Abstract

Nós apresentamos os resultados de um estudo global sobre miRNAs desregulados em amostras pareadas de mucosa normal e tumor de oito pacientes com cancro colo-rectal. Embora não haja dados existentes da contribuição miRNA para tumorigênese colorretal, estes estudos são tipicamente pequenos com estudos de médio porte de linhas celulares ou amostras de tumores não-emparelhados. O presente estudo é o nosso conhecimento único em dois aspectos. Em primeiro lugar, as amostras de tecido tumoral normais e adjacentes estão emparelhados, tomando em consideração as diferenças de base entre indivíduos para testar a expressão diferencial. Em segundo lugar, nós usamos seqüenciamento de alto rendimento, permitindo assim um levantamento exaustivo de todos os miRNAs expressos nos tecidos. Nós usamos a tecnologia de seqüenciamento Illumina para executar sequenciamento e duas ferramentas diferentes para estatísticamente teste para diferenças nas contagens de leitura por gene entre as amostras: edger ao usar as informações par e DESeq quando ignorar esta informação, isto é, tratando os grupos independentes de tumor e amostras normais. Identificamos 37 miRNAs que são significativamente desregulados em ambas as abordagens estatísticas, 19 sub-regulada e 18-regulada. Alguns destes miRNAs são publicados anteriormente como potenciais reguladores em adenocarcinomas colorretais como miR-1, miR-96 e miR-145. Nossa pesquisa abrangente de miRNAs diferencialmente expressos confirma, assim, alguns resultados já existentes. Também descobrimos 16 miRNAs desregulados, que a nosso conhecimento não tenham sido previamente associadas a carcinogênese colorretal: As seguintes significativamente regulada miR-490-3p, -628-3p /-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p, -3656 eo up-regulada miR-105, -549, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p, -4326. Embora o estudo é preliminar com apenas oito pacientes incluídos, acreditamos que os resultados contribuem para o conhecimento actual sobre miRNA desregulação na carcinogênese colorretal. Como tal, os resultados serviriam como um treinamento conjunto robusto para validação de potenciais biomarcadores em um estudo de coorte maior. Finalmente, também apresentam dados apoiando a hipótese de que existem diferenças na expressão de miRNA entre adenocarcinomas e tumores neuroendócrinos do cólon

Citation:. Hamfjord J, Stangeland AM, Hughes T, Skrede ML, Tveit KM, Ikdahl T , et ai. (2012) a expressão diferencial de miRNAs em câncer colorretal: Comparação de Emparelhados tecido tumoral e normal adjacente Mucosa Usando Alto Throughput Sequencing. PLoS ONE 7 (4): e34150. doi: 10.1371 /journal.pone.0034150

editor: William C. S. Cho, a rainha Elizabeth Hospital, Hong Kong

Recebido: 06 de setembro de 2011; Aceito: 23 de fevereiro de 2012; Publicação: 17 de abril de 2012

Direitos de autor: © 2012 Hamfjord et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. O financiamento externo recebeu de “buracos Ivar, Ragna og Morten Legat til fremme av kreftforskningen i Norge” (Ivar, Ragna e Fundação ‘Morten furos para servir a investigação do cancro na Noruega). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) é um dos cancros mais frequentes em todo o mundo [1]. O prognóstico depende estágio do tumor no momento do diagnóstico. Há elevado enfoque descoberta e validação de marcadores de detecção precoce, bem como de fatores preditivos e prognósticos como revisto por Asghar

et al

. [2]. A gênese molecular de CRC está entre os melhores descrito de todos os cânceres humanos. O modelo Vogelstein [3] tem ao longo dos anos foi modificado e ampliado, como exemplificado por Slaby

et al

. [4].

