Abstract

chemoresistance é a principal causa de falha do tratamento de câncer colorretal avançado (CRC). No entanto, os mecanismos moleculares subjacentes a este fenómeno ainda devem ser elucidados. Num trabalho anterior, identificados baixos níveis de PKM2 como um marcador de resistência à putativa oxaliplatina em linhas celulares de CRC HT29 e também em pacientes. A fim de avaliar como PKM2 influencia resposta oxaliplatina em células CRC, nós silenciados PKM2 usando siRNAs específicos em HT29, SW480 e células HCT116. teste MTT demonstraram que PKM2 silenciamentos resistência induzida em células HT29 e SW480 e sensibilidade em células HCT116. Mesmos experimentos em células nulas HCT116 p53 isogênicos e duplo silenciamento de p53 e PKM2 em células HT29 não conseguiu mostrar uma influência de p53. Por meio da coloração com azul de tripano e os testes /pi de FITC-anexina V verificou-se que PKM2 knockdown foi associada a um aumento da viabilidade celular, mas não com uma diminuição na activação de apoptose em células HT29. A microscopia de fluorescência revelou translocação nuclear PKM2 em resposta a oxaliplatina em células HCT116 e HT29, mas não em células HTOXAR3 oxa-resistente. Finalmente, usando uma matriz de qPCR foi demonstrado que a oxaliplatina e PKM2 silenciamento padrões de expressão de gene da morte celular alterada, incluindo aqueles de BMF, o que foi significativamente aumentado nas células HT29 em resposta a oxaliplatina, de uma forma de dose e tempo-dependente, mas não em siPKM2 células -HT29 e HTOXAR3. BMF silenciamento de genes em células HT29 levar a uma redução na morte celular induzida por oxaliplatina. Em conclusão, nossos dados relatar novos papéis não-glicolíticas de PKM2 em resposta ao dano genotóxico e propõe BMF como um possível gene alvo de PKM2 a ser envolvido na resposta oxaliplatina e resistência em células CRC

Citation:. Ginés A , Bystrup S, Ruiz de Porras V, Guardia C, Musulén E, Martínez-Cardús A, et al. (2015) PKM2 subcelular Localization está envolvido em oxaliplatina Aquisição Resistência em linhas celulares de cancro colorrectal HT29 humano. PLoS ONE 10 (5): e0123830. doi: 10.1371 /journal.pone.0123830

Editor do Academic: Hiromu Suzuki, Sapporo Medical University, JAPÃO

Recebido: 16 de setembro de 2014; Aceito: 07 de março de 2015; Publicado em: 08 de maio de 2015

Direitos de autor: © 2015 Ginés et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Disponibilidade de dados: Todos os dados relevantes estão dentro do papel e seus arquivos de suporte de informação

Financiamento:. Este trabalho foi financiado pela beca bianual de la Fundación Olga Torres 2008-2009 (https://www.fundacioolgatorres.org/beques_d-investigacio/) para EMB AGM AA AMC EM JLM

Conflito de interesses:. os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer colorretal (CRC) continua a ser um dos mais frequentes. causa de morte relacionada ao câncer em todo o mundo. A taxa de sobrevida global em 5 anos é inferior a 10% em estágios avançados da doença e quimioterapia tratamento continua a ser essencial para estes pacientes. Apesar da disponibilidade de novas terapias-alvo contra o EGFR ou VEGF, combinações de oxaliplatina (OXA) com fluoropirimidinas continuam a ser os regimes de primeira linha mais frequentemente usados ​​na presença de metástases [1, 2]. Citotoxicidade de OXA é gerado principalmente através da formação de aductos de ADN-platina, resultando na transcrição do ADN e a replicação do bloqueio. Por conseguinte, activa várias vias de sinalização que conduzem à reparação do ADN danos e /ou a activação dos programas de morte celular [3], que por sua vez depende, entre outros factores, sobre o estado mutacional do gene supressor tumoral p53 [4-6]. No entanto, é evidente que nem todos os pacientes beneficiar do tratamento com OXA processos de resistência que representam o principal obstáculo da eficácia do tratamento. Chemoresistance para agentes de platina é um processo complexo e multifactorial em que vários mecanismos, tais como o influxo de drogas /modificações de efluxo, alterações no DNA reparação de danos, redução da ativação da morte celular, sobrevivência autócrino sinalização ou alta atividade desintoxicação podiam participar [7-10]. Infelizmente, a maioria dos estudos sobre a resistência drogas de platina têm incidido sobre a cisplatina e o comportamento real, biológica e mecanismos de resposta a OXA em células colorretal é praticamente desconhecido.

