Sumário

proteínas GAGE ​​são, moléculas específicas primata altamente semelhantes com estrutura primária única e funções celulares indefinidos. Eles estão restringidos a células da linha germinal em indivíduos saudáveis ​​adultos, mas são amplamente expressos numa vasta gama de cancros. Em uma tela de dois híbridos de levedura identificamos o regulador transcricional metazoan, em células germinativas-less (GCL), como um parceiro interação de GAGE12I. GCL liga-se diretamente proteínas LEM-domínio (LAP2β, emerin, Man1) no envelope nuclear, e descobrimos que as proteínas CALIBRE foram recrutados para o envelope membrana interna nuclear por GCL. Com base em experiências de levedura A análise de duplo híbrido e puxar para baixo de polipéptidos GCL, resíduos 209-320 GCL (que inclui o domínio de volta) foram deduzidas suficiente para a associação com proteínas GAGE. GAGE ARNm e ARNm GCL foram demonstradas no testículo humano e a maioria dos tipos de cancros, e com os membros GAGE ​​nível de proteína GCL e foram co-expressos em linhas celulares de cancro. Os estudos estruturais de proteínas GAGE ​​revelou nenhuma estrutura secundária ou terciária distinta, o que sugere que eles são intrinsecamente desordenados. Curiosamente proteínas CALIBRE formado complexos estáveis ​​com dsDNA

in vitro

em concentrações fisiológicas, e GAGE12I vinculado vários fragmentos dsDNA diferentes, sugerindo sequência de ligação não específica. associação dual de membros da família CALIBRE com GCL para o envelope da membrana nuclear interna nas células, e com dsDNA

in vitro

, implicam proteínas CALIBRE na regulação da cromatina em células germinativas e células cancerosas

Citation.: Gjerstorff MF, Rösner HI, Pedersen CB, Greve KBV, Schmidt S, Wilson KL, et al. (2012) CALIBRE Cancer-germinativas Antígenos são recrutados para o envelope nuclear por Germ Cell-Less (GCL). PLoS ONE 7 (9): e45819. doi: 10.1371 /journal.pone.0045819

editor: Eugene A. Permyakov, Academia Russa de Ciências, Instituto de Instrumentação Biológica, Federação Russa

Recebido: 13 Abril, 2012; Aceito: 22 de agosto de 2012; Publicação: 20 de setembro de 2012

Direitos de autor: © Gjerstorff et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiado pelo Conselho Dinamarquês de Pesquisa, o dinamarquês Cancer Society, o National Institutes of Health (SR1 GM48646), a Fundação de Pesquisa do Câncer da Dinamarca, a Fundação Lundbeck, a Fundação LeoPharma Research, ea Fundação Hørslev. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

a família GAGE ​​de pequenas proteínas altamente idênticos, oligoméricos é expresso a partir de um locus de 13-39 contendo cópias de genes quase idênticos no cromossoma X [1], [2]. genes GAGE ​​estão presentes apenas em primatas superiores e foram submetidos a uma rápida expansão possivelmente devido a forte seleção positiva [3]. Em indivíduos saudáveis ​​Gage expressão é limitada a células germinativas [4], mas a transcrição de genes Gage é ativada após a desregulação epigenética em células cancerosas [5]. proteínas GAGE ​​são expressos numa vasta gama de tipos de cancro, e a sua expressão correlaciona-se com mau prognóstico no cancro do estômago, carcinoma esofágico e neuroblastoma, indicando um papel na tumorigénese [6]. proteínas GAGE ​​são conhecidos por aumentar a resistência celular a vários agentes citotóxicos, associando diretamente com, e afetando o nível de, reguladores apoptóticos IRF1 e NPM1 [7], [8], mas pouco se sabe sobre suas funções moleculares ou celulares.

Aqui nós relatamos que as proteínas CALIBRE interagir com GCL, uma proteína metazoan importante para a integridade envelope nuclear e desenvolvimento de células germinativas em

Drosophila Comprar e ratos [9], [10]. Em ambas as espécies, GCL localiza na membrana nuclear interna, e várias linhas de evidência sugerem que inibe a transcrição GCL: GCL é necessária para silenciar a transcrição in

Drosophila

células germinativas [11], e em células de mamíferos, liga-se GCL o fator de transcrição heterodimérica DP e, assim, inibe genes DP-E2F-dependentes, que são exigidos para a entrada S-fase. GCL também se liga directamente, pelo menos, três proteínas LEM-domínio (emerin, MAN1 e LAP2β [12] – [14]) localizados na membrana nuclear interna, e parece que é necessária proteínas LEM-domínio como co-repressores

in vivo

[13], [15]. proteínas LEM-domínio ligar lamins (filamentos intermediários nucleares) e são os principais componentes da estrutura nuclear ‘lâmina’.

