Abstract
-tronco de pluripotência celular, angiogênese e epitelial-mesenquimal de transição (EMT) foram mostrados para ser significativamente regulada em ductal pancreático adenocarcinoma (PDAC) e muitos outros cancros agressivos. A desregulação desses processos Acredita-se que desempenham papéis fundamentais na iniciação do tumor, progressão e metástase, e é positivo para PDAC sendo a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer em os EUA. O supressor de tumor miRNA
miR-145
regula negativamente fatores de pluripotência críticos e oncogenes e resultados em potencial metastático reprimida no PDAC. Além disso, o
miR-200
família regula vários fatores angiogênicos, que têm sido associados a metástase em muitos tumores sólidos. Temos anteriormente demonstrado que a regulação negativa da DCLK1 pode upregulate miRNAs críticos tanto em
in vitro
e
in vivo
modelos de cancro e resulta em downregulation de c-MYC, KRAS, NOTCH1 e relacionadas com a EMT transcrição factores. Um relatório recente mostrou também que Dclk1 pode distinguir entre as células-tronco normais e tumorais em
Apc
min /+
camundongos e que a ablação de Dclk1
+ células resultou em regressão de pólipos intestinais sem afetar a homeostase. Aqui demonstramos que o knockdown de DCLK1 usando poli (lactido-co-glicolido) -encapsulated-DCLK1-siRNA resulta na paragem do crescimento do tumor AsPC1. Exame de tumores de xenoenxerto revelado, (a) aumento da
miR-145
o que resulta na diminuição da pluripotência manutenção factores OCT4, SOX2, NANOG, KLF4 bem como KRAS e RREB1; (B) aumento da let-
7a
o que resulta em diminuição LIN28B fator de pluripotência; e (c) aumento da
transcrição miR-200
o que resulta em diminuição VEGFR1, VEGFR2 e EMT relacionados com fatores ZEB1, ZEB2, caracol e lesma. Especificidade da DCLK1 regulação pós-transcricional dos alvos a jusante de
miR-145
,
miR-200
e let-
7a
foi realizada utilizando um ensaio de repórter baseado em luciferase . Concluímos que DCLK1 desempenha um papel regulador mestre significativo na tumorigênese do pâncreas através da regulação do supressor de tumores múltiplos miRNAs e seus jusante vias pró-tumorigênicos. Este novo conceito de segmentação DCLK1 sozinho tem várias vantagens sobre a segmentação via única ou terapias baseadas em miRNA para PDAC
Citation:. Sureban SM, maio R, Qu D, Weygant N, P Chandrakesan, Ali N, et al . (2013) DCLK1 Regula pluripotência e fatores angiogênicos
via
Mecanismos de microRNA-dependentes no cancro do pâncreas. PLoS ONE 8 (9): e73940. doi: 10.1371 /journal.pone.0073940
editor: Chunming Liu, da Universidade de Kentucky, Estados Unidos da América
Recebido: 22 de abril de 2013; Aceito: 23 de julho de 2013; Publicação: 09 de setembro de 2013
Direitos de autor: © 2013 Sureban et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este trabalho foi apoiado pelo National Institutes of bolsas de Saúde e do Instituto Nacional do Câncer: CA-137482 (CWH); Centro de Oklahoma para o Avanço da Ciência e Tecnologia, e Oklahoma Center for Adult Stem Cell Research (CWH). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:. CWH é uma co-fundador da COARE Biotechnology Inc., e isso não altera os autores “a adesão a todas as políticas de PLoS ONE e compartilhamento de dados e materiais.
