Abstract

As nanopartículas de ouro (PNB) têm se mostrado promissoras aplicações médicas no tratamento do câncer envolvido na regulação de equilíbrio redox intracelular. Anteriormente, relataram que PNB podem desencadear apoptose e necrose em células de cancro de pulmão humano (A549) quando L-butionina-sulfoximina (BSO) foi utilizada para diminuir a expressão de glutationa intracelular (GSH). Aqui, nós investigamos a citotoxicidade do PNB em relação a células de câncer de pulmão sob a subunidade catalítica glutamato cisteína ligase (GCLC) foi silenciado por siRNA. Os nossos resultados mostraram que PNB causar apoptose e necrose em células transfectadas com ARNsi GCLC, elevando as espécies de oxigénio reactivas (ROS) intracelulares. Estes resultados demonstraram que a regulação da síntese de glutationa por GCLC siRNA em células A549 pode iniciar a citotoxicidade induzida por nanopartículas de ouro

Citation:. Liu M, Zhao Y, Zhang X (2015) Knockdown de glutamato cisteína ligase Catalytic Subunidade por siRNA Faz com que a citotoxicidade nanopartículas de ouro-induzida em células do cancro do pulmão. PLoS ONE 10 (3): e0118870. doi: 10.1371 /journal.pone.0118870

Editor do Academic: Pedro V. Baptista, Universidade Nova de Lisboa, PORTUGAL

Recebido: 25 de outubro de 2014; Aceito: 11 de janeiro de 2015; Publicação: 19 de março de 2015

Direitos de autor: © 2015 Liu et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation Natural da China (81102468 para Y. Zhao). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

recentemente, o interesse em nanopartículas de ouro (PNB) para o diagnóstico e tratamento do câncer, tais como transportadores de distribuição de drogas [1], vetores alvo celulares [2], a imagem latente [3], radiossensibilização [4-7], e terapias de ablação não-invasivos [8, 9] tem crescido significativamente. PNB oferecem vantagens nestas aplicações devido à sua excelente biocompatibilidade [10], a absorção de luz forte e efeito de espalhamento [11], alta taxa de conversão fototérmica e fotoestabilidade [12-14], bioconjugação fácil e biomodificação [15]. Além disso, a utilização de PNB como agentes anti-cancro tem sido extensivamente estudada. Várias tentativas para incorporar PNB em tratamentos contra o cancro ter sido feita.

A glutationa reduzida (GSH), o mais abundante tiol intracelular, é importante na manutenção do equilíbrio redox intra-celular e está envolvido na desintoxicação de substâncias endógenas e exógenas tais como xenobióticos, radiação de ionização, peróxidos orgânicos e metais pesados ​​[16,17]. Demonstrou-se que um tumor agressivo pode ser sensível a drogas utilizando uma terapia baseada na modulação dos níveis de GSH em células cancerosas [18]. É bem sabido que a glutationa é sintetizado a partir de seus aminoácidos constituintes em duas sequencial, catalisada pela sintetase de glutamilcisteína (GCL) e GSH-sintase. GCL é composto por uma subunidade catalítica (GCLC) e uma sub-unidade moduladora (GCLM), que cataliza o primeiro e limitante da velocidade passo e desempenha um papel fundamental na homeostase da glutationa [19]. Os níveis de GSH intracelular pode ser empobrecido através da inibição específica do GCL. L-butionina-sulfoximina (BSO), um inibidor da GCL, é conhecido para esgotar o conjunto intracelular de glutationa e, consequentemente, causar o stress oxidativo [20]. As alterações nas actividades específicas de enzimas envolvidas no metabolismo de GSH nas células cancerosas têm sido implicados no stress oxidativo e a depleção em GSH pode aumentar a susceptibilidade das células cancerosas para outros eventos prejudiciais [21-23]. Temos relatado anteriormente que PNB visor citotoxicidade para as células do cancro do pulmão quando L-butionina-sulfoximina (BSO) foi utilizada para diminuir a expressão de glutationa intracelular [24]. Assim, as nanopartículas de ouro podem ser empregues como agentes terapêuticos potenciais através da regulação dos níveis de glutationa nas células cancerosas. Enquanto, BSO é um tipo de compostos exógenos. A influência sobre a função de células BSO é imprevisível. No presente trabalho, avaliou-se o efeito de GCLC siRNA na citotoxicidade induzidos PNB-em células de câncer de pulmão.

