Abstract

CHIP, uma proteína co-chaperona que interage com Hsc /Hsp70, tem demonstrou-se que sob-expresso em células de cancro do pâncreas e demonstrou um potencial propriedade supressora de tumor. No entanto, os mecanismos subjacentes da regulação CHIP em células de câncer de pâncreas permanecem desconhecidos. Neste estudo, descobrimos que miR-1178 diminuiu a tradução da proteína CHIP segmentação por região 3′-UTR. Observou-se que a sobre-expressão de miR-1178 facilitou a proliferação, G1 /S de transição, a migração e a invasão de células de cancro do pâncreas. Por outro lado, a inibição da expressão de miR-1178 suprimiu significativamente estes fenótipos. Além disso, CHIP sobre-expressão revogada miR-1178-induzida a proliferação celular e invasão. Nossos dados sugerem atos que miR-1178 como um oncomiR em células de cancro do pâncreas através da inibição da expressão CHIP

Citation:. Cao Z, Xu J, Huang H, Shen P, Você L, Zhou L, et al. (2015) MiR-1178 promove a proliferação, G1 /S de transição, migração e invasão das células do cancro do pâncreas por Segmentação CHIP. PLoS ONE 10 (1): e0116934. doi: 10.1371 /journal.pone.0116934

Editor do Academic: Jose G. Trevino, University of Florida, United States |

Recebido: 31 Julho, 2014; Aceito: 16 de dezembro de 2014; Publicação: 30 de janeiro de 2015

Direitos de autor: © 2015 Cao et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este estudo foi apoiado por subsídios da National Science Foundation Natural da China (No. 81.272.484), Pequim Natural Science Foundation (No. 7.132.179), Estado Maior Programa Básico de Pesquisa de Desenvolvimento da China (973 Programa, No. 2014CB542300), o Fundo especial de Investigação para Pública Indústria do Bem-Estar da Saúde (nº 201202007) e Science Programa Pillar tecnologia durante a Quinquenal de Reis Período do Plano (No. 2014BAI09B11). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de pâncreas é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos [1]. tratamentos existentes têm pouco efeito na melhoria da sobrevida em pacientes com câncer de pâncreas [2-4]. Explorando os mecanismos da tumorigênese, progressão e metástase de câncer de pâncreas e identificação de novos alvos terapêuticos são urgentemente necessários.

CHIP, uma proteína co-chaperona que interage com Hsc /Hsp70 [5], promove a ubiquitinação e degradação de numerosas proteínas relacionadas ao câncer cruciais, tais como NF-kB [6, 7], Met [8] e p53 [9-11]. Anteriormente, descobrimos que CHIP suprimiu a proliferação do câncer de pâncreas celular, crescimento independente de ancoragem, migração e invasão de mediar a degradação do EGFR. Um nível de baixa expressão de CHIP foi correlacionada com um prognóstico piora em pacientes com câncer de pâncreas [12]. No entanto, os mecanismos de regulação da expressão CHIP em células de câncer de pâncreas permanecem desconhecidos.

Os microRNAs (miRNAs) são pequenos, endógeno, não codificante moléculas de RNA com um papel importante na regulação pós-transcricional da expressão gênica [13 -16]. Guo J

et al

. [17] descobriram que miR-764-5p inibe a tradução de proteínas de CHIP em camundongos. No entanto, se miRNAs regulam a expressão CHIP em células cancerosas humanas não foi mostrado anteriormente.

No presente estudo, foi realizada uma

in silico

tela de miRNAs para identificar possíveis reguladores da expressão CHIP. Descobrimos que miR-1178 tem como alvo o 3′-UTR do mRNA CHIP e negativamente regula a tradução de CHIP. Além disso, a expressão de miR-1178 contribui para a proliferação de células do câncer de pâncreas, G1 /transição S, migração e invasão. Descobrimos também que os efeitos de miR-1178 são reversíveis pela sobre-expressão de CHIP. Nossos resultados sugerem que a expressão de miR-1178 acelera tumorigênese pancreático pela inibição direta de expressão CHIP.