Os microRNAs (Mirs) são pequenas moléculas de RNA não-codificantes 18-25 nucleótidos de comprimento, descoberto pela primeira vez no início de 1990 em

C. elegans

[5]. Eles manter a homeostase, alterando a expressão de genes em diferentes processos celulares, tais como a diferenciação, a proliferação, a sobrevivência e a apoptose [6]. Estima-se que mais de 10% de todos os genes humanos que codificam para proteínas podem ser reguladas por estes mecanismos de [7]. O último número de miRs humanos registrados no miRBase excede mil [8], eo aumento do uso de sequenciamento de alto rendimento está impulsionando ainda mais a descoberta. Estudos mostraram também que podem ser desreguladas miRs em diferentes cancros humanos, e, consequentemente, actuam como supressores de tumores ou oncogenes [9], [10]. Estas moléculas são interessantes, uma vez que podem ser potenciais biomarcadores de diagnóstico ou prognóstico e agir como alvos potenciais na terapia específica por câncer como revisto por Cho

et al

. [11], [12]. O objetivo final seria medicina personalizada com cancro redes genótipo-fenótipo como o roteiro para as decisões clínicas [13].

Muitos estudos têm-se centrado sobre a expressão de miR profiling no cancro colorectal. A maior parte destes estudos foram analisados ​​um pequeno número de miRs utilizando em tempo real da reacção em cadeia da polimerase (PCR) ou a tecnologia de hibridação baseada, em parte, a partir de linhas celulares ou tecidos de doentes não emparelhados [14], [15], [16], [17 ], [18]. Apenas alguns estudos sequenciaram mais globalmente miRs em uma escala maior para o perfil de expressão, como o estudo sobre o melanoma [19] e colorectal [20] microRNAome. Este último estudo foi o único no seu género e apresentou um conjunto de novos miRs putativos usando uma abordagem experimental chamado Mirage. No entanto, como este estudo remonta há vários anos, apenas um subconjunto de miRs maduros conhecido hoje foi ativamente investigados.

expressão global de miRs tem sido tradicionalmente avaliada utilizando tecnologias de matriz de hibridação com base. Estas matrizes são baseados em hibridação específica de sequência após marcação com um corante fluorescente. A intensidade de fluorescência é registada e reflecte a expressão de um dado gene. Ao utilizar múltiplos corantes, a diferença na fluorescência pode ser utilizado como um índice da expressão do gene. -Sequenciação de alto rendimento, por outro lado, utiliza transcritos a partir da amostra como molde. A sequenciação directa é então realizada com uma série de reacções que utilizam nucleótidos terminadores fluoróforo. Sequência leituras são então mapeados para trás para o genoma de referência ou de uma base de dados de transcritos e o número de sequência lê mapeamento de volta para a transcrição específica é uma medida da expressão do gene. No caso geral de ARNm, esta contagem tem de ser normalizado para o comprimento do transcrito e o número total de leituras gerado pela amostra. No caso de miR, a normalização para o comprimento de transcrição não é necessário que a lê cobrir o comprimento total do transcrito. A expressão diferencial é então medida pela diferença nas contagens normalizadas para um determinado gene. Uma publicação recente compara expressão gênica diferencial em

D. pseudoobscura

quando se utiliza tecnologia de matriz e sequenciamento de alto rendimento. A maioria dos níveis de expressão são semelhantes entre os métodos com um desempenho comparável [21]. Um estudo semelhante sobre

S. cerevisiae

tem mostrado que os métodos concorda razoavelmente bem para os genes com níveis médios de expressão, mas correlação é muito baixa para os genes, quer com os níveis de expressão baixos ou altos. Isto é em parte devido à muito maior gama dinâmica para a quantificação da expressão de genes fornecida pelo método de sequenciação de elevado rendimento [22]. sequenciamento de alto rendimento é ainda considerado superior ao lidar com a estrutura e dinâmica do transcriptoma. Exemplos deste incluem a expressão de sequências desconhecidas alvo, edição de ARN eventos e outras variações da sequência de ARN, tal como os polimorfismos [21], [22], [23].