Para o nosso conhecimento, não há nenhum estudo em avaliar os papéis de GCLC siRNA na morte celular induzida por PNB. O objetivo principal deste estudo é caracterizar a citotoxicidade dos PNB em células de câncer de pulmão quando GCLC foi derrubado por siRNA.

Materiais e Métodos

cultura celular

células A549 (Xangai Cell Bank, Tipo Comité Culture Collection, Academia chinesa de Ciências, número de cat: TCHu150) foram mantidas em meio RPMI-1640 contendo 4,5 g /L de glucose, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, 10% de soro bovino fetal inactivado pelo calor (FBS), 100U /mL de penicilina e 100 ug /mL de estreptomicina. As células foram cultivadas em 5% de CO

2 a 37 ° C sob uma atmosfera humidificada.

A transfecção de siARN na linha celular A549

Gene silenciamento de GCLC foi realizada utilizando um sistema de siRNA knockdown . Um controlo não específico duplex siARN [5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3 ‘], GCLC siRNA-1 duplex [5′-GCUAAUGAGUCUGACCAUU (dTdT) -3′], GCLC siRNA-2 duplex [5’-CUAUGUGGUGU UUGUGGUA (dTdT) – 3 ‘] e GCLC siRNA-3 duplex [5′-GUAGUAUUCUGAACUACCU (dTdT) -3’] foram adquiridos a Sigma-Aldrich. Em resumo, as células A549 foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1,5 x 10

5 por poço. No dia seguinte, as células (~ 60-70% de confluência) em cada poço foram transfectadas com o controlo negativo, GCLC siRNA (75pmol em RPMI 1640 livre de FBS) usando Thermo Scientific DharmaFECT Transfecção Reagentes (Thermo Scientific) de acordo com as instruções do fabricante. Um dia mais tarde, o meio foi mudado para meio de crescimento normal e as células foram cultivadas durante 48 horas adicionais. As células transfectadas foram recolhidas e usadas para PCR, análise de Western blot, e os níveis de GSH de medição [25-27].

preparação de RNA e RT-PCR semiquantitativo

semiquantitativa RT-PCR com β- actina como um controlo interno foi realizada para examinar a alteração na expressão do mRNA de GCLC em células A549 transfectadas com ARNsi. O RNA total foi extraído usando o reagente Trizol (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante [28]. O ARN isolado (2 ug) de células tratadas com siRNAs foi transcrito de forma inversa em ADNc de cadeia simples de uma mistura de reacção contendo: 10 mmol /L de dNTP iniciador, 1 ug de oligo (dT), 20IU RNasin e 200UI M-MLV de transcriptase reversa. A amplificação por PCR foi realizada com ADNc de 0.4μg num volume de reacção contendo 3 pmol de cada iniciador de oligonucleótido específico, 10 mmol /L de dNTP, e Taq polimerase 1.5IU ADN. Para todas as reacções, experiências preliminares foram realizadas para determinar o número de ciclos de PCR em que a saturação ocorreu, e as experiências mencionadas foram realizados com uma série de ciclos que precedem saturação. As sequências dos iniciadores para GCLC e expressão β-actina análises foram: GCLC, iniciador de sentido directo: 5′-TCCAGGTGACATTCCAAGCC-3 ‘; iniciador de sentido reverso: 5’-GAAATCACTCCCCAGCGACA-3 ‘. A unidade termociclador foi programado para 36 ciclos a 95 ° C durante 30 segundos, 60 ° C durante 30 segundos, e 72 ° C durante 30 segundos. β-actina, iniciador de sentido directo: 5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3 ‘; iniciador de sentido reverso: 5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3 ‘. Os produtos de PCR foram sujeitos a electroforese num gel de agarose a 2% (Sigma-Aldrich) e visualizado após coloração com brometo de etidio sobre luz UV [29].