Materiais e Métodos

linhas de células e reagentes

As linhas celulares de cancro pancreático humano BxPC-3, PANC-1, SW1990 e MiaPaCa-2 foram presentes de Dr. Freiss H (Universidade de Heidelberg, Heidelberg, Alemanha) [18, 19]. Estas linhas de células foram subcultivadas por menos de 6 meses após a reanimação. Não foi realizada reautorização. As células foram cultivadas em meio RPMI 1640 ou meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado com FBS a 10% (ambos os tipos de meio eram de HyClone, Utah, EUA), 100 UI /mL de penicilina, e 100 ug /mL de estreptomicina, numa incubadora humidificada com 5% de CO

2 a 37 ° C.

transfecção celular

células PANC-1 e BxPC-3 foram semeadas em placas de 6 poços, cultivadas durante a noite, e, em seguida, transfectadas com imita miR-1178, um inibidor de miR-1178, ou os seus controlos negativos correspondentes (todos do GenePharma, Xangai, China). Lipofectamine 2000 (Invitrogen, EUA) foi utilizado para transfecção de células de acordo com as instruções do fabricante. As células foram colhidas para análises adicionais após um período adicional de 48 horas de incubação.

Isolamento de ARN e quantitativo em tempo real de RT-PCR

O ARN total foi extraído de células transfectadas utilizando o reagente TRIzol (Invitrogen, EUA ) de acordo com as instruções do fabricante. A transcrição reversa foi realizada usando um kit de transcrição reversa (Promega, Madison, EUA). Os níveis de ARNm CHIP foram medidos por quantitativa PCR em tempo real (qRT-PCR) com o kit de SYBR Green PCR (Takara, Japão). Os níveis de expressão de madura miR-1178 foram quantificados por miR-qRT PCR utilizando o Hairpin-lo miARN qPCR Quantificação Kit (GenePharma, Xangai, China), que continha um iniciador de RT-estrutura haste-laçada como e iniciadores de PCR específicos para os diferentes miARNs ou para o controlo interno U6 ARN. As análises foram realizadas no StepOne-Plus Real-Time System Applied Biosystems PCR (Life Technologies, South San Francisco, EUA). Dobram mudanças foram calculados utilizando o método -ΔΔCT 2

. Os iniciadores inversos para GAPDH e chip foram sintetizados pela Invitrogen (EUA). As sequências dos iniciadores são mostrados na Tabela S1. A expressão de miR-1178 foi considerada elevada quando o nível de expressão foi igual ou acima da mediana da coorte e baixo quando o nível foi inferior à mediana da coorte. O qRT-PCR análises foram repetidas pelo menos 3 vezes.

análises de Western blot

Depois de 48 horas de transfecção em placas de 6 poços, as células foram lisadas com tampão RIPA (Applygen, Pequim, China ). Os lisados ​​foram desnaturados com tampão de sulfato de dodecilo de sódio (SDS) de uma amostra a 100 ° C durante 5 minutos e separadas por electroforese em gel de poliacrilamida com SDS (SDS-PAGE), seguida por transferência de difluoreto de polivinilideno (PVDF) membranas (Millipore, MA, EUA). Após o bloqueio com leite seco não gordo a 5% à temperatura ambiente durante 1 h, as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com os anticorpos primários. Os anticorpos estão apresentados na Tabela S2. Depois de se lavar com TBST, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários (Applygen, Pequim) à temperatura ambiente durante 1 hora. As bandas de proteína foram visualizadas com o sistema de detecção de electroquimioluminescência (ECL), e os níveis de expressão das proteínas foram avaliadas usando o programa Image-Pro Plus 6.0 (Media Cybernetics, EUA). As análises de Western blot foram repetidas pelo menos 3 vezes.

proliferação celular ensaio

A proliferação celular foi analisada utilizando um kit de contagem de células (CCK-8) (Dojindo, Japão). PANC-1 (4 × 10