O componente nuclear ‘lâmina’ do nucleoskeleton consiste de redes de filamentos intermediários nucleares formada por um tipo ou do tipo B lamins [16], em conjugação com fator de barreira-to-autointegration (BAF) [17], [18] e proteínas LEM-domínio, como emerin [19], [20]. Lamins interagir com a cromatina e uma variedade de proteínas estruturais, reguladoras e de sinalização no núcleo [21], e a estrutura nuclear de influência e muitas vias incluindo o desenvolvimento, diferenciação, proliferação celular e apoptose [22], [23]. As alterações na composição ou integridade do nucleoskeleton pode contribuir, por mecanismos que continuam a ser mal compreendidas, à transformação maligna ou progressão do tumor [24]. Por exemplo, a proteína A /T-DNA-rico de ligação SATB1 normalmente forma uma estrutura nucleoskeletal-silenciamento cromatina especializado apenas em timócitos; cancro da mama células com expressão alta SATB1 mostrar expressão grosseiramente desregulada gene [25], [26]. As células que superexpressam GCL têm estrutura nuclear defeituosa, implicando GCL como um componente estrutural do núcleo [9], [10].

Nós relatamos proteínas GAGE ​​são recrutados para a lâmina nuclear através GCL em células, e atá-dsDNA

in vitro

. Estes resultados sugerem que as proteínas CALIBRE pode contribuir para tumorigênese por um mecanismo que envolve GCL e cromatina, ea organização lamina também potencialmente nuclear.

Resultados

CALIBRE proteínas interagem com o celular, menos transcricional regulador Germ (GCL)

para entender melhor as funções celulares de proteínas Gage, foi utilizada uma levedura tela de dois híbridos para identificar potenciais parceiros. triagem baseada em TetR de uma biblioteca de cDNA de testículo usando comprimento total GAGE12I como isca produziu um clone (D2) apresentando crescimento em meio Ura- e coloração azul em meio X-Gal, indicando interação entre isco e presa (Fig. 1A). O plasmídeo presa de D2 continha uma grelha de leitura aberta que codifica os resíduos 84-320 de homólogo menos célula germinal humana 1 (GCL, aliás GMCL1; NM178439.3). associação GCL com GAGE12I foi verificada independentemente por baseada em luciferase (mapeamento interactome baseado em luminescência de mamíferos; ‘Lumier “; [27]) ensaios pull-down. GCL marcaram-luciferase e Proteína-A GAGE12I etiquetado (ou contructs recíprocos) foram transitoriamente expressos em células HEK293. Em seguida, isolado fusões de proteína A usando pérolas de IgG-revestidos e a actividade da luciferase medida (Fig. 1B). sinais de luciferase normalizadas (ligado /entrada) foram convertidos em escores Z, que representa o número de desvios padrão a partir da média de um grande conjunto de pares de derivados de forma independente, não-interagem Lumier proteína [27]. pares GAGE12I-GCL exibiu pontuações Z na gama de 3,4-5,3 (Fig. 1B), o que indica claramente uma interacção entre estas proteínas. Neste ensaio GCL também associada com GAGE2B (pontuações Z:. 1,8-5,3; Fig 1B), que representa o tipo GAGE2-(GAGE2A-E) a família, todos os quais possuem uma tirosina na posição 11, que pode ser fosforilada in outros GAGE proteínas [28]. Isto sugeriu GCL associados direta ou indiretamente com todos os membros caracterizados da família GAGE. Desde o fermento análise de dois híbridos e suspenso ensaios são ambos os sistemas complexos, também testamos o potencial de ligação direta entre proteínas CALIBRE e GCL usando recombinante marcada com His GAGE12I produzido em levedura e uma proteína de fusão GCL-GST bacterially-expresso disponível comercialmente (Fig. 1C). No entanto, a ligação directa de GAGE12I GCL e não foi detectado nestas condições. Nós especulamos que a ligação direta de GAGE ​​e GCL pode: (a) exigir um co-fator ou modificação pós-tradução não fornecidos durante a expressão bacteriana; (B) ser estericamente impedida pela His-tag em GAGE12I ou GST-tag em GCL. Alternativamente GAGE ​​e GCL pode associar indiretamente.