Uma vez que estas características de sequenciação de alto rendimento que sugerem é um excelente método para pesquisas globais de pequenos RNAs, que incluiu oito pacientes com câncer colorretal submetidos à ressecção cirúrgica do cólon para estudar alterações específicas do tumor na expressão de miR usando tecnologia de sequenciamento de alto rendimento Illumina. Tecidos de mucosa normal e tumor foram coletados de espécimes cirúrgicos para todos os pacientes, portanto, produzindo um conjunto único de amostras pareadas. A nossa análise dos conjuntos de dados de sequências que produzidos a partir destas amostras permite-nos identificar miRs que não tenham sido previamente associadas com adenocarcinomas colorrectais. Também identificaram diferenças na expressão de miR entre adenocarcinomas e um tumor neuroendócrino do cólon. Os resultados contribuíram para o conhecimento actual sobre miR desregulação na carcinogênese colorretal.

Resultados

Oito pacientes foram selecionados aleatoriamente de acordo com as especificações de gênero (sexo masculino apenas) de uma coorte de cancro colorrectal. O ARN total a partir de tecido tumoral e normal adjacente mucosa foi extraída. Na análise preliminar da expressão diferencial entre o tumor e na mucosa normal adjacente, um par demonstrou um padrão de expressão diferente do resto dos pares. Histopatologia foi avaliada por um patologista (Tabela 1), e era evidente que um paciente foi erroneamente classificada e abrigou um tumor neuroendócrino atípica (NET), enquanto que o resto eram adenocarcinomas. Todas as análises estatísticas tratado o paciente com a NET como um caso separado dos demais pacientes. As percentagens de células tumorais e também componentes do estroma foram estimados em hematoxilina e eosina secções coradas do tumor primário, que mostra que sete de oito amostras abrigava mais de 60% de células do tumor (Tabela 1).

O 16 As amostras foram sequenciadas com sucesso usando Illumina Genome Analyzer II (Ilumina, CA, EUA) e processados ​​utilizando miRanalyzer [24] com uma média de 562 miRs maduros mapeados para miRBase por experiência de sequenciação de nucleótidos quando permitir um desfasamento (Figura 1B). Aproximadamente 80% do sequenciamento lê mapeado para amadurecer miRs humanos na miRBase (versão 16), em dezessete de dezoito anos de sequenciamento é executado, os restantes lê principalmente mapear para outras partes do transcriptoma. Na última amostra (tecido normal N7), houve uma percentagem muito menor de leituras que mapeiam para miRBase (37,2% do total lê) (Figura 1A). Isto pode ser devido a problemas técnicos durante a preparação da amostra. Além disso, algumas centenas romance putativo miR sequências de genes e loci no genoma de referência (HSA hg18) foram preditos a partir do sequenciamento é executado. Estas sequências putativas equivaleria a uma pequena fração do número total lidos (dados não mostrados).

Painel A com percentual de sequenciamento lê mapeado para amadurecer miRs (preto) do total de leituras por experimento. Painel B com o número de miRs maduros identificados por experiência de sequenciação. O número total de miRs humanos maduros em miRBase liberar 16 (n = 1212) é incluído como referência.

A expressão diferencial (DE) de miRs identificados de miRBase foi calculado usando duas ferramentas de bioinformática, DESeq [25 ] e edger [26]. Edger implementa a funcionalidade para executar ambos os testes emparelhados e não emparelhados (a informação par é ignorada e normal e amostras de tumores são tratados como grupos independentes), enquanto DESeq não pode realizar testes emparelhados, mas beneficia de refinamentos estatísticos adicionais em relação ao aparador. Tratar as amostras normais e tumorais como dois grupos independentes está teoricamente previsto para ser o teste mais conservador uma vez que, ao contrário do teste emparelhado, ele não tem em conta as diferenças de linha de base entre os pacientes. Ao usar ambos os métodos, temos dois conjuntos de miRs significativamente diferencialmente expressos. A intersecção entre estes dois conjuntos é uma previsão muito conservadora dos miRs significativamente desregulados. Além disso, fomos capazes de observar em que medida o teste não pareado é mais conservadora do que o combinado. Em primeiro lugar a mudança de dobragem de miRs conhecidos foi analisado entre os grupos de adenocarcinoma (n = 7) e de mucosa normal (n = 8), subsequentemente entre o caso neuroendócrino (n = 1) e de mucosa normal (n = 8) usando DESeq (Figuras 2A e 2C). Ao olhar para os adenocarcinomas como um grupo e usando o ajuste de Benjamini e Hochberg [27] para o teste múltiplo (FDR 0,1), um total de 52 miRs foram significativamente desreguladas em comparação com a da mucosa normal: 28 foram regulados negativamente e 24-regulada (Tabela S1). O caso neuroendócrino, no entanto, demonstrado um total de 38 miRs desregulados significativamente em comparação com o grupo de mucosa normal, todos regulados positivamente (Tabela S2). Interessantemente, apenas 6 miRs são representados em ambos os grupos histopatológicos: miR-7, -96, -204, -1269, -1827 e -3177. Nessa análise, há, portanto, um total de 46 e 32 miRs que parecer um tanto específico para o adenocarcinoma e neuroendócrino histopatologia, respectivamente.