5 células /poço) e BxPC-3 (5 × 10

5 células /) assim as células foram transfectadas em placas de 6 poços. Após 24 horas, as células foram recolhidas e semeadas em placas de 96 poços (1000 células /poço). A proliferação celular foi medida todos os dias durante 4 dias. Em cada ponto de tempo, 10 ul /cavidade foi adicionado CCK-8 reagente, e as células foram incubadas durante 2,5 horas a 37 ° C. A densidade óptica (OD) foi medida a 450 nm e 630 nm por um leitor de microplacas (Wellscan MK3, Thermo Labsystems, Finlândia). O ensaio CCK-8 foi repetido 3 vezes com seis repetições

A migração celular e invasão ensaio

A migração celular e invasão foram avaliadas utilizando câmaras de migração Transwell (tamanho de poro de 8 um; Corning, EUA). . As membranas para o ensaio de invasão foram revestidas com uma solução diluída de ECM (Sigma-Aldrich, Xangai, China). PANC-1 (2 × 10

4 células /cavidade) ou BxPC-3 (4 × 10

4 células bem /) As células foram semeadas na porção superior de uma câmara com meio isento de soro após a transfecção. Meio contendo 10% de FBS serviram como um quimioatractivo na cara inferior. Após 48 horas de incubação a 37 ° C, as células não invadidos sobre o topo da membrana foram raspadas e removido por cotonetes de algodão, e as células invadidas foram lavadas com PBS, fixadas com álcool etílico a 90%, coradas com hematoxilina e, em seguida, contados usando microscopia de luz. O ensaio de migração e invasão foi repetido 3 vezes com cavidades em duplicado.

ciclo celular análise

Para o ensaio do ciclo celular, as células foram colhidas 48 horas após a transfecção e fixadas em 70% de etanol a 4 ° C durante a noite. Depois de lavar duas vezes com PBS, as células foram incubadas com 30 ug /iodeto de propídio mL (PI), 0,2 mg /ml de RNase A, e 0,2% de Triton X-100 (todos de Sigma-Aldrich, EUA) a 37 ° C durante 30 minutos. As células foram depois analisadas por citometria de fluxo (BD Biosciences, EUA).

Dual-Luciferase Assay

Para avaliar se chip é um alvo directo de miR-1178, o ensaio foi PMIR-RELATÓRIO usava. Os vectores CHIP 3′-UTR, contendo o tipo selvagem ou uma sequência de sementes mutadas foram construídos por e comprada a partir GenePharma (Xangai, China). células PANC-1 foram semeadas em placas de 12 poços (1 × 10

5 células /poço) e co-transfectadas com o tipo selvagem ou mutante e imita vector 50 nM miR-1178 ou imita NC utilizando Lipofectamine 2000. No 24 h após a transfecção, a actividade de luciferase foi medida utilizando o Repórter dual-luciferase Assay System (Promega, EUA) de acordo com o protocolo do fabricante.

a análise estatística

SPSS v. 13.0 (SPSS, Inc., Chicago, IL) foi utilizado para as análises estatísticas. Os dados contínuos são apresentados como a média ± desvio padrão (SD) e foram comparadas pelo teste t de Student ou o teste exato de Fisher.

P Art 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

Resultados

CHIP é um alvo direto de miR-1178

Para identificar reguladores da expressão CHIP, foi utilizado o software de acesso aberto TargetScan. De acordo com a previsão de TargetScan, miR-1178 foi identificado como um possível regulador de expressão CHIP. Descobrimos que a expressão de miR-1178 variou entre 4 linhas de células de cancro pancreático humano, incluindo SW1990, BxPC-3, MiaPaCa-2, e PANC-1, em que o nível de expressão relativa de miR-1178 foi de 0,568 ± 0,12, 1,04 ± 0,05, 1,51 ± 0,07 e 0,87 ± 0,09, respectivamente (Figura 1A;.

