Sumário

Os microRNAs (Mirs) são pequenos, endógeno, RNAs não-codificantes que regulam a estabilidade e /ou tradução de alvos de mRNA complementares. Mirs surgiram não só como moduladores críticos de processos fisiológicos normais, mas a sua desregulamentação pode impactar significativamente próstata e outros tipos de câncer. A expressão de miR-23b e miR-27b, que são codificados pelo mesmo conjunto de miR (miR-23b /-27b), são regulados negativamente em metastáticos, resistente à castração em comparação com cancro da próstata primário e tecido benigno; no entanto, o seu possível papel na progressão do câncer de próstata é desconhecida. Descobrimos que a expressão ectópica de miR-23b /-27b em duas linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração independentes resultou em supressão de invasão e migração, bem como a sobrevivência reduzida em agar mole (uma medida de anoikis). No entanto, não houve efeito de miR-23b /-27b na proliferação de células, sugerindo que estes miRs funcionar como metástase (mas não o crescimento) em eliminadores de cancro da próstata. Por outro lado, a inibição de miR-23b /-27b na linha celular de cancro de próstata LNCaP dependente de androgénios menos agressiva resultou na invasão e migração melhorada sem afectar também a proliferação. Mecanisticamente, verificou-se que a introdução de miR-23b /-27b em metastático, linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração resultou numa atenuação significativa da actividade Rac1 sem afectar os níveis totais Rac1 e causou o aumento dos níveis do supressor de tumor de E-caderina. A inibição destas miRs teve o efeito oposto em células LNCaP dependente de androgénios. Estes resultados sugerem que miR-23b /-27b são supressores metástase que podem servir como novos biomarcadores e agentes terapêuticos para a doença resistente à castração

Citation:. Ishteiwy RA, Ward TM, Dykxhoorn DM, Burnstein KL (2012) o microRNA Cluster -23b /-27b Suprime a metastático Fenótipo de células cancerosas da próstata resistente à castração. PLoS ONE 7 (12): e52106. doi: 10.1371 /journal.pone.0052106

editor: Moray Campbell, Roswell Park Cancer Institute, Estados Unidos da América

Recebido: 31 Julho, 2012; Aceito: 09 de novembro de 2012; Publicação: 26 de dezembro de 2012

Direitos de autor: © 2012 Ishteiwy et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of Health Grant CA132200 (a KLB) e DOD Pré-doutorado bolsa de formação w81xwh-11-1-0314 (a RAI). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

para mais de meio século, a privação de andrógenos tem sido a terapia padrão para o câncer de próstata avançado e metastático, como tumores são inicialmente dependentes de andrógenos para a sobrevivência e crescimento. Infelizmente, na maior parte dos pacientes, os tumores progridem para, eventualmente, uma forma incurável, resistente à castração e metastático. Assim, novas terapias eficazes e indicadores prognósticos precisos são necessários para melhorar o atendimento clínico de homens com câncer de próstata.

A metástase, uma característica de malignidade, é a migração de células tumorais através do sistema de circulação sanguínea ou linfa do tumor original site para órgãos distantes. desenvolvimento metastático prossegue através de um processo de passos múltiplos que inclui a invasão local, o movimento para a corrente sanguínea (intravasamento), a sobrevivência na circulação, a saída a partir de vasos sanguíneos (extravasamento), iniciação e manutenção de micrometástases em locais distantes e, finalmente, a vascularização dos novos tumores [ ,,,0],1]. Para prosseguir para baixo esta cascata metastática, as células tumorais primárias acumular alterações genéticas e epigenéticas, incluindo a desregulamentação dos padrões de expressão de miRNA. Elucidar os mecanismos que facilitem a migração de células de cancro e invasão é um dos principais objectivos de investigação do cancro, como metástases continua a ser a causa de 90% das mortes por tumores sólidos [1]. A sobrevida média para pacientes com câncer de próstata localizado é maior do que 5 anos, as taxas de sobrevivência enquanto os homens com doença metastática foram substancialmente diminuídos [1].