Ilustração esquemática da abordagem estatística. Painéis A e abordagem show de C usando a ferramenta DESeq estatísticas não pareadas e. O painel B mostra abordagem utilizando a ferramenta Edger estatísticas emparelhadas e. Veja o texto para mais detalhes.

Uma vez que estavam examinando emparelhado amostras de tumor e tecido da mucosa normal a partir dos mesmos pacientes, também realizado um teste dos sete casos de adenocarcinoma utilizando estatísticas emparelhadas no aparador (Figura 2B ). Um total de 118 miRs foram identificados como significativamente desregulado sob as mesmas condições que para a análise não-emparelhados (Tabela S3). Destes, houve 81 miRs que não foram identificados na análise não pareado, e uma sobreposição comum de 37 para ambas as abordagens. Isto confirma a previsão de que a análise não emparelhado é o teste mais conservadora, embora existam 15 miRs identificados como desregulado no teste emparelhado não DESeq que não foram identificados pela análise emparelhado no aparador (Figura 3).

é evidente que há 37 miRs comuns encontrados para ser significativamente desregulada quando utilizar ambas as abordagens estatística (Tabela 2). Há aproximadamente igual distribuição entre a jusante e miRs up-regulamentados. Há tanto humilde (aproximadamente 10-10 000 absoluta lê) e miRs altamente (aproximadamente 10 000-5 000 000 absolutos leituras) expressas representados no subconjunto comum miR, dois exemplos notáveis ​​sendo miR-7 e miR-1, respectivamente. Ao olhar para os níveis de expressão a nível mundial, em termos de todos os miRs identificados, existe uma sobre-regulação da expressão global, em que o tumor em comparação com a de mucosa normal (considerado a partir da análise emparelhada da adenocarcinomas).

O sequenciamento de alto rendimento foi validada experimentalmente usando uma reação em cadeia da polimerase quantitativa para miRs selecionados e amostras de tecido (Figura S1). Nossos resultados estão em linha com os resultados anteriores inter-plataforma de validação [28]:. Os resultados entre os diferentes métodos correlacionam, mas esta correlação está longe de ser perfeito

Discussão

Vários estudos descobriram que miRs estão globalmente sub-regulada em diferentes tipos de câncer, com uma correlação entre o grau de diferenciação e de expressão mundial níveis de miRs. Embora tenha sido indicado que a Global infra-regulação promove a transformação celular e tumorigênese [10], [15], [29], um grande perfil de expressão estudo de tumores sólidos por Volinia

et al

. não foi observada sub-regulação de miRs como relatado anteriormente [30]. O nosso estudo sugere que a regulação negativa global, não é o caso para os adenocarcinomas colo-rectal em nossa coorte, apesar de um número substancial de miRs individuais são regulados negativamente nos adenocarcinomas em relação às amostras normais.