Western blotting

Para a detecção GCLC, as células cultivadas em seis Bem placas foram incubadas com duplex de controlo negativo e GCLC siRNA duplex, durante 24 horas, e depois cultivadas com meio normal de crescimento durante mais 48 horas. Subsequentemente, as células foram lavadas com PBS, tripsinizadas e recolhidas por centrifugação. A quantidade de proteína de 30 ug de cada amostra foram misturadas com tampão de carga, incubou-se a 100 ° C durante 5 minutos e separadas num 10% de SDS-PAGE. Em seguida, as amostras foram transferidas para um (fluoreto de polivinilideno) membrana de PVDF e bloqueadas com 5% (w /v) de leite desnatado dissolvido em TBS + 0,05% (v /v) de Tween-20 (TBST) durante uma hora à temperatura ambiente e sondado com GCLC (1: 500, Santa Cruz Biotechnology), ou β-actina (1: 2.000, Santa Cruz Biotechnology) a 4 ° C durante a noite. A seguir, as membranas foram incubadas com um anticorpo secundário (1: 4000 anti-coelho, Cell Signaling Technology), durante uma hora, lavou-se 3 vezes com TBST e as bandas foram visualizadas usando reagente ECL (Thermo Scientific) [30]

.

Os níveis totais de glutationa intracelular (GSH)

conteúdo celular GSH foi analisada utilizando glutationa Quantificação Kit (Beyotime Instituto de Biotecnologia). 5, 5′-ditiobis (ácido 2-nitrobenzóico) (DTNB) e GSH reagir para gerar 2-nitro-5-tiobenzóico ácido e dissulfureto de glutationa (GSSG). Porque ácido 2-nitro-5-tiobenzóico é um produto de cor amarela, a concentração de GSH em amostras pode ser medido a 412 nm de absorvância com um leitor de placas com múltiplas cavidades. Em resumo, as células foram transfectadas com controlo negativo ou três duplex siARN GCLC durante 24 horas, em seguida, cultivadas em meio normal de crescimento durante mais 48 horas. No final do tratamento, as células foram colhidas e depois sedimentadas por centrifugação a 1000 rpm durante 5 min, ressuspenderam-se em tampão de lise contendo 0,2% de Triton X-100. Os lisados ​​celulares foram centrifugados a 13,000g durante 10 min a 4 ° C, e os sobrenadantes foram utilizados para a determinação das concentrações totais de glutationa. depleção de GSH em GCLC siRNA células tratadas foi indicada [31].

citotoxicidade medição

A citotoxicidade foi determinada através de contagem das células. Observou-se que a inibição da GCLC siRNA-1duplex é a mais significativa entre os três GCLC siRNA duplex. Assim, as células A549 foram incubadas com o controlo negativo ou siRNA-1-GCLC específica, e, em seguida, expostos a diferentes doses de PNB para mais 72 horas. Finalmente, as células foram lavadas com PBS, tripsinizadas com uma solução de tripsina /EDTA e ressuspensas a um volume final de um meio de células de 2 ml para posterior medição da viabilidade celular. Os números de células em cada amostra foram contadas sob um microscópio usando um conjunto de câmara de contagem (Qiujing Inc.) [32].

intracelular espécies de oxigénio reactivo medição

A produção de ROS foi medida usando 2, 7-dichlorodihydro diacetato fluorescente (DCFH-DA, Beyotime Instituto de Biotecnologia). DCFH-DA passivamente entra nas células, esterases celulares agir sobre a molécula para formar a porção não-fluorescente DCFH, que é iónico na natureza e, por conseguinte, aprisionado no interior das células. Uma reacção com ROS conduz a uma oxidação de DCFH ao dichloroflourescein composto altamente fluorescente (DCF). Resumidamente, células cultivadas em placas de 6 poços foram transfectadas com o controlo negativo, GCLC siRNA-1 utilizando Thermo Scientific Lei FECT Transfecção Reagentes. Um dia mais tarde, as células foram tratadas com 20 um (PNB), PNB (20 �) e GSH exógena (1 mM) ou PNB (20 �) e ROS eliminador de N-acetil-L-cisteína (NAC, 1 mM) para adicional de 72 h. Em seguida, as células foram lavadas com PBS por três vezes e, subsequentemente, tratado com 10 uM DCFH-DA. Depois incubou-se durante 30 minutos, as células foram tripsinizadas, recolhidas por centrifugação e ressuspensas em PBS. A intensidade de fluorescência das células (50 000) a partir de cada poço foi medida com um espectrofotómetro de fluorescência (Thermo Scientific), com excitação e emissão de comprimentos de onda de 488 e 525 nm, respectivamente [33].