Os microRNAs (miRs), pequena não codificante 18 a RNAs de 24 nucleótidos, são previstos para regular a expressão de mais de 90% dos genes que codificam proteínas, afectando assim diversos processos celulares e moleculares [2]. Mirs modular os níveis de mRNA e tradução através de emparelhamento de base canônica entre a sequência de sementes da miRNA (nucleótidos 2-8 na extremidade 5 ‘) e as sequências de jogo semente complementares de mRNAs alvo, que são tipicamente localizadas na região 3’ não traduzida (UTR ) [3]. MicroRNAs silenciar os seus alvos cognatos por clivagem de mRNA, a repressão translacional, desestabilização ARNm ou uma combinação destes mecanismos [4]. Mais de 50% dos genes humanos miR anotada estão localizados em regiões cromossómicas que são susceptíveis a amplificação, delecção ou translocação durante o curso do desenvolvimento do tumor [5]. Mirs desempenhar um papel crítico na metástase, provavelmente devido à sua capacidade de pós-transcricional regular redes de genes importantes para a invasão celular, motilidade e migração [6].

A biogênese de miRs é um altamente regulado, processo de várias etapas [ ,,,0],7]. Mais de 40% dos miRs humanos são organizadas em clusters evolutivamente conservadas, que são cotranscribed como discreta policistr�ica pri-miRNAs. Um grande número de clusters Mirs e Mir estão desregulados na oncogênese e desenvolvimento metastático [8].

miR-23b e miR-27b, as quais compreendem um cluster no cromossomo humano 9, são especificamente regulada no castração humana cancro da próstata (CRPC) amostras clínicas resistentes ao [9] – [12], bem como em modelos de células CRPC [10], [13]. Curiosamente, Sun et ai. [12] verificaram que o miR-23b /-27b expressão é diminuída significativamente (2,8 vezes) em tumores primários (em comparação com o tecido normal adjacente) e é ainda mais reduzida em 3,2 vezes em amostras CRPC metastáticas. Neste estudo, 15 de 17 amostras de tumor CRPC exibiram a regulação negativa de miR-23b /-27b em comparação com as amostras de tumor primário [12]. Apesar da correlação da diminuição miR-23b /-27b com o aumento da patogênese da doença, o papel de miR-23b /-27b em doença metastática CRPC não tem sido bem caracterizado. Aqui nós fornecemos evidências de que o miR-23b /-27b suprime processos metastáticos chave, incluindo a invasão celular, migração e sobrevivência independente de ancoragem sem afetar a proliferação celular. Estes efeitos são acompanhados pelo aumento dos níveis de E-caderina e atenuação da atividade Rac1

E-caderina, uma molécula de adesão celular, suprime o fenótipo invasivo e migratório das células cancerosas [14] – [17].. Perda de E-caderina está associada tipicamente com invasividade tumoral, disseminação metastática e mau prognóstico do paciente em uma variedade de cancros, incluindo próstata. Por exemplo, a perda de E-caderina confere a capacidade metastática de células relativamente não agressivos da mama, transformado epiteliais [16]. Além disso, as células de E-caderina negativo exibem invasão e potencial metastático aumentada em comparação com células de E-caderina positivos no modelo de tumor de próstata de rato Dunning [14], [15], [18]. O Rho GTPase Rac1, que regula rearranjos do citoesqueleto necessárias para a migração celular, está fortemente associada com câncer agressivo de próstata [19] – [22]. Cima Rac1 é necessário para comportamento invasivo da linha celular de cancro da próstata humano PC3 [23]. Assim, os dados aqui apresentados são consistentes com um papel para o miR-23b /cluster -27b na supressão de metástases através de efeitos no E-caderina e Rac1.

Materiais e Métodos

Cultura Celular

As linhas de células cancerosas humanas da próstata ALVA31 (obtido a partir Drs. Stephen laço e Richard Østensen, do Departamento de Assuntos de Veteranos Medical Center, Tacoma, WA) [24], LNCaP (American Type Culture Collection, Manassas, VA), PC3 -ML (obtido do Dr. Alessandro Fatatis, Drexel University College of Medicine) [25] foram subcultivadas e mantidas em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal, 100 Ul /ml de penicilina, 100 g /mL de estreptomicina, e 100 g de /ml de L-glutamina. Todas as culturas foram mantidas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2.

Isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo

O ARN total foi isolado utilizando o isolamento miRvana miARN kit (Applied Biosystems, Foster City, Califórnia). A TaqMan haste-laçada método de RT-PCR utilizando o kit de transcrição reversa Taqman® miARN e os ensaios Taqman® miARN (Applied Biosystems) foi utilizado para avaliar a expressão de miR-27b.U6 ARN nuclear pequeno serviu como um controlo interno em todas as experiências .

imunotransferência

As proteínas celulares foram extraídos e separados em geles de SDS-PAGE e análise western blot foram realizadas de acordo com procedimentos padrão. Western blotting de β-actina na mesma membrana foi utilizado como um controlo de carga. Os anticorpos utilizados foram anti-E-caderina (BD 610181), anti-Rac1 (Milipore 23A8), e anti-actina (Santa Cruz 1616).

Plasmids e Lentivirus Produção

O humano miR-23b /-27b precursor (pMIRNA-23b /-27b-GFP) e controle mexidos (pMIRNA-Scrambled-GFP) clonado em vetores de lentivírus (Sistemas de Biociências (SBI) mountain View CA, EUA) foram transfectadas em células HEK LentiX ( Clontech, mountain View CA, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante. expressão da GFP em células ALVA31 e PC3-ML transduzidas foi determinada por cytometery fluxo.

citometria de fluxo

células tripsinizadas foram permeabilizadas usando 0,05% de tripsina com EDTA 0,53 mM (Cellgro). A citometria de fluxo foi realizada num Accuri C6 citometria usando software cflow de acordo com as instruções do fabricante.

transfecções celulares

nucleótidos anti-sentido modificados quimicamente (antagomirs) contra o miR-23b e miR-27b ou controlo antagomirs foram adquiridos a Applied Biosystems e foram transfectadas, a 50 nm, utilizando Lipofectamine 2000 (Invitrogen) de acordo com o protocolo do fabricante. Todos os ensaios experimentais foram realizados 72 horas após a transfecção.

Ensaios de Migração

ensaios de raspadinhas foram realizados em ALVA31 células 72 horas após transdução com miR-23b /-27b ou mexidos controlo ou em células LNCaP 72 horas após a transfecção com antagomir-23b /-27b ou controlar antagomir. A ponta de pipeta estéril foi arrastado monocamadas de células confluentes para criar do zero. As monocamadas foram então lavadas duas vezes para remover os detritos celulares e incubaram-se a 37 ° C, 5% de CO

2 durante 4 horas. As fotografias foram tiradas imediatamente depois de coçar e novamente após 4 horas. J imagem foi usada para medir a largura do zero como uma função do tempo. A percentagem de lacuna de fecho (zero) foi calculada como a percentagem da área livre de células remanescente em comparação com a área da ferida inicial. Dois experimentos independentes foram realizadas com um total de pelo menos 6 arranhões para cada linha de células.

proliferação celular Ensaios

ALVA31, PC3-ML (expressando miR-23b /-27b ou mexidos controle) e células LNCaP (transfectadas com antagomir-23b /ou controlar -27b antagomir) foram plaqueadas a uma densidade inicial de 10.000 células /poço numa placa de seis poços. Nos pontos de tempo indicados, as células foram tripsinizadas e as células viáveis ​​(aqueles que excluem o azul de tripano) foram contadas utilizando um hemocitómetro.