A. GAGE12I foi utilizado como isco em tela uma levedura de dois híbridos de uma biblioteca de ADNc de testículo. Os plasmídeos que codificam presas putativos identificados no rastreio primário foram resgatadas e retransformado em EGY42 com o vector isco GAGE12I (B) ou vector de controlo (C). Clone D2 apresentaram crescimento em meio Ura- e coloração azul em meio X-Gal, indicando uma interação entre isca e presa. O polipeptídeo presa codificada de D2 composta resíduos GCL humanos 84-320, que inclui os domínios BTB /POZ e BACK propostas. B. Interacções entre GCL e GAGE12I foi verificada por meio de Lumier pull-baixos a partir de células HEK293 co-transfectadas com GAGE ​​Proteína A-fundidos e luciferase fundido GCL. sinais de luciferase normalizada (ligado /input) são apresentados como escores Z, que representa o número de desvios padrão a partir da média de um conjunto grande de não-interagem pares de proteínas derivadas de forma independente, Lumier (ver Materiais e Métodos para mais detalhes). C. ensaio de pull-down com recombinante marcada com His GAGE12I e GST-GCL.

Nossa tela de dois híbridos especificamente recuperada resíduos GCL 84-320, que inclui previstos BTB /POZ e domínios de trás (resíduos 109-200 e 214-282, respectivamente). Em outras proteínas, domínios BTB /POZ estão implicadas na ligação ao DNA ou actina [29], [30], enquanto que back-domínios são principalmente alfa-helicoidal, mas têm a função de [31] geralmente não-atribuído. Para determinar quais os domínios GCL foram suficientes para associação GAGE12I, repetiu-se o ensaio de Lumier com Proteína A marcada com GAGE12I e os fragmentos de luciferase GCL-marcados mostrados na Figura 2. A partir destas experiências, que deduzida GCL resíduos 209-320 foram ambos necessários e suficientes de se associar com GAGE12I em células. Esta região incluiu os domínio de volta (resíduos 214-282), mais 38 resíduos adjacentes (resíduos 283-320). O nosso Jpred 3 (Universidade de Dundee, Escócia, Reino Unido) análise previu que os resíduos 209-320 têm GCL vários motivos helicoidais e segmentos helicoidais aleatórios (Fig. S1). Notavelmente GCL resíduos 232-285 são essenciais para se ligar a subunidade DP do factor de transcrição E2F-DP heterodimérica [29]. Isto é interessante porque genes E2F-DP-dependentes promover a proliferação (entrada em fase S) e são os principais alvos da repressão do retinoblastoma supressor de tumor (PRB), que se liga à subunidade E2F [32] – [34]. GCL resíduos 232-285, que são essenciais para se ligar DP, estão incluídos dentro da região GAGE-associação deduzida (GCL resíduos 209-320) (Fig. 2 e Fig. S1). Esta sobreposição sugerido pelo menos dois cenários. Em primeiro lugar, GAGE ​​e DP pode competir para a ligação a GCL, e em segundo lugar, as proteínas GAGE ​​pode influenciar a expressão de genes E2F-DP-dependente.

A ligação de diferentes mutantes de deleção para GCL GAGE12I foi testada por ensaio Lumier (como em Figura 1). A região deduzida como essencial para a ligação GAGE ​​(resíduos GCL 209-320) inclui os resíduos 232-285, que são suficientes para vincular activador transcricional DP (*) [29].