De acordo com o banco de dados miRecords [31], miR-1 tem 117 alvos validados e poderia potencialmente interagir com vários genes importantes na carcinogênese do câncer colorretal. Num estudo de 2009, o miR-1 e miR-551b (entre outros) foram encontrados a ter uma menor expressão em células estaminais embrionárias em relação a células diferenciadas e em cancro colo-rectal em relação à mucosa normal [17]. Isto é consistente com as nossas constatações de regulada para baixo miR-1 e miR-551b nos adenocarcinomas colorrectais. Sub-regulada miR-1 também se observa no caso neuroendócrino. miR-1 foi ainda relatada a ser regulada para baixo e sugeriu uma função tumor-supressor, visando o gene transgelin 2 (

TAGLN2

) no cancro da bexiga [32] e de cabeça e pescoço escamosas carcinomas de células [33] .

miR-145 é regulada nos adenocarcenomas do nosso estudo, e este miR tem sido frequentemente associado com a regulação negativa em cancros colo [16], [34], [35], [36] . Acredita-se que tem um papel supressor de tumor, em parte, pela segmentação do receptor de substrato do receptor da insulina 1 (ISR-1) e tipo I semelhante a insulina do factor de crescimento (IGF-IR). Perda de miR-145 de inibição aumenta sinais anti-apoptóticos em células e a promover o crescimento das células [37], [38].

Num estudo de 2010, o miR-195 verificou-se ser regulada para baixo em 81 tecidos de câncer colorretal em comparação com mucosa normal combinado e isso está de acordo com os nossos resultados para os adenocarcinomas. Este miR é acreditado para segmentar Bcl-2 e, por conseguinte, exercer a sua função pró-apoptótico quando regulada fisiologicamente [39]. Outro estudo mostrou que a expressão reduzida de miR-195 ocorreu mais frequentemente em pacientes com metástases em linfonodos e estágio do tumor avançado. baixos níveis de expressão foram também pobres preditores de sobrevida global [40].

Em dois estudos menores, um de câncer de cólon, sem metástase ganglionar [41] e outra de câncer gástrico [31], miR-378 foi encontrado para ser regulada para baixo nos tumores comparativamente ao tecido adjacente normal, como visto em nosso estudo. Todavia, foi relatado que o miR-378 promove a sobrevivência celular e o crescimento do tumor por segmentação Sufu e Fus-1 [42] e pode também desempenhar um papel de modificação com outros miRs na angiogénese [43]. Existe outra evidência de que o módulo funcional Myc /miR-378 /TOB2 /ciclina D1 regula a transformação oncogénica [44].

miR-383 é também regulada negativamente nos adenocarcinomas em comparação com o tecido normal. Para nosso conhecimento esta não foi reportado para os adenocarcinomas colorrectais, mas tem sido observado num pequeno estudo sobre o cancro gástrico [45]. Há uma boa concordância entre os nossos resultados de miRs regulada para baixo em adenocarcinomas colorretais e relatórios publicados anteriormente. Bem como os miRs descrito acima, identificamos um número significativo de outros miRs uniformemente regulada para baixo, menos referidas na literatura; -139-5p, -363, -422a, -486-5p, -490-3p, -628-3p, -628-5p, -1297, -3151, -3163, -3622a-5p e -3656 (Tabela 2 ). Isso destaca o potencial de alta sequenciamento rendimento como uma ferramenta para identificar miRs potencialmente relacionadas com a carcinogênese que poderiam ter sido perdidas usando a tecnologia baseada em array.

miR-7 tem um papel funcional na diferenciação de células epiteliais no intestino , revisado por Tazawa

et al

. [46]. Acredita-se que regulam a expressão de CD98 glicoproteína transmembranar que tem um papel importante na adesão celular através da interacção com a integrina beta-1. A regulação de miR-7 suprime a expressão de CD98 em células Caco2-BBE e, portanto, modula interacções beta-1-integrina-laminina-1. Isto pode afectar a proliferação e diferenciação de enterócitos durante a migração através do eixo de cripta-vilosidade [47]. miR-7 tem sido relatado para funcionar como um supressor de tumor em schwannomas [48], mas como um oncogene em carcinomas de células escamosas do pulmão [49]. Há uma evidência emergente de que a expressão aumentada de EGFR está associado com um aumento do nível de miR-7, pelo menos em carcinomas de células escamosas. O miR-7, por sua vez tem como alvo fator ETS2 repressor (FER), atenua a expressão de EGFR e modula o crescimento celular [49]. É, portanto, possível que o miR-7 pode funcionar em vários ciclos de feedback e feedforward, tanto como supressor de tumor e do oncogene, dependendo do tipo de tumor. Os nossos resultados sugerem fortemente que o miR-7 é regulado para cima em ambos os adenocarcinomas colo-rectais e no caso neuroendócrino. Com base nas descobertas anteriores e publicados alvos validados para miR-7 como