P

0,01). As células PANC-1 e BxPC-3, que tinha expressão moderada de miR-1178, foram usadas durante todo o resto do estudo.

(A), a expressão de miR-1178 variou entre 4 linhas de células de cancro pancreático humano. (B) o sítio de ligação A miR-1178 dentro da 3’UTR do CHIP foi prevista por TargetScan. (C) em células PANC-1, imita o miR-1178 reprimiu a actividade da luciferase do repórter contendo o tipo selvagem CHIP 3′-UTR, mas não a uma contendo um mutante de 3′-UTR. (D) Os níveis de expressão foram CHIP detectado por Western blot após células PANC-1 e BxPC-3 foram transfectadas com os imitadores de miR-1178 ou o inibidor. β-actina foi utilizado como um controlo interno. (E) Transfecção com os imitadores de miR-1178 não suprimiu a expressão de ARNm de CHIP. Os dados estão apresentados como médias ± DP. *

P

P

Para determinar se CHIP é um alvo direto de miR-1178, o 3′-UTR do chip com o tipo selvagem ou sítios de reconhecimento da sequência de sementes mutantes foi clonado num repórter de luciferase dupla (Fig. 1B). Descobrimos que a actividade da luciferase foi diminuída após a co-transfecção dos imita o miR-1178 com o vector do tipo selvagem, em comparação com a co-transfecção dos imita o miR-1178 com o vector mutante (

P

0,05 ) (Fig. 1C). Nós ainda avaliados os níveis de mRNA e de proteína de CHIP depois de alterar a expressão de miR-1178. Os resultados mostraram que a sobre-expressão de miR-1178 diminuíram significativamente a expressão da proteína CHIP sem afectar a expressão de ARNm CHIP, em comparação com o controlo. Em contraste, a regulação negativa da expressão da proteína CHIP miR-1178 aumentou (Fig. 1D, E). Estes dados indicam que o miR-1178 pode atingir diretamente a região semente CHIP previsto.

O miR-1178 promoveu o crescimento e G1 /S de transição de PANC1 e células BxPC-3

Para explorar a função de miR-1178 em câncer pancreático, foram utilizados imita miR-1178 e inibidor de miR-1178. Após a transfecção com os imitadores de miR-1178 ou o inibidor, a expressão de miR-1178 foi significativamente regulada para cima ou para baixo-regulado, respectivamente (Fig. 2A). Um ensaio CCK-8 mostrou que as taxas de proliferação de células PANC-1 e BxPC-3 foram aumentados após o miR-1178 sobre-expressão. Em contraste, o miR-1178 inibiu a regulação negativa da proliferação de células de cancro do pâncreas (Fig. 2B). Além disso, a sobre-regulação de miR-promovido a 1178 /S transição G1 ponto de verificação em ambos PANC-1 (fase S 30,17 ± 1,31% vs 39,31 ± 1,51%,

P

0,01) e BxPC- 3 (fase S 29,89 ± 1,56% vs 42,57 ± 3,74%,

P

0,05), as células, enquanto a sub-regulação de miR-1178 levou a um alongamento da fase G1 (Fig. 2C) .

(a) qRT-PCR mostraram que, após a transfecção de células com os imitadores de miR-1178 ou o inibidor, a expressão de miR-1178 foi significativamente regulada para cima ou para baixo-regulado, respectivamente. (B) Um ensaio de CCK-8 mostrou que o miR-1178 sobre-expressão promoveu a proliferação de PANC-1 e BxPC-3 células, enquanto a sub-regulação de miR-1178 suprimiu a proliferação celular. (C) A sobre-regulação de miR-1178 facilitou a /G1 S transição em PANC-1 e BxPC-3 células. Em contraste, foi observada uma G1 /S do ciclo celular após a prisão de inibição de miR-1178. Os dados são apresentados como médias ± DP. *

P

P Art 0. 01.