GAGE ​​e GCL são co -expressed no testículo e cancros

membros da família GAGE ​​são expressos de forma detectável apenas em células germinativas e brevemente em tipos específicos de células durante o desenvolvimento fetal primata (ou seja, células do início do ectoderma, células do estroma da medula sexo e córtex adrenal fetal células), conforme determinado por imuno-histoquímica [4], [35] e a análise de RT-PCR (Fig. 3A), utilizando os anticorpos e os iniciadores de PCR esperados para reconhecer todos os membros conhecidos da família GAGE. No entanto, as proteínas são expressas em GAGE ​​10-40% de vasta gama de cancros humanos [4]. GCL ARNm é detectado ubiquamente em Drosophila e células de rato [10], [36] – [38], mas a sua expressão em células humanas normais e malignas não foram sistematicamente analisadas. Para determinar quais os tecidos humanos pode expressar tanto GAGE ​​e GCL, foi utilizado RT-PCR quantitativa para medir os níveis de ARNm e GAGE ​​GCL em 48 tecidos diferentes (Fig. 3A e 3B, respectivamente). GAGE ARNm foi detectada em níveis baixos no baço e epididymous, com níveis elevados no testículo (Fig. 3a), como esperado. Consistente com mouse e Drosophila, GCL mRNA foi detectada em todos, mas um tecido humano normal testado; os níveis mais elevados foram detectados em pituitária, e a excepção foi muscular, onde ARNm GCL não foi detectada (Fig. 3B). Desde GCL é expressa e necessária em Drosophila e células germinais de ratinho especificamente, especula-se que a expressão GCL no testículo humano é também provável localizada em células germinativas, onde as proteínas são abundantes GAGE ​​[4]. GCL mRNA também foi detectado em todos os tipos de cancro examinadas, incluindo da mama, do fígado, do pulmão e cancro da tiróide, que foram anteriormente demonstrado que também expressam proteínas GAGE ​​[4], e não havia nenhuma tendência clara para cima ou para baixo-regulação de ARNm de GCL expressão em qualquer tipo de cancro em particular (Fig. 3C). A seguir, investigou a expressão de proteínas GCL e GAGE ​​em um painel de linhas de células cancerosas humanas de diferentes origens utilizando transferência de Western (Fig. 4). GCL foi detectada em 8 de 9 linhas de células, incluindo melanomas, cancros da mama, cancro do pulmão e carcinoma embrionário, e foi co-expressa com proteínas CALIBRE em 6 destas linhas celulares 8.

A-C. análise de RT-PCR quantitativo da express relativa de ARNm que codificam para todos os membros conhecidos da família GAGE ​​(a) ou GCL (B) em tecidos normais, revela a co-expressão em testículos. mRNA GCL foi também amplamente expressos em diferentes tipos de câncer humano (C), incluindo mama, fígado, pulmão e cancro da tiróide que foram anteriormente demonstrado que também expressam proteínas GAGE ​​[4].

GCL e GAGE a expressão da proteína foi examinada em 9 linhas de células cancerosas humanas derivadas de colo do útero (HeLa), cólon (HCT116), melanoma (MZ2-MEL), mama (BRCA-MZ01, SK-BR3, T47D, M4A4, MCF7) e câncer embrionárias (NTERA2 ) utilizando Western blotting. células de melanoma A375 com expressão exógena da GCL foram incluídos como controlo positivo. Antibodies: GCL pAb1, Sigma Aldrich; GCL pAB2, A14 clone, Santa Cruz Biotech; GAGE mAb, clone M3 [4], o mAb de beta-actina, Ab6276; Abcam.

co-localização Potencial de GCL e proteínas CALIBRE em secções de tecidos e cancros humanos normais não poderia ser examinado devido à falta de anticorpos GCL adequados. Desde GCL mRNA é quase onipresente em tecidos humanos, pode-se esperar o mesmo para a proteína GCL. No entanto, este não pode ser assumida, uma vez que o ARNm GCL é reprimido ao nível da tradução em embriões como um mecanismo para limitar a expressão da proteína GCL para a linha germinal [39]. Suportando a hipótese de que a expressão da proteína GCL é restrito, fenótipos ratos GCL-nulos foram detectadas em apenas três tipos de células (fígado, pâncreas e testículos) [10]. Embora a expressão da proteína GCL pode ser restringida em tecidos humanos normais nossa análise de linhas de células de cancro humano sugerem que a proteína GCL é expressa em vários tipos de câncer.

Esses resultados foram consistentes com potencial associação de GAGE ​​humana e GCL no sexo masculino células germinativas e diferentes tipos de células cancerosas.