EGFR

,

PAK1

,

RAF1, IRS1 /2

e

CD98

[ ,,,0],31], é justo supor que este miR podem estar envolvidos na regulação da sinalização intracelular, crescimento e diferenciação de cânceres colorretais.

As expressões de miR-96, miR-135b e miR-493 foram aumentadas em vários estudos sobre o câncer colorretal, bem como em nosso estudo [14], [17], [50]. miR-135 foi mostrada para alvejar directamente a UTR 3 ‘de

APC

e induzir a via Wnt a jusante [51]. Os nossos resultados também mostram que o miR-552 e -592 expressões foram aumentados em comparação com os adenocarcinomas tecidos normais. dados publicados anteriormente para estes dois miRs demonstraram um aumento da regulação nos cancros colo com status de reparo incompatível proficiente (MMR), mas a infra-regulação em tumores deficientes MMR em relação ao tecido do cólon normal, [17]. Yoon

et ai

observado que o miR-296 interagiu com a UTR 3 ‘do gene

CDKN1A

(p21 /WAF1), e que esta frequência foi de miR-regulado durante a imortalização de células humanas [52]. Curiosamente, também observamos um aumento da regulação do miR-296-3p. Este miR poderia, como tal, contribuir para a carcinogênese inibindo a p53-p21 /WAF1 via.

Não há muitas publicações sobre a função de miR-549 (Chr15 em

KIAA1199

), e o nosso conhecimento nenhum em relação ao cancro colo-rectal. Curiosamente, o gene transcrever este miR está localizada no gene

KIAA1199

. Este gene de função incerta foi previamente relatado para ser fortemente regulado para cima em adenomas colorretais (n = 32) e carcinomas (n = 25) analisados ​​no estudo de Sabates-Bellver

et al

. O estudo também mostra que a expressão de 19 alvos Wnt foi estreitamente correlacionada com a sobre-regulação de

KIAA1199

, e que a expressão na mucosa normal foi limitada a células na porção inferior de criptas do cólon [53], [ ,,,0],54]. A sobre-expressão de

KIAA1199

tem mais tarde foi confirmado para adenomas do cólon [55] e câncer gástrico [56]. Se

KIAA1199 Comprar e miR-549 são co-transcritos, isso pode explicar o aumento dos níveis de expressão de miR-549 foram encontrados em nosso estudo. Além disso, como o aumento da regulação parece ser um evento precoce a partir de estudos publicados anteriormente, o miR-549 poderia ser um biomarcador substituto para o desenvolvimento adenoma e estágios de adenocarcinoma precoce. Isso deve ser investigado em estudos maiores.

Um estudo sobre miRs epigenetically silenciados em câncer colorretal descobriram que miR-1247 foi metilado em células HCT116. células HCT116 e DLD1 foram então transfectadas com um mímico de miR-1247 que resultou numa redução significativa no crescimento celular e a actividade metabólica em ambas as linhas celulares. células NSO (HCT 116 células excluídas por DNA metiltransferase) fez, contudo, não diminuir o crescimento celular quando introduzido ao imitar, mas causou a migração celular prejudicada [57]. O papel desta miR ainda permanece incerto, mas foi levantada a hipótese de funcionar como um supressor do tumor. Encontramos este miR de ser up-regulada nos adenocarcinomas, o que poderia indicar alvos diferentes nas linhas de células puras, em comparação com a de um tecido tumoral organizado.

Finalmente, existem poucos, se houver, os relatórios sobre a função e papel na adenocarcinomas do cólon dos seguintes miRs-regulada em nosso estudo: -105, -483-3p, -584, -1269, -1827, -3144-3p, -3177, -3180-3p e -4326 (Tabela 2).