análise citométrica de fluxo da apoptose e necrose

resultado da contagem celular mostrou que PNB tinha função inibitória sobre a sobrevivência da célula transfectada. Investigou-se se a razão desta inibição é ou apoptose precoce ou tardia de apoptose /necrose. Estes efeitos foram determinados com isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com AnnexinV e coloração de PI (Invitrogen) por meio de análise de citometria de fluxo. As células transfectadas foram tratadas com PNB, PNB e GSH, PNB e NAC. Após 72 h, as células foram recolhidas e lavadas duas vezes com PBS, incubadas com AnnexinV-FITC e PI, durante 15 minutos à temperatura ambiente no escuro. Apoptóticas e necróticas de células foram avaliadas por citometria de fluxo. Pelo menos 1 × 10

4 células foram analisadas em cada amostra, e as configurações de quadrantes foram baseados nas amostras de controlo. As células vivas são negativas para ambos iodeto de propídio (PI) e anexina V, as células apoptóticas são cedo PI negativo, mas AnnexinV positivo, enquanto que as células apoptóticas tardias /necróticas são positivas tanto para PI e AnnexinV. Todos citometria de fluxo análises foram realizadas utilizando comercialmente disponível software celular Quest (BD Bioscience).

potencial de membrana mitocondrial e intracelular caspase-3 ensaio

JC-1 (5, 50, 6, 60-tetracloro-1, 10, 3, 30-iodeto de tetraethylbenzamidazolocarbocyanin, Instituto de Biotecnologia Beyotime) foi usada para avaliar a mudança no potencial da membrana mitocondrial tal como descrito anteriormente [24]. As células A549 em fase de crescimento logarítmica foram plaqueadas em placas de cultura celular de 6 poços e incubadas durante 24 horas, e, em seguida, transfectadas com ARNsi de controlo negativo ou GCLC-1-specific. As células transfectadas foram tratadas com ou sem PNB (20 um) durante 72 horas, em seguida as células foram colhidas e incubadas com JC-1 durante 30 minutos no escuro a 37 ° C. Após a coloração, as células foram lavadas duas vezes com PBS e analisadas por citometria de fluxo de [34].

Para intracelular caspase-3 clivada, as células transfectadas que tratadas com ou sem PNB foram recolhidas e fixadas com paraformaldeído a 4%. Depois tratou-se com 0,1% de Triton X-100 e bloqueada com BSA a 1%, as células foram incubadas com anticorpo de caspase-3 (Asp175) (Alexa Fluor 488 conjugado, Cell Signaling Technology) durante 30 minutos. Em seguida, as células coradas foram analisadas por citometria de fluxo [24].

A análise estatística

As diferenças estatísticas foram avaliadas por meio de análise de variância (ANOVA) e teste T de Student com o software Prism (GraphPad software, Inc.). P 0,05 foi considerado estatisticamente significativo, e os dados foram marcados com (*) para p 0,05, (**) para p 0,01, e (***) para p 0,001, respectivamente. Cada grupo foi testado em triplicado, e todas as experiências foram realizadas pelo menos três vezes.

Resultados

Eficácia de siRNAs contra as subunidades GCL catalíticos

Para investigar o efeito knockdown de três sequências de nucleótidos para 19-GCL subunidades catalíticas, as células A549 foram transfectadas com controlo negativo ou GCLC ARNsi durante 24 horas, seguido por cultura durante 48 horas adicionais em meio de crescimento normal. A análise por RT-PCR semi-quantitativo foi realizado para examinar a expressão de ARNm GCLC. Os níveis de ARNm de GCLC foram significativamente reduzidos em células A549 transf ectadas com GCLC siARN. Em contraste, o controlo negativo siRNA foi menos potente (Fig. 1A). Em todas as células transfectadas com GCLC siRNA, os níveis de mRNA de GCLC foram homogêneos, sem um desvio significativo. Enquanto isso, estimou-se a eficácia do siRNA GCLC ensaiando a sua capacidade para interferir com as proteínas expressas por Western blot. Como mostrado na Fig. 1B, GCLC siARN inibiu significativamente a expressão da proteína em células A549 GCLC. O siARN três diferentes para as subunidades catalíticas GCL diferencialmente interrompido a expressão do GCLC em comparação com controlo negativo e o siARN GCLC siRNA-1 estava entre os mais eficazes.