Matrigel Invasão Ensaios

Matrigel Invasão de Ensaio (BD Biosciences) foram realizados usando células ALVA31 e PC3-ML 72 horas após transdução com miR-23b /-27b ou mexidos células controle e LNCaP 72 horas após a transfecção com antagomir-23b /-27b ou controlar antagomir. 50.000 células foram privadas de soro durante 16 horas e em seguida semeadas para dentro da câmara de cima do aparelho da membrana Transwell com Matrigel revestido (24 inserção bem, tamanho de poro 8 mm). Meio suplementado com 10% de FBS foi usado como quimioatractor. Após incubação a 37 ° C durante 48 horas, as câmaras superiores foram esfregadas com lã de algodão para remover as células não migratórias ou não invasivos. As células na superfície inferior da membrana foram então fixadas com metanol frio, coradas com 0,01% de violeta de cristal e contadas sob um microscópio.

agar mole Ensaios

Os ensaios de agar mole foram realizados em ou ALVA31 células PC3-ML 72 horas após transdução com miR-23b /-27b ou mexidos controle. Anchorage-independente de crescimento foi avaliada como previamente descrito [26]

Rac1 Actividade Ensaios

Rac1 ensaios de actividade foram realizados em ALVA31 ou células PC3-ML 72 horas após transdução com o miR-23b /. – 27b ou mexidos controle. GTP-bound Rac1 foi separada a partir de PIB-Rac1 usando uma abordagem suspenso como descrito anteriormente [19]. Em resumo, os lisados ​​celulares foram incubados com 200 mg /ml de PBD-GST [domínio de ligação de p21, PBD, do efector PAK Rac1 /Cdc42 (quinase activada por p21)]. GTP-Rac1 foi recuperado após incubação com esférulas de glutationa-agarose. Os complexos foram recolhidos, desnaturados e resolvidos por SDS-PAGE. Rac1 activa foi detectada por transferência Western com anticorpos anti-Rac1 (Millipore). Um total de 5% do ligado original também foi analisada por imunotransferência para determinar os níveis totais de Rac1 (PIB-e GTP-bound).

Resultados

miR-23b /-27b Suprime Motilidade , Invasion e Anchorage independente crescimento de células cancerosas da próstata resistente à castração

Dada a correlação inversa entre o miR-23b /expressão -27b e fenótipo maligno de câncer de próstata humana, procurou-se avaliar o papel anti-neoplásica potencial (s) para este conjunto de miARN. Para esse fim, o miR-23b /cluster -27b foi ectopicamente expressa usando um vector lentiviral (também que codifica GFP) em duas linhas independentes altamente agressivos resistente à castração células de cancro da próstata, PC3 e ALVA31-ML. 72 horas após a transdução, as células foram analisadas quanto à expressão de GFP por citometria de fluxo, a fim de determinar a eficiência de transdução para cada experiência (S1). As experiências foram realizadas apenas quando maior do que 95% das células expressaram a GFP. Uma vez que o miR-27b está localizada a 3 ‘para miR-23b, que monitorizada níveis de miR-27b por qPCR transcriptase reversa seguindo transdução com lentivírus que codificam este aglomerado miARN ou um controlo de miARN não específicas (dados não mostrados). A transdução com o miR-23b /vetor lentiviral -27b resultou em níveis de miR-27b comparáveis ​​àqueles encontrados naturalmente em células MCF7, que serviu como um controlo positivo para o miR-27b [27]. Alternativamente, o miR-23b /-27b foi inibida na linha LNCaP dependente de androgénios usando antagomirs, que são oligonucleótidos sintéticos complementares para a miARN alvo que levam à clivagem da correspondente miARN (S2).

Para determinar se miR-23b /-27b regula processos metastáticos celulares, foram analisados ​​os efeitos da alteração miR-23b expressão /-27b na motilidade celular resistente à castração e migração. Utilizando raspadinha ensaios, verificou-se que a expressão ectópica de miR-23b /-27b na linha CRPC, ALVA31 diminuição da motilidade celular a cerca de 2 vezes após apenas 4 horas (Figura 1A). Por outro lado, a inibição da endógena miR-23b expressão /-27b em células LNCaP, que têm relativamente elevados níveis endógenos destes miARNs e exibem pouca mobilidade, resultou em mais do que duas vezes maior motilidade em comparação com células de controlo antagomir-transfectadas (Figura 1B ).