O miR-1178 acelerou a migração e de células de câncer pancreático invasão

Um ensaio Transwell foi realizada para determinar o papel de miR-1178 na migração de células do cancro do pâncreas e da invasão. A expressão sobre-de miR-1178 aumentou o número de células PANC-1 que penetrou a membrana revestida de ECM. Em contraste, a capacidade de invasão de células PANC-1 foi significativamente diminuída quando a expressão de miR-1178 foi suprimida. Resultados semelhantes foram observados em células BxPC-3 (Fig. 3a). De acordo com esta conclusão, a capacidade migratória destas duas linhas de células foram também reforçada após as células foram tratadas com os imitadores de miR-1178, enquanto que os resultados opostos foram observadas quando as células foram tratadas com o inibidor de miR-1178 (Fig. 3B ).

a migração celular e invasão foram analisados ​​em transwells contendo membranas com ou sem Matrigel. As células que tinham migrado ou invadido para a superfície inferior da membrana foram coradas com hematoxilina e eosina e contados ao microscópio a uma ampliação de 100 x. (A) A sobre-regulação de miR-1178 por transfecção das imita melhoradas invasão de células, enquanto que o miR-1178 sub-regulação dissuadido invasão celular. (B) Sobre-expressão de miR-promovido 1178 a migração de células, enquanto a sub-regulação de miR-1178 inibiu a migração de células. *

P

P Art 0,01.

As vias de sinalização a jusante de

miR-1178

Em nosso estudo anterior, demonstramos que CHIP é um romance supressor tumoral no câncer de pâncreas através da degradação do EGFR. Dada a nossa observação de que miR-1178-regulada a expressão de CHIP, temos a hipótese de que o miR-1178 também pode regular a actividade de EGFR e sua cascata de sinalização a jusante. Descobrimos que a expressão excessiva do miR-1178 aumentou o nível de proteína EGFR e activou a via de jusante AKT /p21 e a via de Src /E-caderina (Fig. 4A). Em contraste, a inibição de miR-1178 teve efeitos opostos (Fig. 4B). Muitos estudos têm indicado que o EGFR /AKT /p21 e EGFR vias /SRC /E-caderina desempenham papéis fundamentais na proliferação, controle do ciclo celular, migração e invasão das células cancerosas pancreáticas [20-23]. Assim, nós especulamos que a ativação ectópica do EGFR /AKT /p21 e EGFR vias /SRC /E-caderina pode parcialmente explicar os efeitos de miR-1178 em células de câncer de pâncreas.

(A, B) os níveis de expressão de EGFR, p-AKT, AKT, p21, p-SRC, SRC e e-caderina foram detectadas por western blot após células PANC-1 e BxPC-3 foram transfectadas com os imitadores de miR-1178 ou o inibidor. β-actina foi utilizada como um controlo interno.

Sobre-expressão de CHIP revogada induzida por miR-1178 proliferação, G1 /transição S, migração e invasão das células cancerosas pancreáticas

para verificar ainda se miR-1178 promove um fenótipo maligno reprimindo CHIP em células de câncer de pâncreas, adotamos uma estratégia de “resgate” para examinar a relevância funcional do miR-1178 /interação CHIP. O pcDNA-chip ou o vazio vector pcDNA foi transfectado em células PANC-1 sobre-expressão de miR-1178. Como mostrado na Fig. 5A, o nível de chip foi aumentada quando pcDNA-chip foi transfectada. Além disso, a sobre-expressão de CHIP inibiu a expressão induzida por miR-1178 de EGFR, AKT-p e p-SRC. De acordo com a inactivação do EGFR e das suas vias de jusante, invasão celular, migração (Fig. 5B), de proliferação (Fig. 5C) e transição G1 /S (Fig. 5D) foram todos suprimida. Estes resultados indicam que o miR-1178 promove a proliferação celular, G1 /transição S, migração e invasão através da regulação negativa de CHIP.

