realizada utilizando Fugene 6 reagente (Roche) de acordo com os protocolos do fabricante durante 24 horas. As células foram então tratadas durante 6 horas com 10? M ou veículo YK-4-279. Chip foi realizada utilizando EZMagna Proteína Kit de um chip da Millipore de acordo com as instruções do fabricante. A imunoprecipitação foi realizada utilizando 2 ug de anticorpo ERG (SC- 354x, Santa Cruz Biotechnology), 2 ug IgG de coelho normal (Sigma Aldrich) e 1 ug de pol II (Millipore). A PCR foi realizada utilizando iniciadores publicados anteriormente por ERG positivo de ligação ao promotor PLAU em células da próstata [9]. Um perfil de PCR de 94 ° C-5 min: 1 ciclo, 94 ° C-30 s, 55 ° C-30 s, 72 ° C-1 min: 35 ciclos, 72 ° C-5 min: 1 ciclo foi utilizado em um termociclador Eppendorf Realplex4

Análise estatística

Os grupos foram comparados pelo teste t de Student bicaudal (Prism 4, GraphPad Software, La Jolla, CA) e p . 0,05 foi considerado significativo .

Informações de Apoio

Figura S1.

sensogramas SPR para YK-4-279 ligação a ERG e ETV1. afinidades de ligação no estado estacionário foram medidos através da injecção de 6 diferentes concentrações de YK-4-279 sobre proteínas ERG e ETV1 recombinantes imobilizados sobre a superfície de chips CM5 num instrumento Biacore T100. sensogramas SPR foram obtidos utilizando software Biacore T100

doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s001

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Figura S2.

YK-4-279 não é um agente citostático. VCaP (10000 células /cavidade), LNCaP de alta passagem (10000 células /cavidade), LNCaP de baixa passagem (10000 células /poço) e PC-3 (5.000 células /poço) as células foram semeadas durante a noite em xCELLigence E-16 placas e deixadas aderir ao bem-inferior. O bem-inferior xCELLigence E-16 placas é coberta com ouro-eléctrodos miniatura que medem alterações na resistência eléctrica sobre a superfície dos eléctrodos. As alterações na resistência eléctrica são representados como um parâmetro adimensional denominado célula-índice, e é directamente proporcional à área de poços de fundo coberta por eléctrodos. Aproximadamente 20 horas após a sementeira de células de cancro da próstata, o meio de cultura foi substituído com meio fresco contendo 1 uM (LNCaP, PC-3) ou 10 (iM) VCaP YK-4-279. A proliferação celular foi monitorada durante 72 horas

doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s002

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Figura S3.

YK-4-279 inibe a motilidade celular LNCaP. As células foram colocadas em placas e deixou-se formar um mono-camada confluente. As células foram tratadas com 10 ug /mL de mitomicina-C durante 2 horas antes do ensaio zero, como descrito anteriormente [24], [25]. Depois do tratamento de mitomicina-C, foi adicionado meio fresco e superfície celular foi riscado utilizando uma ponta de pipeta P-200. As células foram deixadas para preencher a área riscada e monitorizados ao longo de 60 horas. motilidade celular foi quantificada pela medição da área de zero não coberto com a migração de células .. A motilidade foi expressa em relação às condições tratados com veículo. *; p 0,0001

doi: 10.1371 /journal.pone.0019343.s003

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Figura S4.

ERG interage com RHA em células VCaP. O YK-4-279 não bloquear a interação entre ERG e RHA. 9 × 10

7 células VCaP foram semeadas em 15 cm pratos e deixadas a ligar e se espalhou por 48 horas. As células foram tratadas com 10? M YK-4-279 durante 24 h. Imunoprecipitação foi realizada como descrito anteriormente [11]

doi:. 10.1371 /journal.pone.0019343.s004

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Figura S5. O

YK-4-279 não inibe ERG ou ETV1 ligação ao DNA. a) proteínas recombinantes ERG ou ETV1 foram imobilizados sobre a superfície de um chip de Biacore CM5 por acoplamento de amina. De tipo selvagem, os oligonucleótidos de cadeia dupla (ATGTAGACCGGAAGTAACTA) contendo o consenso de ligação Ets local “GGAA” foram injectados em 5 uM triplicado sobre a superfície do chip na presença ou na ausência de 50 uM YK-4-279.