-27b expressão diminui a migração de células de câncer de próstata resistente à castração, enquanto a inibição de miR-23b /-27b aumenta a migração de células de câncer de próstata andrógeno-dependentes. Os ensaios de raspadinhas foram realizados em células que expressam ALVA31 miR-23b /-27b ou mexidos células LNCaP de controlo (A) e transfectadas com 50 nM antagomir-23b-27b ou controlar antagomir (B). Imagens das zonas limpas (imagens representativas mostradas à direita) foram tomadas antes e depois de uma hora de incubação de 4 e as áreas desmatadas medida usando software Imagem J. A percentagem média de fecho de lacuna (± SD) (devido à migração de células) é mostrado por duas experiências independentes a partir de 7 arranhões (a) e 6 arranhões (b) (*** p 0,001).

Em seguida, determinar se o miR-23b /expressão -27b afetados capacidade de invasão das células resistente à castração, utilizando câmaras de invasão de Matrigel. células privadas de soro foram adicionados às câmaras superiores do Transwell e os números de células invasoras através da barreira de Matrigel em resposta ao quimioatraente (soro) durante um período de tempo de 48 h foram avaliados. Introdução de miR-23b /-27b em ALVA31 e células PC3-ML diminuiu significativamente o número de células invasoras por mais do que 2 vezes (Figura 2A e B). Em contraste, a depleção de actividade miR-23b /-27b na linha celular LNCaP dependente de androgénios menos agressivo aumentou significativamente a invasão de células (Figura 2C).

-27b expressão diminui a capacidade de invasão de células de cancro da próstata resistente à castração enquanto que a inibição de miR-23b /-27b em células de câncer de próstata andrógeno-dependentes aumenta capacidade de invasão. A invasão de Matrigel, ensaios foram realizados em células ALVA31 (A) e células PC3-ML (B) que expressam o miR-23b /-27b ou mexidos células transduzidas de controlo. painéis superiores mostram regiões representativas dos filtros câmara com as células marcadas com violeta de cristal. A mudança de dobragem (± SEM) representa o número de células invadidas por câmara dividido pelo controlo de três experiências independentes realizadas em triplicado para A e os meios (± DP) de uma experiência independente feito em triplicado para B (*** P 0,001 ). C, as células LNCaP foram transfectadas com 50 nM de controle antagomir ou antagomir-23b /-27b. Os ensaios de invasão de Matrigel foram realizadas 72 horas após a transfecção, como explicado acima. Os meios (± SD) de duas experiências independentes realizadas em triplicado são mostradas (*** P 0,001).

Além de migração e invasão, células de carcinoma metastático adquirem frequentemente a capacidade de crescer em de forma independente de ancoragem, resistindo anoikis. Por isso, nós ensaiou-se os efeitos da expressão de miR-23b /-27b sobre a sobrevivência de células de cancro da próstata em agar mole. células ALVA31 e PC3-ML (miR-23b /-27b expressar e mexidos controle transduzidas) foram semeadas em meios de baixa fixação (ágar mole) e sobrevivência das colónias foi avaliada 2-4 semanas após o plaqueamento. A formação de colónias foi significativamente prejudicada nos ALVA31 e linhas de células P3-ML expressando o miR-23b /-27b em comparação com os controlos mexidos (Figura 3). Estes dados sugerem fortemente que o miR-23b /-27b expressão confere sensibilidade anoikis para células de cancro da próstata resistente à castração agressivos.

-27b diminui ancoragem de crescimento independente de linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração. Os ensaios de agar mole foram realizados em células PC3 ALVA31 e ML-expressando o miR-23b /-27b ou transduzidas com controlo scrambled (** P 0,01). O número médio de colónias (± SEM) por placa a partir de duas experiências independentes realizadas em triplicado para cada linha de células é mostrada (** P 0,01).

Curiosamente, a sobre-expressão de miR-23b /- 27b nas linhas de células resistente à castração, ALVA31 e P3-ML, não afectou de forma significativa a proliferação celular (Figura 4A e B). Além disso, a inibição destes miRs em células de cancro de próstata LNCaP dependente de androgénios, também não afecta as taxas de proliferação (Figura 4C). Estes resultados sugerem que o miR-23b /cluster -27b pode desempenhar um papel-chave no processo de metástase, como indicado pelas fenótipos observados em ensaios de invasão, migração e anoikis. No entanto, as alterações no nível do miR-23b cluster /-27b não teve nenhum efeito sobre a proliferação de linhas de células de cancro da próstata.