(A) os níveis de ARNm em células A549 GCLC após 24 horas transfectadas com ARNsi de controlo negativo, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 e GCLC siRNA-3. GCLC siARN diminuíram significativamente os níveis de mRNA em células A549 GCLC. (B) documentos representativos de Western blot gel para GCLC e dados resumidos que mostram que a eficiência do silenciamento de genes de GCLC por siRNA. proteínas citosólicas foram isolados a partir de células transfectadas. Os níveis de proteína GCLC em extractos celulares foram medidos por análise de mancha de Western e foram normalizadas para os níveis de p-actina de expressão. *** P . 0.001, em relação ao controle negativo

Efeito da GCLC siRNA sobre os níveis de GSH intracelular em células A549

GCLC é essencial para a biossíntese de glutationa, que mantém as concentrações de glutationa no células intactas. Mostrámos que o siRNA dirigido contra GCL subunidades catalíticas diminuir os níveis de mRNA de GCLC e inibir a expressão de proteínas em células A549 GCLC. Para corroborar ainda mais a especificidade e eficácia de siRNA GCLC, o efeito de ARNsi GCLC em níveis de GSH intracelular foi medida [32]. Como esperado, em comparação com o grupo de controlo negativo, GCLC siRNA, obviamente, diminuiu os níveis de GSH e o siARN GCLC-1 é o mais significativo (Fig. 2), que é a correspondência com os resultados que nós temos observado acima. Em vista destes resultados, GCLC siRNA-1 foi utilizado nas experiências seguintes. Knock-down experiências demonstraram que GCLC siARN influenciar a expressão de GCLC e levou a uma redução significativa da produção de GSH.

citosol foi isolado a partir de células transfectadas com ARNsi de controlo negativo, GCLC siRNA-1, GCLC siRNA-2 e GCLC siRNA-3. Os níveis de GSH intracelular foram determinadas a 412 nm de absorvância com um leitor de placas com múltiplas cavidades. Os dados representam a percentagem média de controlo negativo (n = 3) ± DP para 4 experiências independentes. * P 0,05, ** P . 0,01, comparado ao controle negativo

O GCLC siRNA regula a morte celular induzida por PNB

O conteúdo total de GSH foi reduzida de forma significativa no As células A549 transfectadas com ARNsi GCLC. Quando BSO foi utilizada para diminuir a expressão de glutationa em células A549, PNB mostrou citotoxicidade evidente para células [32]. No entanto, o efeito de ARNsi GCLC sobre a citotoxicidade dos PNB é ainda desconhecido. Em seguida, investigamos se PNB alterado sobrevivência células A549 após interrupção siRNA mediada da atividade GCLC. Com base nos resultados das experiências de knock-down, células A549 foram transfectadas com ARNsi de controlo negativo ou GCLC-siRNA-1, e, em seguida, expostas a várias concentrações de PNB. Como experiência de controlo, GCLC siRNA não induziu citotoxicidade notável sobre as células A549 (S1 Fig.). Enquanto, observou-se que PNB dependente da dose, inibiu o crescimento de células A549 pré-tratadas com siRNA GCLC-1. Em comparação com o grupo de controlo negativo, o tratamento de células A549 com 50 uM resultou na PNB diminuiu significativamente a população de células viáveis ​​após o consumo de GSH intracelular (Fig. 3).