Introdução
pâncreas adenocarcinoma ductal (PDAC) é a quarta principal causa de mortes relacionadas ao câncer em os EUA anualmente, com a 5 % de taxa de sobrevida em 5 anos. Apesar de mais de 10 anos de regimes terapêuticos aprovados pela FDA e melhorias marcantes na assistência médica e cirúrgica, nenhum impacto significativo na sobrevida dos pacientes PDAC foi observada [1]. Recentemente, um subconjunto de células com células-tronco do cancro (CSC) propriedades tem sido identificada em PDAC [2] que são capazes de ilimitada de auto-renovação e dar origem a progenia mais diferenciadas e mais agressivo, que são frequentemente resistentes a convencional quimioterapia e radioterapia [2,3]. A incapacidade de erradicar estas CSCs é postulada para ser uma razão para a reincidência do tumor, metástase e morte na sequência de respostas iniciais ao tratamento [4]. Outro obstáculo crítico na luta contra cancros de tumores sólidos, em geral, é a heterogeneidade de tipos de células dentro do microambiente do tumor [5] e o nicho de tumor altamente desmoplásica [6]. Esta heterogeneidade é ainda mais complicada pelo epitelial para mesenquimal (EMT), um processo que desempenha um papel chave na invasão e metástase [7,8] cancro. Muitos dos factores de transcrição de indução de EMT tais como SNAI1 (CARACOL), SNAI2 (robusto), ZEB1, ZEB2, TWIST1, FOXC2 e Goosecoid têm sido associadas com a invasão tumoral e metástase [9]. Recentemente, uma série de relatórios de ter identificado o microRNA (miRNA)
miR-200
família como marcadores fundamentais e reguladores de EMT [10-12]. miARNs são pequenos, 19-22 nucleótidos de comprimento, RNAs não codificantes que inibem a expressão de genes ao nível pós-transcricional [13]. A forte ligação entre a desregulação e humano do câncer miRNA foi estabelecida [14]. Consequentemente miARNs têm demonstrado actuar quer como oncogenes (por exemplo,
miR-155
,
miR-17-5p e
miR-21
) [15,16] ou supressores de tumor (por exemplo,
miR-34
,
miR-15a
,
miR-16-1 Comprar e let-
7
) [17 -20]. No entanto, as características regulamentares precisas que pender a balança para um fenótipo de câncer em relação ao supressor de tumor em relação expressão miRNA oncogênico são mal compreendidos.
pluripotência é a capacidade de uma célula para se diferenciar em qualquer tipo de célula e é um exclusivo característica de células estaminais embrionárias (CES). factores de transcrição, tais como pluripotência OCT4, SOX2, NANOG e KLF4 formar redes reguladoras e influenciar um largo espectro de genes a jusante. Superexpressão desses fatores pode dedifferentiate células somáticas humanas e de camundongos em células induzidas pluripotentes estaminais (iPSCs) [21]. A reprogramação factores OCT4, SOX2, NANOG, KLF4, c-myc, e LIN28 também têm sido sugeridos para ser oncogenes e pode estar implicado no desenvolvimento de vários cancros [21-26]. Vários relatórios têm demonstrado que estes factores de transcrição são reguladas, pelo menos em parte, por miARNs [21,27,28].
miR-145
inibe especificamente os factores acima mencionados pluripotência por ligação a região 3 ‘não traduzida (UTR) do mRNA, o que conduz à inibição da CES, auto-renovação, e indução de diferenciação. Além disso, a perda de
miR-145
prejudica a diferenciação e eleva OCT4, SOX2, e KLF4 [21]. Além disso, foi demonstrado que o
miR-145
promotora está ligada e reprimidos por OCT4 em CES. Isso indica (a) a existência de uma relação directa entre os fatores e de reprogramação do núcleo
miR-145
, e (b) a presença de um loop duplo feedback negativo envolvendo OCT4, SOX2, KLF4 e
miR-145
[21]. No cancro,
miR-145
é regulada negativamente e tem sido demonstrado que possuem propriedades supressoras de tumor. A perda de
miR-145
(
miR-143/145
cluster) é observada em cancros pancreáticos KRAS mutado, e restauração terapêutico destes miRNAs anula tumorigênese [29,30]. Além disso, Ras-responsive vinculativo elemento de proteína 1 (RREB1) reprime
miR-143 Twitter /
miR-145
atividade do promotor, o que indica que a repressão é um evento precoce na iniciação do câncer de pâncreas e progressão [ ,,,0],29]. Além disso, KRAS e RREB1 são alvos de
miR-143/145
, demonstrando um mecanismo de feed-forward que potencia a progressão do tumor PDAC RAS sinalização mediada [29]. Foi recentemente demonstrado que a expressão ectópica de
miR-143/145
resultado em metástase reprimida e aumento da adesão de células de câncer pancreático [30]. Estes dados em conjunto sugerem que o
miR-145
é um regulador mestre de fatores iPSCs em CES e CSCs e pode desempenhar um papel importante na inibição da iniciação do câncer de pâncreas, progressão e EMT.