-27b não regular a proliferação de células de cancro da próstata. A e B, a proliferação de células que expressam o miR-23b /-27b foi comparada com a de células transduzidas de controlo codificados. O número médio de células (± SEM) de um total de três experiências independentes realizadas em triplicado é mostrado para ALVA31 células e do número médio de células (± DP) de uma experiência representativa realizada em triplicado é mostrado para células PC3-ML. C, a proliferação de células LNCaP transfectadas com antagomir-23b /-27b ou controlar antagomir foi avaliada. O número de células média (± SD) de dois experimentos independentes realizadas em triplicado é mostrado.

A expressão ectópica de miR-23b /-27b marcadamente aumenta os níveis de proteína E-caderina e reduz Rac1 Atividade

Para entender os mecanismos moleculares de miR-23b /-27b inibição mediada de fenótipos metastáticos, examinamos a expressão de factores-chave na migração de células cancerosas e invasão. Normalmente, migração e invasão das células tumorais é promovido pela perda da interação de junções aderentes com o citoesqueleto e alterações posteriores nas actividades das pequenas GTPases da família Rho como Rac1 e Cdc42 [28]. Descobrimos que a expressão ectópica de miR-23b /-27b resultou em um aumento marcado dos níveis da proteína E-caderina em ambas as células PC3-ML ALVA31 e. Por outro lado, a inibição de miR-23b /-27b em células LNCaP resultou na diminuição dos níveis de E-caderina (Figura 5).

-27b significativamente aumenta a expressão de E-caderina em linhas celulares resistentes ao castração. células ALVA31 ou PC3-ML expressam miR-23b /-27b ou transduzidas com células LNCaP controlo mexidos e transfectadas com antagomir-23b /ou controlar -27b antagomir foram sujeitos a transferência Western para a E-caderina e actina. blots representativos são apresentados de um total de 2-6 experiências.

Rac1 actividade está associada com e parece ser essencial para o fenótipo metastático de cancro da próstata, bem como, outros cancros epiteliais [19] , [29]. Rac1 actividade endógena promove o crescimento independente de ancoragem e é necessária para o comportamento invasivo da linha celular PC3 CRPC [29]. Por estas razões, nós determinamos se a expressão ectópica de miR-23b /-27b em células de câncer de próstata agressivo afetaram a atividade de Rac1. Introdução de miR-23b /-27b em ALVA31 e PC3-ML, ambos os quais têm alta actividade Rac1 endógeno [19], atenuou significativamente a actividade Rac1 sem afectar os níveis totais Rac1 (Figura 6). Tomados em conjunto, estes dados fornecem uma visão mecanicista para o papel de miR-23b /-27b na supressão de fenótipos metastáticos.

-27b diminui significativamente a atividade Rac1, mas não os níveis totais de Rac1 em linhas celulares de cancro da próstata resistente à castração. Os ensaios de actividade foram realizados em Rac1 ALVA31 (A) e células PC3-ML (B) expressar o miR-23b /-27b ou transduzidas com controlo scrambled. GTP-bound Rac1 foi separada a partir de PIB-Rac1 utilizando um ensaio de suspenso, tal como descrito em Materiais e Métodos. Complexos contendo GTP-Rac1 (Rac1 activa) foram recolhidas, desnaturados e resolvidos por SDS-PAGE seguido por Western blot com anticorpos anti-Rac1. Total Rac1 (PIB-e ligada a GTP) representa 5% do lisado de célula original. Actina foi utilizado como um controlo de carga. Quantificação de três experiências independentes é mostrada com barras de erro representam SEM (* P 0,05), (** P 0,01).