As células A549 foram transfectadas com controlo negativo ou GCLC siRNA- 1, durante 24 horas, seguido por cultura durante mais 3 dias na ausência de PNB, subsequentemente colhidas e contadas. Cada barra representa a média (± DP n = 4) de determinações em triplicado. * P . 0,05 versus controlo negativo

PNB induzida por citotoxicidade está associado com elevação de ROS intracelular em GCLC siRNA células tratadas

Desde ROS tem sido sugerida como um fator crítico para o determinação do modo de morte celular. Nós ainda investigado se ROS participar na regulação da morte celular induzida por PNB quando as células foram transfectadas com ARNsi GCLC. Como mostrado na Fig. 4, depois de silenciar a expressão GCLC com ARNsi-1, PNB resultou num aumento de aproximadamente 7 vezes maior de níveis de ROS em comparação com o do grupo de controlo negativo. No entanto, quando as células foram tratadas com siRNA GCLC sozinho, a influência da produção de ROS não foi observada na ausência de S2 PNB (Fig.). Exógena GSH e NAC suprimiu significativamente induzidas PIBs-produção ROS, que poderia proteger GCLC siRNA células tratadas de citotoxicidade do PNB. Estes resultados significam que a citotoxicidade dos PNB é, pelo menos, parcialmente associado com o aumento dos níveis de ROS em GCLC siRNA 1-células pré-tratadas (Fig. 4).

exponencialmente as células em crescimento foram transfectadas com controlo negativo e GCLC siRNA- 1 durante 24 horas, seguindo tratados com PNB (20 um), PNB (20 �) e GSH (1 mM), PNB (20 �) e NAC (1 mM). níveis de ROS foram medidos. Os gráficos indicam ROS (como determinado por DCF) níveis (%) em comparação com células de controlo negativo. Cada barra representa a média (± DP n = 4) de determinações em triplicado. ** P 0,01

PNB iniciar apoptose e necrose em células transfectadas com GCLC siRNA

A evidência de que PNB induzir a morte celular e aumentar a produção de ROS intracelular nos levou a examinar mais se PNB causar apoptose e necrose em GCLC siRNA células tratadas. coloração dupla de células com Anexina V-FITC e PI foi utilizada para distinguir células apoptóticas e necróticas de células normais. Como mostrado na Fig. 5, PNB aumentou a proporção de células marcadas com AnnexinV quando os níveis de GSH foram diminuídos pelo silenciamento expressão GCLC. A população de células positivas para PI no total, o qual compreende a apoptose e necrose, foi também significativamente aumentada em GCLC siRNA e PNB células tratadas. O tratamento com ARNsi GCLC sozinho não aumentou a população de apoptose e necrose, em comparação com o grupo de controlo (S3 Fig.). Estes dados mostraram que PNB afectar relativamente Anexina número de células coradas V-PI em células transfectadas com ARNsi GCLC. Para testar se a apoptose ou necrose foi ativado por ROS, foi empregado o GSH exógena e NAC. O tratamento com GSH e NAC tanto suprimiu significativamente o aparecimento de células positivas para anexina V e PI induzida por PNB em GCLC siRNA células tratadas (Fig. 5). Estes resultados indicaram que PNB iniciar apoptose e necrose, elevando os níveis de ROS intracelulares em células de câncer de pulmão pré-tratados com GCLC siRNA.

As células foram transfectadas com o controle de ambos os não-alvo siRNA ou siRNA-1 GCLC específicas do. Um dia mais tarde, as células foram tratadas com os PNB (20 um), PNB (20 �) + GSH (1 mM) e PNB (20 �) + NAC (1 mM) para 72 horas adicionais. células AnnexinV-FITC e PI foram medidos com citometria de fluxo. (A) O padrão de fluorescência de células A549 AnnexinV-FITC e PI-corados após o tratamento. (B) As percentagens de células positivas positivas ou PI anexina V para diferentes tratamentos. Cada barra representa a média (± DP n = 3). ** P 0,01, *** P . 0.001, versus controle

PNB causar a despolarização do potencial de membrana mitocondrial em GCLC siRNA células tratadas

Por causa despolarização do potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) desempenha um papel crucial na apoptose [35], nós examinamos se PNB alterada potencial de membrana mitocondrial em células transfectadas com ARNsi GCLC-1. A sonda fluorescente JC-1 corante foi usada para avaliar a mudança de potencial de membrana mitocondrial e a mudança de fluorescência (vermelho para verde) das amostras foi medida por citometria de fluxo. Observou-se que PNB causou um aumento na intensidade de fluorescência verde /vermelho na GCLC siRNA células tratadas (Fig. 6). Enquanto, as células transfectadas com ARNsi GCLC na ausência de PNB não mostrou nenhuma mudança de potencial de membrana mitocondrial como comparação com o grupo de controlo (S4 Fig.). Estes resultados indicaram que a indução de apoptose e necrose por PNB em GCLC siARN células pré-tratada está intimamente relacionado com o potencial de membrana mitocondrial.