Nos últimos anos, muitos estudos têm direcionado sua atenção para metabolismo das células do tumor como um mecanismo de adaptação de célula para a sensibilidade ao fármaco [11, 12]. Nesta linha, encontramos em um estudo anterior que isoforma M2 de piruvato da enzima quinase (PKM2) está ligada à aquisição de resistência OXA em um

in vitro

modelo e fomos capazes de traduzir nossos resultados em um pequeno grupo de pacientes de CRC metastáticos que tinham recebido OXA /quimioterapia 5-FU [8]. Outros autores relataram que a expressão e a actividade PKM2 está ligada à resistência à cisplatina em células de tumor gástrico [13] e em células de cancro colorectal com resistência adquirida para o tratamento 5-FU [14]. Estes factos indicam que esta enzima pode ter um papel importante nos processos de aquisição de resistência a diversos fármacos quimioterapêuticos. Além disso, demonstrou-se que algumas das funções biológicas PKM2 depender de translocação nuclear do enzima que é promovida por diferentes modificações pós-traducionais tais como a fosforilação da tirosina [15-17], acetilação da lisina [18], ou sumoilação [19] em resposta aos factores de EGFR [20], IL-3 [21] ou Oct-4 [22], respectivamente. Embora na maioria dos acima mencionados casos PKM2 translocação resulta na estimulação da proliferação de células, demonstrou-se que depois de outros tipos de estímulos tais como danos no ADN ou stress oxidativo, PKM2 transloca para o núcleo de células que conduzem à activação da morte celular em um caspases e Bcl-2 forma independente [23].

no trabalho aqui apresentado, queríamos para elucidar os mecanismos moleculares relacionados com a PKM2 responsáveis ​​pela aquisição de resistência OXA em um

in vitro

modelo anteriormente descrito por nós [24]. Como será mostrado, a modulação da expressão PKM2 sensibilidade alterada OXA não apenas neste modelo celular, mas também em outras linhas celulares de CRC humanos. Mostramos que PKM2 transloca para o núcleo, em resposta a danos genotóxico provocado por OXA em sensível, mas não em linhas de células com resistência adquirida à droga e regula o padrão de genes de morte celular, tais como BMF, o qual tem sido mostrado para ser envolvido expressão na ativação da morte celular por apoptose e não-apoptótica.

Materiais e Métodos

consentimento informado assinado foi obtido de cada paciente e da Investigação Clínica Comissão de Ética do Hospital alemães Trias I Pujol desde a aprovação para o estudo.

as linhas celulares

células de carcinoma do cólon HCT116 e seu derivado isogênico com uma inactivação específica de p53 foram um presente do Dr. Vogelstein (Escola da Universidade Johns Hopkins de Medicina). SW480 e HT29 foram obtidas a partir da American Type Culture Collection (Manassas, VA). O último foi utilizado como as células parentais da sub-linha HTOXAR3 oxa-resistente, o qual foi obtido como um resultado de exposição contínua e aumentou para OXA como descrito anteriormente [9]. As linhas celulares foram cultivadas como monocamadas em DMEM (HT29, SW480 e HTOXAR3; Invitrogen, Life Technologies) ou RPMI 1640 (HCT116 e p53 HCT116 null; Invitrogen, Life Technologies) suplementado com-inactivado pelo calor 10% FCS (Reactiva), 400 unidades /ml de penicilina, 40 ug /ml de gentamicina, e 2 mM de L-glutamina (Sigma) e cultivadas a 37 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO

2. As células foram testados periodicamente para contaminação por

Mycoplasma Comprar e foram autenticadas pela curta repetição em série de perfis.

Drugs

OXA foi preparado em água (1 mM) como solução estoque e armazenados a -20 ° C. Diluições do fármaco foram feitas em meio de cultura até às concentrações finais antes da utilização.

siARN transfecções

As células foram semeadas a 60% de confluência em meio OptiMEM isento de soro e antibiótico (Invitrogen) em seis , 12 e placas de 96 cavidades, de acordo com as seguintes experiências. PKM2 foi transitoriamente silenciado por meio de três siRNAs diferentes visando PKM2 (seq NM_002654;. NM_182470; NM_182471; Ambion). P53 e inibição BMF foi realizado com piscinas de 4 siRNAs diferentes (SmartPool On-Target Plus:

TP53

, # L-003.329;

BMF

, # L-004393-00, Dhamacon, GE). Como um agente de transfecção foi utilizado RNAiMAX Lipofectamina (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Um controle de transcrição negativo silenciador (Cat No. AM4611; Ambion) foi introduzida em cada experimento. Após 24 h de transfeco, o meio foi substituído com DMEM completo ou meios RPMI 1640 suplementados com soro e antibiótico. Validação de PKM2, p53 e BMF knockdown foi avaliada por qPCR e Western blot (WB), somente pela WB e só por qPCR, respectivamente. Em experimentos afinar, siGAPDH 3 nM controle positivo (NM_002046; Ambion) e células não transfectadas (Mock) foram introduzidos para garantir que a transfecção teve efeitos mínimos sobre a expressão do gene, proliferação e viabilidade celular (S1 Fig)

Western blot

As células foram homogeneizadas em RIPA mais tampão [tampão fosfato salino (PBS); NP-40 a 1%; Na desoxicolato a 0,5%; SDS 0,1%; EDTA 1 mM; NaF 50 mM; NAVO