Vascular sinalização do factor de crescimento endotelial (VEGF) tem um papel importante na angiogénese tumoral. membros da família VEGF mediar a sinalização crítica por ligação a dois receptores de quinase de tirosina, VEGFR1 e VEGFR2. VEGFR1 é necessária para a sobrevivência de células endoteliais; Considerando que, VEGFR2 é necessária para a actividade angiogénica e permeabilidade vascular mediada por receptor [31-33]. Recentemente, foi demonstrado que estes factores angiogénicos (VEGFR1) e 2 estão envolvidas em metástase de tumores de células de carcinoma renal e do cólon [34]. sinalização de VEGF é conhecida por promover a vasculatura tumoral e proliferação das células endoteliais em PDAC. Estudos utilizando VEGFR1 e VEGFR2 solúvel (a inibição da sinalização mediada pelo VEGFR-de uma forma dominante negativa) ou os inibidores da quinase de tirosina de VEGFR resultou na inibição de angiogénese tumoral, crescimento e metástases em modelos de ratos PDAC [35-38].
DCLK1 (anteriormente conhecido como DCAMKL-1) é um marcador de células estaminais intestinal e do pâncreas e é regulada positivamente putativo no estroma e epitélio do PDAC. Ele também foi recentemente descrito como um marcador de célula de tufos /escova relativamente indefinida no pâncreas e intestino [39,40]. Ela regula negativamente vários miARNs supressores de tumores e provavelmente desempenha um papel-chave na iniciação e progressão de cancros de tumores sólidos [11,41]. Além disso, ele regula vários oncogenes chave (c-myc, KRAS e Notch1) e EMT. Além disso, a sobre-expressão de factores de pluripotência em células de cancro de fígado resultou num aumento da expressão de DCLK1 [42]. Recentemente Nakanishi et ai. [43], usaram um modelo elegante do mouse Dclk1-Cre para demonstrar, que Dclk1 marca células-tronco tumor intestinal. Ablação de células que expressam Dclk1 em
Apc
min /+
ratos resultou em regressão de pólipos sem qualquer dano ao epitélio intestinal normal. Neste relatório, seguindo o knockdown de DCLK1 utilizando camundongos xenoenxerto siRNA (NPsiDCLK1) em tumor encapsulado em nanopartículas, observou-se um aumento significativo: (A)
miR-143/145
cluster, o que resultou na regulação negativa da marcadores de pluripotência chave (OCT4, SOX2, KLF4 e NANOG); (B) let-
7a
, o que resultou na diminuição da pluripotência fator LIN28B; e (C)
miR-200a, b
e
c
, que resultou na regulação negativa da EMT e fatores angiogênicos. A administração de NPsiDCLK1 não resultaram em toxicidade evidente nos ratos. Estes dados em conjunto sugerem um papel regulador central da DCLK1 na tumorigênese de pâncreas.
Materiais e Métodos
Small interferindo RNAs
DCLK1 siRNA (siDCLK1) sequência de direccionamento região codificadora do DCLK1 (No. de acesso NM_004734) (GGGAGUGAGAACAAUCUACtt) e mexidos siRNAs (Si-SCR) não correspondentes qualquer um dos genes humanos foram obtidos (Ambion Inc., Austin, TX).
Síntese e caracterização de DCLK1 siARN PN
poli (lactido-co-glicolido) (PLGA nanopartículas de ácido NPs) foram sintetizados utilizando uma técnica de evaporação de solvente de emulsão dupla como descrito anteriormente [11,44]. Resumidamente, siARN (DCLK1 ou mexidos) foi condensado no polímero catiónico poli (etilenoimina) (PEI) para formar um complexo de siARN-PEI. O complexo foi adicionado ao PLGA em clorofórmio e vórtice e transferidas para álcool polivinílico 2%. Esta emulsão foi sonicada e deixa-se evaporar durante a noite. O tamanho, índice de polidispersão, e as medições potencial zeta de sintetizados siRNA NPs foram determinados utilizando espalhamento de luz de difração (DLS) utilizando Zeta PALS (Brookhaven Instruments, Holtsville, NY).