Após transfectadas com ARNsi de controlo negativo ou GCLC siRNA-1, as células foram tratadas com os PNB (20 � ) durante mais 72 horas, em seguida, recolhidas e coradas com JC-1 no escuro a 37 ° C, lavadas por PBS. A mudança de fluorescência (vermelho para verde) das amostras foi medida por citometria de fluxo. Cada barra representa a média (± DP n = 4) de determinações em triplicado. *

p

. 0,05, em comparação com o grupo controle negativo

PNB induzir a ativação de caspase-3 em células transfectadas com GCLC siRNA

apoptose

mitocondrial dependente é iniciada pelo recrutamento e a activação de caspase [36]. Assim, nós ainda perguntar se caspase-3 é ativado durante PNB apoptose induzida em GCLC siRNA células tratadas. Quando a piscina GSH citosólico lábil foi esgotada por siARN GCLC, as células foram cultivadas com ou sem PNB. A activação da caspase-3 foi medida utilizando anticorpos específicos que reconhecem a forma particularmente clivado e activado por citometria de fluxo. Como mostrado na Fig. 7, PNB aumentou significativamente de caspase-3 em actividades GCLC siRNA células tratadas. GCLC siRNA sozinho duramente afetado a atividade de Cascase-3 em comparação com o grupo controle (S5 Fig.). Portanto, PNB apoptose induzida principalmente através da via da caspase-dependente mitocondrial.

Activação da caspase-3 foi medida utilizando anticorpos específicos por citometria de fluxo. GSH intracelular foi esgotada por GCLC siRNA-1, após aproximadamente 72 horas de tratamento PNB, as células foram recolhidas, tratou-se com 0,1% de Triton X-100 e bloqueada com BSA a 1%, em seguida, incubadas com anticorpo de caspase-3 (Asp175) ( Alexa Fluor 488 conjugado) durante 30 minutos. A intensidade de fluorescência foi medida por citometria de fluxo. Cada barra representa a média (± DP n = 4) de determinações em triplicado. *

p

. 0,05, em comparação com o grupo controle negativo

Discussão

Ao longo dos últimos anos, indução de apoptose devido a alterações no estado redox intracelular por certo oxidativo ou não-oxidativo estímulos tornou-se um foco de investigação extensa [23, 25, 37, 38]. ROS e GSH são os dois principais determinantes do equilíbrio redox celular. ROS muitas vezes causar dano celular e conduzir à morte celular, especialmente a uma concentração elevada. esgotamento de GSH farmacológico por BSO altamente sensibiliza as células de tumor à apoptose induzida por agentes quimioterapêuticos. Portanto, a manipulação do estado redox celular representa uma estratégia viável para a indução de apoptose por agentes anti-cancro. Enquanto isso, as nanopartículas de ouro no diagnóstico e tratamento do câncer tornaram-se o ponto quente de pesquisa internacional. Anteriormente, descobrimos que GSH via metabólica está diretamente envolvido na desintoxicação do PNB [24]. Quando a expressão de GSH intracelular pela BSO foi inibida, a citotoxicidade dos PNB era óbvia. PNB induzir a morte celular por espécies reactivas de oxigénio (ROS) geração em células A549 com baixa glutationa intracelular [24, 32]. Geng F e colegas relataram que a interacção entre a radiação de raios-X com PNB induzidos níveis elevados de produção de ROS é um dos mecanismos pelos quais PNB podem melhorar a radioterapia do cancro do ovário em [39]. O stress oxidativo contribui para ouro citotoxicidade induzida por nanopartículas em células de hepatoma (HepG2) de leucemia humana (HL-60) e [40]. Estes resultados proporcionaram provas claras de que podem ser empregues PNB não só como transportadores si, mas também como agentes terapêuticos potenciais, explorando a sua capacidade para diminuir a expressão de GSH intracelular e gerar respostas citotóxicas. Neste estudo, adoptar-specific siRNA GCLC para inibir a expressão de GCLC e levar a uma diminuição significativa na produção de GSH, e, em seguida, detectados a citotoxicidade dos PNB. Após o tratamento com siRNA GCLC, ROS foi detectado na presença de PNB em células A549. O resultado mostrou que PNB pode afetar os níveis de ROS em GCLC siRNA células tratadas. GSH e NAC pode eliminar o ROS para neutralizar a citotoxicidade do PNB em células de câncer de pulmão transfectadas com GCLC siRNA. Estes resultados indicaram que, depois de derrubar GCLC por ARNsi, ROS atribuído à morte celular induzida por PNB em células de cancro do pulmão.