Discussão

MIRs modular uma ampla variedade de biológico e processos patológicos incluindo a cascata metastática. Mais de um mil miRs são codificadas no genoma humano e a elucidação das suas funções é uma área importante de investigação [6]. Uma vez que muitos miRs têm papéis em apoptose e mitogênese [30] sua contribuição potencial para a metástase pode ser difícil de discernir. Mostramos aqui que miR-23b /-27b suprimida migração e invasão das células cancerosas da próstata agressivo sem exercer influências de confusão sobre a proliferação celular. MIRs com estes tipos de características são descritos como candidato “metástase” eliminadores de [6], [31].

A capacidade das células tumorais para neutralizar anoikis, migrar e invadem requer a obtenção de múltiplas características moleculares [32] . Os nossos dados mostram que a expressão ectópica de miR-23b /-27b em linhagens de células metastáticas CRPC, ALVA31 e PC3-ML, resultou num crescimento diminuído em agar mole, bem como diminuiu a migração celular e invasão. Por outro lado, a inibição de miR-23b /-27b na linha celular de cancro da próstata dependente de androgénios, LNCaP, resultou na migração de células e reforçada invasão. Para que as células epiteliais do tumor de invadir e migrar, a integridade do epitélio e da membrana basal devem ser interrompidos permitindo que as células para ter acesso ao estroma subjacente. Este processo exige a interrupção de contactos célula-célula do epitélio, o que pode ocorrer por meio de diminuição dos níveis de moléculas de adesão celular, tais como a E-caderina. Expressão de miR-23b /-27b aumento dos níveis de proteína E-caderina em duas linhas celulares independentes CRPC; Por outro lado a inibição de miR-23b /-27b em uma linha de células de cancro de próstata dependente de androgénios menos agressiva, LNCaP, resultou numa diminuição dos níveis de E-caderina.

Perda da molécula de adesão celular E-caderina na próstata amostras de pacientes com câncer está fortemente associada com o comportamento metastático e mau prognóstico clínico [14], [15], [18]. Estes estudos suportam a desregulamentação E-caderina como um evento crítico na progressão do cancro da próstata e são consistentes com os nossos achados que miR-23b /-27b-expressão resultou em aumento dos níveis de E-caderina e uma diminuição na traços metastáticos. A base molecular para up-regulação da E-caderina em miR-23b /27b expressando células de câncer de próstata é desconhecida. Enquanto nós especulamos que este efeito é devido a miR-23b /-27b mediada inibição (direto ou indireto) de um ou vários dos repressores de transcrição-caderina E conhecidas [33] – [35], não observamos evidências consistentes de repressão da torção repressores e-caderina, Slug, Caracol, Zeb1 ou Zeb2 em linhas celulares CRPC superexpressam miR-23b /-27b (dados não mostrados). Estes achados sugerem o possível envolvimento de outros repressores e /ou que o miR-23b /-27b mediada a regulação da caderina-E ocorre através de um mecanismo mais complexo (s).

O processo metastático não só envolve a perda de adesões célula-célula mas também as células de tumor deve adquirir a capacidade para migrar, a fim de colonizar locais distantes. O Rho GTPase Rac1 regula rearranjo do citoesqueleto de actina necessária para a migração celular. A sobre-expressão de Rac1 está associado a um risco aumentado de metastático da próstata e outros tipos de cancro epiteliais [36] – [38]. actividade elevada Rac1 ocorre em CRPC, promove resistente à castração, bem como, o crescimento independente de ancoragem e é necessária para o comportamento invasivo da linha celular PC3 CRPC [19], [21]. Uma variedade de activadores de Rac1 têm demonstrado ser importante na progressão do cancro da próstata ou na aquisição de um fenótipo invasivo. Por exemplo, nós e outros demonstraram a importância dos factores de troca de nucleótidos de guanina (Rho GEFs) na progressão da CRPC [21], [22], [26], [39]. Além disso, o aumento da expressão de certos Rac1 GEFs correlaciona com o aumento da recorrência bioquímica [22] e diminuição da sobrevida livre de doença em pacientes com câncer de próstata [40]. Proteínas que diminuem a actividade Rac1 através da hidrólise de GTP, GTPase ativando proteínas (BPA), atuam como supressores de tumor [41]. Apesar de miR-23b /-27b não afetou níveis do total Rac1, introdução destes miRs em ALVA31 e células PC3-ML níveis reduzidos de ativo Rac1 (ligada a GTP). Por conseguinte, presume-se que o miR-23-b /27-b deve inibir um ou mais dos muitos activadores a montante de Rac1 ou indirectamente aumentar a proteínas inibidoras Rac1.