modelo de tumor xenoenxerto
NOD /SCID foram adquiridos a Jackson Laboratory (Bar Harbor, Maine) e alojados em condições sem agentes patogénicos. Eles foram tratados de acordo com as diretrizes estabelecidas pela Associação Americana para Credenciamento de Laboratório Animal Care e do Serviço de Saúde Pública dos EUA Encomendado “Política no cuidado humano e Uso de Animais de Laboratório.” Corps “Todos os estudos foram aprovados e supervisionados pela Universidade do Comité de Cuidados e Uso Institucional animal Oklahoma Ciências da Health Center (IACUC). as células AsPC-1 (1 × 10
7) foram injectados subcutaneamente nos flancos de 4- a ratinhos seis semanas de idade (n = 3). os tumores foram medidos utilizando um compasso e o volume foi calculado como (comprimento x largura
2) x 0,5. os tumores eram palpáveis 30 dias após a injecção das células. NPs foram reconstituídas em solução salina normal estéril e injectadas directamente nos tumores. Cada animal apresente o tumor foi injectado nos dias 30, 33, 36, 39, e 42, com uma das seguintes preparações -50 ul (5 uM) de preparação de siRNA-NP [NP sozinho (controlo), NP-siScrambled (NPsiSCR), ou NPsiDCLK1]. Todos os ratos foram mortos no dia 45.
imunohistoquímica, Western blot, em tempo real transcrição reversa-PCR, análise de miRNA, Invasão de ensaio e luciferase repórter ensaio de gene
Estas análises foram realizada como previamente descrito [11,41]. descrições detalhadas são fornecidas na seção suplementar de Materiais e Métodos (Texto S1).
Resultados
RNA silenciamento de DCLK1 inibe de xenoenxerto de cancro pancreático crescimento
AsPC-1 pancreático humano as células cancerosas foram injectados subcutaneamente nos flancos de ratinhos NOD /SCID e os tumores foram deixados a desenvolver durante 30 dias. NP siRNAs encapsulada (NPsiDCLK1 e NPsiSCR) foram injectados por via intratumoral. encapsulação de nanopartículas foi realizada para superar as limitações teóricas de entrega à base de siRNA [45]. A eficácia desta abordagem foi anteriormente testada em xenoenxertos de cancro colorrectal [11]. No dia 30, quando os tumores eram palpáveis, os tratamentos foram iniciados e continuaram a cada terceiro dia para um total de cinco injecções. Os tumores foram excisados ao dia 45, e os volumes dos tumores são representados na Figura 1. A administração de NPsiDCLK1 resultou numa redução significativa (~ 85%) (
P
0,01) no volume do tumor em comparação com o controle seja (NPS-alone) ou tumores tratados com NPsiSCR (Figura 1A e 1B). análise de mRNA demonstrou uma regulação negativa significativa (
p Art 0,01) de DCLK1 mRNA em relação ao controle ou NPsiSCR tumores tratados (Figura 1C). Estes dados em conjunto demonstram que a inibição da DCLK1 resultado em AsPC-1 paragem do crescimento de xenotransplante tumoral.