Sabe-se que diferentes vias de morte celular coexistem em células de mamíferos e a sua activação depende da tipo e intensidade do estímulo. Um lote de importância tem sido dada à morte celular por apoptose e necrótica em terapia anti-tumor [41-44]. Vários modos de morte celular são simultaneamente induzida em células de câncer de pulmão PNB-expostas com baixa GSH intracelular, incluindo a apoptose e necrose. Observamos que PNB pode induzir a apoptose e necrose simultaneamente quando o GCLC foi silenciado por siRNA em células de câncer de pulmão. Estes resultados sugeriram que tanto a apoptose e a necrose é importante mecanismo de morte celular induzida por PNB.

Para concluir, as nanopartículas de ouro utilizar cada vez mais importante papel no pedido de pesquisa anti-tumoral. As nanopartículas de ouro uma vez conjugados com siRNA específico do GCLC pode efetivamente induzir a morte de células tumorais. São necessários estudos no entanto, mais extensas e animais com diferentes espécies de animais para tirar conclusões deste inquérito aos ensaios clínicos.

Informações de Apoio

S1 Fig. Efeito de GCLC siARN sobre a sobrevivência celular em células A549. As células foram semeadas

antes transfectadas com ARNsi GCLC, e, em seguida, cultivadas em meio de crescimento normal. Os números de células foram contadas em intervalos de 48 h para a viabilidade das células. Cada barra representa a média (± SD n = 3) de determinações em triplicado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s001

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S2 Fig. produção de ROS em células A549 transf ectadas com GCLC siARN.

células cultivadas em placas de 6 poços foram transfectadas com o controlo negativo ou GCLC siARN. Um dia mais tarde, as células foram cultivadas em meio de crescimento normal durante mais 48 h e, subsequentemente, tratado com 10 uM DCFH-DA. A intensidade de fluorescência das células foi medida com um espectrofotómetro de fluorescência. Barras representam a média (± SD n = 3) de determinações em triplicado

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s002

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S3 Fig. Apoptóticas e necróticas resposta de células A549 transfectadas com ARNsi GCLC.

Após knockdown de expressão GCLC, as células foram coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI) e analisadas por citometria de fluxo. Representativos resultados de citometria de fluxo são mostrados como gráfico de pontos

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s003

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S4 Fig. Efeito de GCLC siARN no potencial de membrana mitocondrial (ΔΨm) em células A549.

As células tratadas com controlo negativo ou GCLC siRNA foram coradas com JC-1 durante 20 min a 37 ° C. A mudança de fluorescência (vermelho para verde) das amostras foi então detectado utilizando citometria de fluxo. Os dados representam a média (± SD n = 3) de três experimentos independentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s004

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S5 Fig. Efeito de GCLC knockdown na actividade de caspase-3 em células A549.

Vinte e quatro horas após a transfecção com controlo negativo ou siRNA GCLC, as células foram mantidas em meio normal de crescimento durante 48 horas adicionais. Caspase-3 actividades em amostras foram determinadas utilizando caspase-3 (Asp175) anticorpo clivado (Alexa Fluor 488 conjugado) por citometria de fluxo. Os valores são expressos como a média ± DP de três experiências independentes

doi:. 10.1371 /journal.pone.0118870.s005

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Agradecimentos

Os autores agradecem Dr Xiaohu Gu e Professor Yi Ding de Shandong University School of Química e Engenharia Química, para apoiar as nanopartículas de ouro.