GCL Recrutas CALIBRE proteínas para o Inner envelope nuclear

GCL localiza difusamente dentro do núcleo e também perto do envelope nuclear em

Drosophila

[38] e mouse células [13], de acordo com a sua ligação directa

in vitro

para proteínas da membrana nuclear LAP2β, emerin e man1 [12] – [14]. Para determinar se a GCL influenciou a localização de proteínas Gage, que sobre-expresso marcada com myc GCL em células HeLa e usado coloração por imunofluorescência indirecta para verificar tanto a localização nuclear de GCL-Myc e a sua co-localização com laminas endógeno do tipo A, perto do envelope nuclear (Fig. 5A). Quando sobre-expresso por si só em células HeLa, GAGE12I localizado difusamente com os sinais mais brilhantes no interior do núcleo (Fig. 5B), consistente com a localização do GAGE ​​endógeno em muitas outras linhas celulares e tecidos [4]. Também como esperado, overexpressed GCL-Myc localizada tanto para o envelope nuclear (Fig. 5C) e difusamente no nucleoplasma [10], [13]. Interessantemente, em células HeLa que expressa transitoriamente tanto GAGE ​​e GCL-Myc, a maioria das proteínas GAGE ​​co-localizada perto do envelope nuclear com GCL-Myc, como mostrado, por GAGE12I (Fig. 5D) e GAGE1 (Fig. 5E). Os mesmos resultados foram obtidos em células HCT116 transfectadas (dados não mostrados). Do mesmo modo, em duas linhas de células de melanoma MZ2-MEL (e SK-MEL-31), a expressão transiente de GCL-Myc deslocado a distribuição de proteínas endógenas GAGE ​​para o envelope nuclear (Fig. 5F, L). Concluímos exógena GCL pode recrutar proteínas exógenas e endógenas CALIBRE ao envelope nuclear.

A. Imuno-histoquímica de dupla coloração de Myc-marcado GCL humana e endógenos do tipo A lamins (lamins A /C) em células HeLa transfectadas; GCL co-localizada com laminas de A /C para o envelope nuclear. ESTAR. As células HeLa foram transitoriamente transfectadas com GAGE12I (B), GCL-Myc (C), ou GCL-Myc mais qualquer GAGE12I (D) ou GAGE1 (E). GCL localizada no envelope nuclear e recrutou proteínas CALIBRE do nucleoplasma. F-G. linhas de células de melanoma MZ2-MEL (F) e SK-MEL-31 (g), que expressam elevados níveis de GAGE ​​endógeno, foram transfectadas para expressar GCL-Myc; imunocoloração revelou translocação GCL-mediada de GAGE ​​do nucleoplasma ao envelope nuclear. H-K. A análise imuno-histoquímica de proteínas GAGE ​​endógenos em tecidos humanos normais e tumores revelaram uma densa sinais GAGE ​​próximos do envelope nuclear em células do córtex supra-renal fetal (H), a migração de células primordiais germinativas (I), células de carcinoma da mama (J) e de células de melanoma maligno (K) espécimes. (GAGE = DAB /marrom; Núcleos = Mayers hematoxilina /azul). Barras, 5 uM (A) e 10 uM (BK).

Apesar de associação entre as proteínas e GAGE ​​GCL endógenos em células e tecidos humanos não poderia ser investigada, devido à falta de anticorpos adequados para GCL immunocyto – e imuno-histoquímica, proteínas CALIBRE poderia ter sido esperado para localizar na membrana nuclear em células cancerosas linhas demonstrado para expressar GCL endógena por Western blot (por exemplo, HeLa, HCT116, MZ2-MEL; Fig. 4). No entanto, nestas células foram observadas ao longo do GAGE ​​proteínas compartimento nuclear. Isto poderia ser devido a uma necessidade de altos níveis celulares de GCL, só pode ser alcançado por sobre-expressão, para recrutar o suficiente das proteínas nucleares GAGE ​​para expor a sua localização na membrana nuclear. Assim, as proteínas GAGE ​​pode localizar-se tanto a membrana nuclear e nucleoplasma em células com níveis normais de GCL. Notavelmente, coloração imuno-histoquímica de espécimes clínicos humanos com anticorpos GAGE ​​revelou não difusa, sinais GAGE ​​densas que apareceram a concentrar-se junto da periferia nuclear em células do córtex supra-renal fetais (Fig. 5H), as células germinativas primordiais dos mesonephros (Fig. 5I), células de melanoma maligno (Fig. 5J) e da mama células de carcinoma (Fig. 5K), mais fundamentação do que as proteínas CALIBRE associar-se com a membrana interna do envelope nuclear.

CALIBRE proteínas são intrinsecamente desordenados

análise anterior de proteínas GAGE ​​nativa e recombinante por SDS-PAGE e cromatografia de exclusão por tamanho demonstrou uma massa aparente de 26 kDa, que foi maior do que a sua massa prevista e MALDI-MS confirmou de ~13 kDa [2], [4]. Esta migração anómala pode reflectir a composição em aminoácidos invulgar das proteínas Gage, que têm alguns resíduos hidrofóbicos (15 de 117) e diversos resíduos carregados (36 de 117). No entanto, estes recursos também são característicos de proteínas intrinsecamente desordenadas (DIs) [40], [41]. Para considerar esta possibilidade foram aplicados dois algoritmos diferentes para predição de estrutura de proteínas, FoldIndex e metaPrDOS, para GAGE12I, um membro representante da família GAGE. Ambos os algoritmos previram uma alta probabilidade de desordem ao longo da proteína (Figura 6A;. Os painéis esquerdo e direito, respectivamente). Uma vez que é GAGE12I 98% idêntica a quase todos os outros membros conhecidos da família GAGE ​​[6], isto sugeriu que as proteínas GAGE ​​geralmente carecem de estrutura secundária. A única exceção foi GAGE1; nossa previsão estrutural para GAGE1, que tem um único domínio C-terminal de [6], sugeriu esta região C-terminal é alfa-helicoidal (Fig. S1).