À medida que incluía um tumor neuroendócrino (NET) neste estudo, podemos tirar proveito de analisar isso separadamente usando uma abordagem estatística semelhante como para os adenocarcinomas. Embora, estamos trabalhando parcialmente, sem repetições, a ferramenta DESeq pode lidar com este desafio [25]. NET são tumores raros que se originam de células neuroendócrinas em diferentes locais do corpo, incluindo o site gastrointestinal. Há uma incidência crescente, em parte devido ao melhor registo e ferramentas possivelmente melhor diagnóstico [58]. No entanto, muito poucos estudos examinaram a expressão de miR na NET. Em nosso estudo, as ações da NET algumas Mirs significativas com os adenocarcinomas, mas o que é mais marcante são algumas das miRs únicas e altamente expressos (Tabela S2). Estes têm grandes mudanças vezes em comparação com tecidos normais não pareadas e também uma expressão relativa mais elevada em comparação com os adenocarcinomas. O padrão de expressão de miRs na NET difere bastante da mucosa normal. Esta pode, naturalmente, ser em parte devido ao próprio tecido neuroendócrino que é funcionalmente e geneticamente diferente do epitélio normal e estroma. No entanto, o miRs identificado pode potencialmente ajudar a diferenciar entre células neuroendócrinas malignas do cólon e de mucosa normal (como os nossos dados sugerem), e, possivelmente, também entre as células neuroendócrinas benignos e mucosa normal (dados não). O tamanho da amostra de um significa que os dados líquidas apenas pode ser considerada como um indicativo. No entanto, em nossa opinião, as diferenças substanciais nos conjuntos de miRs regulados diferencialmente entre os dois tipos de cânceres merecem ser relatados. Nossa observação sugere que pode ser frutífera para investigar mais profundamente estes marcadores miR como eles podem ser úteis para determinar a origem de cânceres colorretais pouco diferenciados.

Microdissecção do tecido tumoral não foi o padrão em estudos previamente realizados. no entanto, temos examinado a histopatologia das amostras de tecido, e estima as porcentagens tumorais e estromais. A percentagem tumor foi de cerca de 67% em média, bem acima da média para um subgrupo da coorte KAM (n = 139), que foi de 49% +/- 24% (dados não publicados). Infelizmente, uma amostra do conjunto de dados foi aberrante com uma percentagem baixa do tumor (Tabela 1), e este é um ponto fraco do nosso estudo. Idealmente, as amostras do estudo devem ter tido uma população tumor mais homogênea. Há no entanto uma noção de que a mucosa normal, é constituído principalmente por células epiteliais e do estroma. Ao comparar o tecido do tumor e da mucosa normal, que são principalmente comparando células tumorais (com quantidades variáveis ​​de estroma) com células epiteliais e do estroma na mucosa normal. Como tal, acreditamos que o efeito de uma porcentagem muito baixa tumor haverá falsos resultados negativos.

Em experimentos de alto rendimento (se o array ou sequenciamento base), é comum para executar uma experiência de validação usando outra tecnologia. Foi realizada uma tal experiência de validação usando uma reação em cadeia da polimerase quantitativa para miRs selecionados e amostras de tecido (Figura S1). Os resultados mostram uma correlação positiva entre as duas plataformas tecnológicas diferentes. Há sete miRs para o qual as mudanças de dobra são muito diferentes na validação. Tais diferenças na alteração de dobragem entre as plataformas de tecnologia não são incomuns tal como demonstrado por um estudo da expressão diferencial de miR utilizando as plataformas de microarray Affymetrix, Agilent, e Illumina, assim como por PCR quantitativa e de alto rendimento de sequenciação [28]. Apesar da preocupação, esta observação não invalida os resultados obtidos. Na verdade, tem-se observado que os métodos de miR perfil de expressão génica são muito influenciadas pelas certa miRs, impedindo a determinação exacta de números absolutos. A tendência observada é fortemente determinada pelo método utilizado para a preparação da biblioteca. No entanto, uma vez que os desvios são sistemáticos e altamente reprodutível de uma determinada tecnologia, perfil de expressão de genes é adequado para a determinação das diferenças de expressão relativa entre amostras, desde que a mesma tecnologia é utilizada em amostras de [23]. Em nosso estudo, devido às grandes quantidades de cDNA necessária para o sequenciamento de alto rendimento, não tínhamos cDNA suficiente disponível para validação de PCR quantitativo para todos os pacientes. Por isso, tivemos que fazer uma segunda rodada de extração de RNA a partir de tecido adjacente, onde disponível. Qualquer heterogeneidade entre os tecidos adjacentes podem adicionar à variabilidade observada nos dados de validação (Figura S1).