(A) Análise de Western blot de CHIP, EGR, AKT, p21, SRC e a expressão da e-caderina nas células PANC-1 que foram co-transfectadas com pcDNA-chip ou vector vazio pcDNA e os imitadores de miR-1178. β-actina também foi detectado como um controlo interno. (B) Análise Transwell de células PANC-1 depois de ambos os co-transfecções. (C) As curvas de crescimento de células PANC-1 após a co-transfecção. (D) A percentagem de células em cada fase do ciclo celular foi calculada por análise de células activadas por fluorescência (FACS). *

P Art 0. 05, **

P Art 0. 01.

Discussão

Neste estudo, nós mostramos que o miR-1178 como alvo o 3′-UTR do mRNA CHIP, resultando na inibição da tradução da proteína CHIP. MiR-1178 facilitou a proliferação de células do câncer de pâncreas, G1 /transição S, migração e invasão ao reprimir a expressão CHIP. Concluímos que o miR-1178 é um atenuador de expressão endógena chip que promove um fenótipo maligno de células de cancro do pâncreas.

O terminal carboxilo da proteína Hsp70-interagindo (chip) é um membro de ubiquitina ligase E3, funcionando como uma ligação entre o acompanhante (proteína de choque térmico 70/90) e sistemas de proteassoma. Chip tem sido demonstrado estar envolvida na tumorigénese, proliferação e invasão de várias malignidades [24], regulação de um número de proteínas oncogénicas incluindo hipoxia-inducible factor 1α (HIF-1α) [25], receptor de estrogénio α (ERa) [ ,,,0],26], e telomerase humana transcriptase [27 inverter]. Nós já descobriram que CHIP serviu como um romance supressor de tumor por via EGFR-regulação para baixo em células de câncer de pâncreas. A expressão de chip foi diminuída em tecidos de cancro pancreático [13]. No entanto, o mecanismo de CHIP baixa expressão ainda precisa de mais investigações.

Apesar de cada vez mais provas indicou que CHIP desempenha um papel importante em cancros [6, 28-30], os mecanismos de regulação CHIP permaneceu mal compreendida. Até agora, havia apenas dois estudos publicados voltados para os mecanismos de regulação a montante da CHIP. Shimamoto S

et al

. [31] relatou que Ca (2 +) /bind S100 ao domínio TPR e agir como reguladores a montante de CHIP. Guo J

et al

. [17] mostrou que o miR-764-5p reprimido tradução da proteína CHIP em ratinhos através da ligação a da 3′-UTR do mRNA CHIP. No entanto, se miRNAs poderia regular a expressão CHIP em células cancerosas humanas não tinha sido previamente determinada. Nossa tela de miRNA usando software TargetScan previu que CHIP pode ser um dos alvos a jusante de miR-1178. Para confirmar esta previsão, foi realizado um ensaio de repórter luciferase. Descobrimos que a actividade da luciferase foi drasticamente diminuída após a co-transfecção dos imita o miR-1178 com o vector expressando o tipo selvagem CHIP 3′-UTR, em comparação com a co-transfecção dos imita com o vector que expressa um chip mutado 3′-UTR . A análise por Western blot demonstrou ainda que a sobre-expressão de miR-1178 expressão da proteína CHIP suprimida. Em contraste, a regulação negativa de miR-1178 aumentou o nível de proteína CHIP. Estes resultados sugerem que o miR-1178 tem como alvo directamente o 3′-UTR do mRNA chip para inibir a tradução de proteína CHIP. Tanto quanto sabemos, esta foi a primeira vez que um miRNA que pode inibir a expressão da proteína CHIP foi descoberto em linhas de células humanas.

A evidência crescente mostrou que miRNAs podem ter tanto supressora de tumor [32-34 ] e oncogênico [35, 36] características em células de câncer de pâncreas. No entanto, os estudos concentra-se nas funções de miR-1178 não são relatados. Em nosso estudo anterior [12], descobrimos que CHIP suprimida pancreático de células de câncer proliferação, migração e invasão. Nós, portanto, a hipótese de que o miR-1178 pode induzir o crescimento de células de câncer de pâncreas, migração e invasão. Esta hipótese foi apoiada por nossas observações. Nossos dados demonstram que miR-1178 sobre-expressão facilitou a proliferação de células do câncer de pâncreas, G1 /transição S, migração e invasão. Em contraste, a inibição de miR-1178 suprimiu estes processos. Nossos resultados sugerem atos que miR-1178 como um oncomiR durante tumorigênese do câncer de pâncreas, pela primeira vez.