. estrutura secundária e desordem do GAGE-12I previsto por dois algoritmos: FoldIndex (painel esquerdo) e metaPrDOS (painel direito). B. espectro de CD de UV distante de GAGE-12I-gravada 195-250 nm de 4,5 uM GAGE-12I em NaCl 100 mM e fosfato de sódio 50 mM, pH 5,5 a 25 ° C. O mínimo de cerca de 200 nm, mais a falta de outro mínimos distinta, indicam claramente a proteína é predominantemente desdobrado. C. 1D

espectro de 1H-RMN de 4 mg /ml GAGE-12I em 100 mM de NaCl, 50 mM de fosfato de sódio pH 5,5, DSS a 0,15 mM e 10% de D

2O. A muito fraca dispersão dos sinais de RMN, especialmente visível na região alifático, proporciona uma impressão digital clara de uma proteína desdobrada.

O transtorno potencial de GAGE12I foi testada por dicroísmo circular (CD) e

de Ressonância magnética Nuclear 1H (RMN). Um espectro de CD de UV distante-gravados para o GAGE-12I mostrou apenas um mínimo de cerca de 200 nm (Fig. 6B). Este mínimo, e a falta de qualquer elipticidade negativa distinta na região 210-225 nm (Fig. 6B), mostrou que o GAGE-12I tem nenhum tipo prolongado de estrutura secundária. Confirmando esta observação, a 1D

espectro de RMN-1H revelou uma dispersão estreita de sinais (Fig. 6C). Na região do espectro mostrando sinais a partir de cadeias laterais alifáticas, observou-se não há desvios químicos negativos. A dispersão estreita foi novamente visto claramente para sinais de amida de prótons na região de cerca de 7-9 ppm. Concluímos GAGE12I não tem estrutura secundária ou terciária distinta.

GAGE ​​proteínas se ligam de dsDNA em concentrações fisiológicas

GAGE ​​proteínas localizam no núcleo de ambas as células normais (isto é, células germinativas e células do córtex supra-renal fetal) e células cancerosas [4]. Por conseguinte, a hipótese de as proteínas GAGE ​​pode associar com o ADN. Esta hipótese foi suportada por experiências de pull-down mostrando que GAGE12I recombinante (expressa em levedura e altamente purificada) [2]), e proteínas GAGE ​​endógenas presentes em MZ2-MEL lisado de células de melanoma, ligado ao DNA de timo de vitela nativa (Fig. 7, A e B, respectivamente).

A-B. Western blot de pulldown experiências que testam a ligação dos GAGE12I recombinante (A) ou GAGE ​​proteínas endógenas a partir de lisados ​​de MZ2-MEL (B) à celulose sozinha, ou imobilizada-celulose nativa dsDNA de timo de vitela. C. electroforéticas ensaios de desvio de mobilidade. Cada concentração indicada de GAGE12I purificado foi incubado com o

32P-marcado fragmento de ADN EcoRI-PvuII de 90 pb a partir de pUC19 no 1 pg /mL; As amostras foram então resolvidos por electroforese em gel de agarose. D. mesma experiência tal como em (C), mas com a adição de NaCl. E. Predição de ADN putativa de ligação de aminoácidos em GAGE12I utilizando o programa BindN. +/- = Obrigatório /não vinculativa; 0-9 = confiança de previsão de ligação

ensaios de mudança de mobilidade eletroforética foram utilizados para analisar ainda mais a associação direta entre proteínas CALIBRE e dsDNA usando diferentes fragmentos de restrição do plasmídeo pUC10 ou pUC19 (Fig. 7C e Fig. . S2). A uma concentração de -10 ng /mL (730 nM), GAGE12I causou um subconjunto de moléculas de dsDNA de migrar lentamente (Fig. 7C). Na presença de 100 ng /ul GAGE12I (7,3 uM) mais de 50% de ADNcd migrado lentamente (nucleoproteína ‘complexo 1’) e que também foi detectada até mesmo de migração mais lenta complexo (Fig. 7C, “complexo 2 ‘), sugerindo o potencial oligomerização. GAGE12I vinculado vários fragmentos dsDNA sequência não relacionados, sugerindo DNA independente da sequência de ligação (dados não mostrados). Ambos os complexos eram estáveis ​​em NaCl 75 mM, e uma pequena fracção de um complexo ficou estável em NaCl 250 mM (Fig. 7D).