3 a 5 mM] contendo um cocktail de inibidores de protease isento de EDTA (Roche). A concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford utilizando o kit BCA Protein Assay (Pierce) e albumina de soro bovino como padrão. Vinte microgramas de proteína foram carregadas e submetidas a electroforese em géis de 10% SDS-PAGE (Invitrogen) e transferidas para membranas de PVDF (Bio Rad). Após 1 h de bloqueio (LICOR Biosciences) as membranas foram incubadas durante a noite a 4 ° C com um anticorpo primário anti-PKM2 policlonal de coelho (sinalização celular; 1: 1000) ou com um anticorpo monoclonal anti-p53 (Abcam; 1: 500). Coelho monoclonal anti-actina (1: 2000) e anti-alfa-tubulina de anticorpos monoclonais de ratinho (1: 15000) (ambos a partir de Sigma Aldrich) foram utilizados como controlos internos. As membranas foram incubadas com IRDye coelho e anticorpos secundários de ratinho (1: 15000) (Licor Biosciences) durante 45 minutos ao abrigo da luz. As membranas foram digitalizados usando o System Odyssey Imagem e analisados ​​com software Odyssey v2.0 (Licor Biosciences).

qPCR

Foram realizados experimentos de expressão gênica como descrito em um trabalho anterior [24]. Retrotranscrição foi realizada com a transcriptase reversa de MMLV (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante. Os iniciadores e sondas para PKM2 (ensaio n. Hs00762869_s1) e análise de expressão de ARNm de BMF (Hs.00372938_m1) foram adquiridos de Applied Biosystems predesigned. O tamanho do produto PCR gerados com esses primers foi de 62 pb para PKM2 e 59 pb para BMF. Relativa quantificação expressão do gene foi calculada de acordo com o método Ct comparativa tal como descrito noutro local usando 18S (Stratagene) ou β-actina (Applied Biosystems) como controlos endógenos. Em todos os experimentos, a apenas triplica com um valor de Ct inferior a 0,20 SD foram aceites. Além disso, para cada amostra analisada, um controle retrotranscriptase menos foi executado na mesma placa para assegurar a ausência de contaminação de DNA genômico.

MTT

A citotoxicidade de OXA foi avaliada pela 3- ( 4, 5-dimetiltiazol-2-il) brometo de 2,5-difeniltetrazólio (MTT) de teste. As células foram semeadas e transfectadas em placas de microtitulação de 96 poços (Nunc) a uma densidade de 1000 (HT29 e SW480) e 2000 células /poço (HCT116). Quarenta e oito horas após a transfecção siRNA, OXA foi adicionado em diferentes concentrações; a viabilidade celular foi determinada 24 h após a incubação, o ensaio de MTT (Roche Diagnostics) [25]. As concentrações inibidoras (ICs, variando de 10% a 90% da viabilidade das células) foram determinados em cada linha celular pelo método de linha mediana-efeito. Os dados apresentados representam a média ± SD de um mínimo de três experiências independentes.

mancha de Azul de Tripano

As células foram cultivadas em placas de 12 poços e tratadas com OXA 15 uM, durante 24 h. Após a exposição ao medicamento células foram colhidas e novamente suspensas em meio DMEM a uma concentração de 1×10

5 células /ml. A citotoxicidade foi avaliada utilizando a coloração de azul de tripano. Dez microlitros de 0,05% de azul de tripano (Invitrogen) foi misturada com 10 ul de suspensão de células, distribuídos sobre uma câmara de Neubauer e cobertos com uma lamela. Enquanto as células viáveis ​​excluem o corante e aparecem translúcido, as células não viáveis ​​aparecer manchado azul. Viabilidade e mortalidade de pelo menos 3 repetições de cada condição experimental foram quantificados.

anexina V /iodeto de propídio teste

A apoptose foi determinada utilizando Kit FITC A anexina V Detecção de apoptose I (BD Pharmingen) de acordo com as instruções do fabricante. Um mínimo de 10

4 células por amostra foi analisada utilizando fluxo FACS Canto II citômetro (Becton Dickinson Immunocytometry System). Pelo menos 3 réplicas por condição experimental foram analisados. Os controlos positivos e negativos (somente tampão de ligação, iodeto de propídio (PI), Só FITC-anexina V) foram usadas para criar condições adequadas para compensar os detectores e os quadrantes. morte celular induzida por OXA após o silenciamento do gene BMF foi medida usando PI. BMF foi silenciada utilizando siRNA alvejando BMF como descrito acima. Após 72 h de tratamento de oxaliplatina, HT29 células foram colhidas com Accutase (Ref. A11105-01, Invitrogen) e ressuspensas em PBS frio, com uma concentração de PI de 3 um. A fluorescência de PI foi determinada com um fluxo FACSCanto citómetro II (Becton Dickinson Immunocytometry Sistema). BMF silenciamento do gene foi confirmada por qPCR.

ciclo celular análise

Para avaliar a distribuição do ciclo celular de células foram colhidas, lavadas em PBS, fixadas em 1 ml de etanol a 70% arrefecido em gelo e armazenada a 4 ° C durante pelo menos 30 min. Os sedimentos foram ressuspensos em 0,5 ml de tampão HCl 0,1 M e incubou-se durante 10 minutos a 37 ° C. As reacções foram interrompidas com 2,5 mL de PBS. As células foram incubadas em 1 ml de solução de coloração de PI (30