Enquanto expressão de miR-23b /-27b a redução mediada da atividade Rac1 e resultou num aumento dos níveis de proteína caderina-e, estes efeitos são suspeitos de ser indireta. Desde miRs individuais muitas vezes regular numerosos genes-alvo, miR-23b /-27b pode reprimir alvos múltiplos e redes que, em última instância resultar em grandes mudanças fenotípicas que observamos. Um certo número de genes de miR-23b e alvo de miR-27b foram identificadas em outros tipos de células de cancro em que estes são expressos diferencialmente miRs em comparação com o tecido normal, incluindo da mama, fígado e pulmão [42] – [50]. No entanto, uma vez que muitas das proteínas codificadas por estes genes alvos estão envolvidas na regulação da proliferação celular, prevemos que estes genes não representam os alvos relevantes em células de cancro da próstata. Além disso, foram identificados numerosos alvos candidatos computacionalmente previstos de miR-23b /-27b que estão ligados a Rac1 de sinalização e regulação da caderina-E, incluindo PI3-quinase, MAPK, TGF-Beta, Wnt, mTOR, Jak-STAT, toll-like e do receptor Notch entre outros. Dentro dessas redes de integração complexos, alvos de miR-23b /-27b podem convergir para regular a actividade Rac1 e E-caderina. Estamos buscando ativamente esses possíveis alvos. Além disso, será importante para delinear os papéis individuais dos dois miRs neste agrupamento de invasão e migração de células de cancro da próstata.

Desde metástases são responsáveis ​​pela mortalidade dos pacientes em quase todos os carcinomas humanos, a capacidade de miR-23b /-27b para impedir processos metastáticos poderia ser de valor clínico. Perda de miR-23b /-27b pode servir como um marcador de prognóstico para o câncer de próstata agressivo. Biomarkers que distinguem indolente de câncer de próstata agressivo são extremamente necessárias, e perda de miR-23b /-27b pode prever a doença metastática. Desde miRs também têm potencial uso como modalidades terapêuticas [51], miR-23b /-27b “imita” deve ser avaliada em modelos pré-clínicos de metástase de câncer de próstata.

Informações de Apoio

Deslize S1.

Avaliação da eficiência de transdução de ALVA31 e células PC3-ML. expressão GFP de ALVA31 (A) ou células PC3-ML (B) 72 horas após dois transduções sequenciais com os vetores lentivirais codificado-GFP pMIRNA-miR-23b /-27b ou lentivirais pMIRNA-mexidos (Sistemas de Biociências (SBI) Mountain View CA, EUA). expressão da GFP em células não transduzidas e transduzidas foi avaliada por análise FACS

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052106.s001

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Deslize S2.

níveis de miR-27b diminuir em células LNCaP transfectadas com antagomir-23b /-27b. As células LNCaP foram transfectadas com 50 nM antagomir-23b /ou controlar -27b antagomir. níveis de miR-27b foram determinados utilizando-PCR em tempo real de 72 horas após a transfecção. Os valores são o nível de miR-27b normalizado para U6 snRNA em células LNCaP transfectadas com controle antagomir

doi:. 10.1371 /journal.pone.0052106.s002

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Reconhecimentos

Agradecemos Drs. Balakrishna e Vinata Lokeshwar, Pedro Salas (Universidade de Miami Miller School of Medicine), Jennifer Richer (University of Colorado Health Sciences Center) para generosamente fornecer reagentes e conselhos. Agradecemos também o Dr. Seth Wander, Dekaung Zhao, Carol Maiorino, Dr. Leah Lyons, Dr. Fayi Wu, Stephanie Peacock e Cale Fahrenholtz (Universidade de Miami Miller School of Medicine) para aconselhamento e assistência.