. dot blots para estimar o teor de proteína GAGE ​​em SK-MEL-31 de lisados ​​de células inteiras de MZ2-MEL e por comparação com GAGE12I recombinante. As manchas foram sondadas com anticorpos esperados para reconhecer todos os membros da família GAGE; o número abaixo de cada ponto indica a intensidade do sinal relativo. B. A quantificação relativa de proteínas CALIBRE nos núcleos e citoplasma de MZ2-MEL e SK-MEL-31 células com base na imunocoloração intensidades de imagens confocal medida usando software ImageJ64.

Nós usamos a previsão de ácido nucleico BindN programa [42] definido para uma especificidade de 95% para prever o potencial resíduos obrigatório em GAGE12I DNA. Este programa identificou resíduos GAGE12I 4-17 como um domínio de ligação ao ADN putativo (Fig. 7E), mas isto tem de ser verificada experimentalmente.

Os resultados acima mostraram uma concentração GAGE ​​de pelo menos 10 ng /ul (730 nM) foi necessária para se ligar ao ADN a uma concentração de 1 pg /mL (17 pM), o que corresponde a uma razão molar de 43:1 (GAGE12I: DNA). Para determinar se estas concentrações GAGE ​​foram fisiologicamente relevante, medimos o conteúdo GAGE ​​em SK-MEL-31 lisados ​​de células de melanoma MZ2-MEL e contra quantidades conhecidas de GAGE12I recombinante utilizando dot blotting. MZ2-MEL e células SK-MEL-31 foram encontrados para conter 0,53 pg e 0,29 pg de proteína GAGE ​​por célula, respectivamente (Fig. 8A). Com base em um diâmetro estimado de células de melanoma de -15 pM (assumindo uma forma esférica), as concentrações foram conservadoramente calculada como sendo de 299 ng /mL (23 uM) em células MZ2-MEL e 164 ng /mL (12 uM) em SK- células MEL-31. Em ambas as linhas celulares, microscopia confocal sugerido o sinal GAGE ​​foi 2-3 vezes mais intensa no núcleo do que no citoplasma (Fig. 8B). Concluiu-se que a concentração nuclear de proteínas CALIBRE nestas células é bem acima (7,3 M) necessária para ~ 50% de ligação ao DNA

in vitro

.

Discussão

caracterização funcional de proteínas Gage é importante compreender seus papéis na célula cancerosa e biologia de células germinativas e avaliar seu potencial terapêutico como alvos de câncer. Este estudo revelou que as proteínas CALIBRE interagem direta ou indiretamente com GCL, e que GCL recruta proteínas CALIBRE ao envelope nuclear em células. Demonstramos ainda que GCL e um medidor de membros co-expressa em células testiculares e cancerosas humanas. GCL é importante para a integridade envelope nuclear e desenvolvimento de células germinativas em ambos os

Drosophila Comprar e ratos [9], [10]. GCL concentra perto da membrana interna nuclear, possivelmente refletindo a sua ligação directa às proteínas LEM-domínio [12] – [14]. Em

Drosophila

, GCL é necessário para silenciar a transcrição em células germinativas [11]. Em células de mamíferos, GCL se liga directamente DP e reduz a expressão de genes E2F-DP-activado [29]. Estes resultados implicam GCL como um regulador negativo da actividade de DP. Nossa evidência sugere GCL também recruta proteínas CALIBRE ao envelope nuclear. Se sequestra esse recrutamento e esgota GAGE ​​de outros locais de ação (como proposto para certos fatores de transcrição; [43]), ou é necessário para GAGE ​​para funcionar, ou se GCL é regulada pela própria Gage, permanecem desconhecidos