Este estudo é o nosso conhecimento único em que a sequenciação mundial de alto rendimento tem sido utilizado para caracterizar a expressão de miR em emparelhado tecido de câncer colorretal e de mucosa normal adjacente. Embora preliminares, acreditamos que os resultados podem servir como um conjunto de treino robusto para um estudo maior coorte. Utilizamos emparelhado e as estatísticas não pareado, e identificou 37 miRs que estão desregulados nos sete casos de adenocarcinoma em ambas as abordagens estatísticas; 19 sub-regulada e 18-regulada. Nossa pesquisa abrangente de miRs diferencialmente expressos confirma algumas descobertas existentes. Também descobrimos 16 miRs desregulados que, a nosso conhecimento, não foram previamente associados com a carcinogênese colorretal. Nossos resultados indicam que estes podem ser importantes reguladores e que mais investigações sobre alvos potenciais miR ea sua possível utilização como marcadores preditivos ou prognósticos são garantidos. Particularmente interessante é o gene miR-549 localizado no

KIAA1199

que se anteriormente tem sido associada com aumento da regulação em adenomas do cólon e carcinomas. Se o miR é co-transcrito, que poderia ser um potencial marcador substituto para a detecção precoce da doença nos fluidos corporais ou fezes. O estudo também lançou uma nova luz sobre os potenciais biomarcadores miR que parecem ser específicas para redes no cólon.

Materiais e Métodos

Cohort

Foram selecionados oito pacientes com câncer colorretal de uma coorte câncer colorretal norueguês (

Kolorectalcancer, arv og MILJØ,

KAM) com base na idade e sexo parâmetros. Todos os pacientes eram do sexo masculino, com uma idade média de 60 anos. Todas as amostras de tecido foram extraídos de espécimes cirúrgicos. A mucosa normal foi coletado em uma parte distal do intestino perto das margens de ressecção. As amostras foram subsequentemente congeladas em azoto líquido e armazenadas num congelador a -80 graus Celsius. Sete dos pacientes foram confirmados para ter uma adenocarcinomas e foi caracterizada como um tumor neuroendócrino, em exame histopatológico. As características clínicas e histopatológicas dos pacientes estão resumidas na Tabela 1.

Extração de RNA e Digital Sequenciação

O ARN total a partir dos pacientes foi extraído a partir de 10 secções congeladas de 10 um para tumor e tecido normal, respectivamente utilizando o kit miRvana (Ambion, TX, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. Algumas amostras foram concentradas numa centrífuga de vácuo para se obter a necessária concentração de 1 ug /uL. A presença de ARN pequeno foi confirmada em um Bioanalyzer 2100 (Agilent, CA, EUA), sem sinal de degradação ao avaliar OD rácio 260/280. A quantidade de partida era 10 ug de ARN total, e o protocolo de preparação foi realizada de acordo com as recomendações do fabricante. ARN pequeno foi isolado a partir de ARN total num gel de PAGE Novex TBE-ureia 15%. O tamanho da banda que representa a área de 18-30 nucleótidos (nt) foi cortado e fragmentado, o ARN foi eluído em NaCl 0,3 M e purificado numa coluna spin X. A 5′-adaptador foi ligado durante 6 horas a 20 ° C. ARN pequeno com 5′-adaptador ligado foi isolado num gel Novex TBE-ureia PAGE a 15% (Invitrogen, CA, EUA).