O câncer de pâncreas apresenta uma variedade de alterações moleculares que levam as células cancerosas não só para sobreviver, mas também para invadir os tecidos circundantes e metastizar para locais distantes. A alteração mais comum envolve o gene do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Li Y

et al

. [37] mostrou que o miR-146a inibe a capacidade invasiva de células PDAC diretamente pela segmentação do EGFR. Croce CM [38] relataram que o miR-21 estimulado via EGFR e aumentou o crescimento das células PDAC independentes de degradação de PTEN. Porque o nosso estudo anterior mostrou que CHIP é um regulador pós-translacional novela de EGFR [12], que argumentou que miR-1178 também pode regular a actividade de EGFR e sua cascata de sinalização a jusante. Neste estudo mostramos que o miR-1178 sobre-expressão aumentou o nível de proteína EGFR e activou a via de jusante AKT /p21 e a via de Src /E-caderina. Em contraste, a inibição de miR-1178 teve efeitos opostos. A activação de AKT /p21 e de sinalização /E-caderina Src tem sido referida como estando envolvida na proliferação, controlo do ciclo celular, a migração e a invasão de células cancerígenas pancreáticas [20-22, 28]. Estes resultados indicam que a ativação ectópica do EGFR /AKT /p21 e EGFR vias /SRC /E-caderina pode parcialmente explicar os efeitos de miR-1178 em células de câncer de pâncreas.

Para verificar as funções se miR-1178 como um oncomiR reprimindo CHIP, uma estratégia de “resgate” foi adotado para examinar a relevância funcional do miR-1178 /interação CHIP. Os nossos resultados mostraram que a sobre-expressão de CHIP inibiu a expressão induzida por miR-1178 de EGFR, AKT-p e p-SRC. De acordo com a inactivação do EGFR e das suas vias a jusante, a proliferação celular, G1 /S de transição, migração e invasão também tiveram uma diminuição. Assim, concluímos que o up-regulada via EGFR e facilitação de tumorigênese por miR-1178 pode ser devido à diminuição da expressão CHIP em células de câncer de pâncreas.

Em geral,

in vitro

dados são não é suficiente para fazer inferências clinicamente relevantes em câncer pancreático [39], especialmente em relação as correlações entre a expressão de miR-1178 e as características clínico-patológicas. Em nosso estudo mais aprofundado, vamos investigar as funções biológicas de miR-1178 em PDX (xenotransplantes derivados do paciente) de câncer de pâncreas. Além disso, será avaliada a expressão de miR-1178 em tecidos de câncer de pâncreas para investigar a correlação entre a expressão e características clínicas miR-1178 de pacientes com câncer pancreático.

Conclusão

Em conclusão , o presente estudo demonstrou que o miR-promovido 1178 pancreático proliferação de células cancerosas, G1 /S de transição, migração e invasão por meio da sub-regulação de CHIP. Nossos dados sugerem que miR-1178 é um atenuador endógena de chip que facilita tumorigênese pancreático. Para o nosso conhecimento, este estudo é o primeiro a demonstrar a regulação da expressão CHIP por miRNA em células cancerosas humanas e esclarecer a função de miR-1178 em câncer pancreático. Nossos resultados sugerem que miR-1178 pode servir como um novo alvo terapêutico para a terapia à base de miRNA em câncer pancreático.

Informações de Apoio

Tabela S1. As sequências de primers para GAPDH e CHIP

doi: 10.1371. /Journal.pone.0116934.s001

(XLS)

S2 Table. Os anticorpos primários para análise de western blot

doi: 10.1371. /Journal.pone.0116934.s002

(XLS)