Nós descobrimos que as proteínas GAGE ​​são proteínas intrinsecamente desordenadas que podem se ligar dsDNA diretamente. Outras proteínas de ligação dsDNA intrinsecamente desordenados incluem Grupo de Alta Mobilidade (HMG) proteínas de domínio e metil-CpG vinculativo proteína 2 (MeCP2) [44], [45]. O antigénio do cancro Page4-linha germinal, que é ao mesmo tempo e evolutivamente relacionadas com proteínas estruturalmente GAGE ​​(32% de identidade com GAGE12I), também é intrinsecamente desordenados e exibem propriedades de ligação de ADN [46]. polipeptídeos não estruturados muitas vezes adotam estruturas dobradas após a ligação seus alvos biológicos [41], [47]. Tanto a região de ligação ao DNA de Gage, e a base estrutural da ligação GAGE ​​ao DNA ou cromatina, são tópicos importantes para a investigação futura. Nossos resultados atuais sugerem proteínas CALIBRE ligar dsDNA de uma forma independente de sequência, similar às proteínas de domínio HMG. No entanto potencial ligação preferencial (por exemplo, a sequências de DNA A /T-ricos, como visto para o regulador cromatina SATB1; [25]) não está descartada. As nossas experiências de desvio em gel revelou ligação detectável a fragmentos de ADNcd 90-pb (17 pM) a uma concentração de 0,73 ^ M GAGE12I, e aproximadamente 50% de ligação a uma concentração de 7,3 uM GAGE12I. Estas concentrações estavam bem abaixo das concentrações de proteína GAGE ​​estimados em núcleos de células de melanoma, e sugeriu um

In vitro

estequiometria de ligação de 43-a-1 (ADN GAGE12I-a-) a 50% de ligação. Desde que as proteínas CALIBRE formar dímeros e oligômeros estáveis ​​de ordem superior [2], que a hipótese de esta relação molar alta reflete oligomerização dependente da concentração de proteínas Gage.

Nós ainda não compreender o significado do GAGE ​​ligação ao DNA

in vivo, ou se este é influenciado pelo GCL. No entanto, especular proteínas CALIBRE pode colmatar cromatina para complexos de proteína GCL-associados para o envelope nuclear e, assim, regular a organização e função [22] cromatina, [48]. Na linhagem celular germinal humana, GAGE ​​proteínas estão presentes em células germinativas primordiais (PGCs) e desaparecer imediatamente antes da primeira divisão meiótica [35], [49]. PGCs proliferar e migrar a partir do saco vitelino dorsal através do mesentério dorsal para invadir e colonizar as cristas gonadais [50]. Este processo envolve uma sequência de eventos que reorganizam epigenética e reprogramar cromatina, e, finalmente, deslocar a partir de uma célula somática para um estado de células germinativas [51]. Estas alterações epigenéticas são ainda pouco caracterizada, mas incluem a perda de todo o genoma de metilação do DNA, perda gradual de H3K9me2 e ganho global H3K27me3 [52]. Notavelmente, as alterações epigenética são também essenciais para a tumorigénese, e semelhanças fenotípicas entre células germinativas e células cancerosas sugerem activação potencial de um programa de diferenciação relacionada com o gameta em células cancerosas [5]. Nós, portanto, especular que os membros da família CALIBRE têm novos papéis em ordem maior reorganização da cromatina e reprogramação em células germinativas e células cancerosas.

Materiais e Métodos

Imunoensaios

Os anticorpos usados ​​em neste estudo foram: mouse anti-GAGE (M3 [4]; imunocitoquímica [ICC], diluição 1/100; western blot [WB], diluição 1/5000), de coelho anti-Myc (A14; Santa Cruz Biotech, Heidelberg, Alemanha ; ICC, 1/100), de coelho anti-GCL (Santa Cruz Biotech; WB, 1/1000), de coelho anti-GCL (Sigma Aldrich, Brondby, Dinamarca; WB, 1/1000), rato anti-beta-actina ( Ab6276; Abcam, Cambridge, UK; WB, 1 /200.000); de cabra conjugado com FITC anti-IgG de ratinho (Dako, Glostrup, Dinamarca; TPI, 1/400), IgG de cabra anti-coelho conjugado com Cy3 (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA, EUA; TPI, 1/400).

Western blot e coloração de células foram descritos anteriormente [4]. Para manchas de ponto, vimos GAGE12I recombinante ou lisados ​​celulares (feito em PBS utilizando homogeneização moinho de esferas) para uma membrana de PVDF ativado; membranas secas ao ar foram processados ​​como descrito por Western blot e quantificadas usando um gerador de imagens Fusão FX7 (Vilber Lourmat Deutschland GmbH, Eberhardzell, Deutschland).

Levedura de dois híbridos de tela

A duas leveduras tela híbrido foi realizado por ProteinLinks (Pasadena, CA, EUA).