A, AsPC-1 células cancerosas pancreáticas humanas foram injectados subcutaneamente nos flancos de NOD /SCID para gerar tumores. No dia 30, PLGA NP encapsulada siRNAs (siDCLK1 e siSCR) foram injectadas directamente nos tumores e seguido de injecções de três em três dias. Após 5 injecções, os tumores foram excisados e no dia 45 são representados acima. O volume do tumor foi medido a cada 3 dias. B, fotografia representativa de ratinhos portadores de tumores de cada grupo são apresentados. C, A expressão de ARNm DCLK1 nos tumores quantificada por em tempo real de RT-PCR. Os valores são apresentados como média ± SEM, e
asteriscos
denotam diferenças estatisticamente significativas (*
p Art 0,01). Comparação com Control (NP sozinho)
knockdown de DCLK1 resulta na regulação negativa de factores de pluripotência em xenoenxertos de tumores pancreáticos através de miR-145
foi demonstrado que OCT4, SOX2, c-myc, LIN28, NANOG e KLF4 são necessários para CES auto-renovação e pluripotência e são regulados positivamente em alguns cancros agressivos e em CSCs [23-26,28]. Superexpressão desses fatores pode reprogramar ou dedifferentiate células somáticas do mouse humanos e em iPSCs. Aqui observamos uma significativa (
P
0,01) a regulação baixa ( 40%) na expressão de mRNA de marcadores de pluripotência NANOG e KLF4 (Figura 2A e 2B) por em tempo real de RT-PCR após o knockdown de DCLK1. Da mesma forma as proteínas NANOG e KLF4 também foram regulados negativamente tal como analisado por análise imuno-histoquímica (Figura 2C e 2D). Além disso, também se observou um aumento significativo ( 40%). Downregulation de OCT4 (Figura 2E) e SOX2 (Figura 2F), ao nível de ARNm após o knockdown de DCLK1 em AsPC-1 xenoenxertos tumorais
siRNA- knockdown mediada de DCLK1 resultou na regulação negativa de factores de pluripotência: ARNm NANOG (a); ARNm KLF4 (B); proteína NANOG (C); proteína KLF4 (D); ARNm OCT4 (E) e ARNm SOX-2 (F). ARNm foi analisada utilizando em tempo real de RT-PCR e da proteína por análise de imuno-histoquímica. Para gráfico de barras em A, B, E e F, os valores são dados como média ± SEM, e
asteriscos
denotam diferenças estatisticamente significativas (*
p Art 0,01) em comparação com o controle (NP sozinho).
DCLK1 pós-transcricional regula miR-145 em câncer pancreático
miR-145
foi mostrado para reprimir OCT4, SOX2, KLF4 e, reprimindo assim pluripotência e controlar a diferenciação [21].
miR-145
é regulada negativamente em vários cancros e tem sido demonstrado que possuem supressor tumoral e propriedades inibidoras da metástase [29,30]. Relatórios anteriores [11,28,41] e os dados apresentados acima indicam que DCLK1 regula negativamente miRNAs supressores de tumor como let-
7a
,
miR-144 Comprar e
miR-200a
. Da mesma forma, aqui observamos uma indução significativa (1,5 vezes) do
pri-miR-143/145
cluster de miRNA (Figura 3A) e
pri-miR-145
miRNA (Figura 3B) seguindo o knockdown de DCLK1 em AsPC-1 xenoenxertos de tumor. Além disso, foi realizado um ensaio de gene repórter luciferase para medir quantitativamente o efeito de DCLK1 knockdown no
miR-145
miRNA. células AsPC-1 foram transfectadas com um plasmídeo contendo o gene da luciferase do pirilampo com um
miR-145 local complementar
de ligação ao UTR 3 ‘. Após a transfecção, as células foram tratadas com PN sozinho, ou NPsiDCLK1 NPsiSCR, e foram sujeitas a medição da actividade de luciferase. Observou-se uma redução na actividade da luciferase em células tratadas com NPsiDCLK1 comparação com o controlo ou NPsiSCR (Figura 3C). Estes dados sugerem que knockdown dos resultados DCLK1 na regulação negativa da
miR-145
miRNA alvos a jusante em células de câncer de pâncreas. Tem sido demonstrado anteriormente que existe um mecanismo de feedback loop entre
miR-143/145 Comprar e KRAS e RREB1. RREB1 é conhecido para reprimir a transcrição de
miR-143/145
ligando-se a sua região promotora. Além disso, KRAS e RREB1 são alvos a jusante de
miR-143/145
[29]. Knockdown de DCLK1 resultou em aumento da expressão de
miR-143/145
cluster e regulação negativa do seu alvo a jusante KRAS (Figura 3D). Além disso, descobrimos que a expressão de RREB1 foi significativamente regulada negativamente na sequência da administração de ARNsi contra DCLK1 (Figura 3E). Com esses dados, especula-se que DCLK1 desempenha um papel na regulação pós-transcricional de
miR-143/145
cluster e, assim, regula negativamente KRAS e RREB1 em xenoenxertos de tumores pancreáticos.
Após o knockdown de DCLK1 em AsPC-1 xenoenxertos de tumores, uma regulação positiva significativa de
miR-143/145
conjunto (a) e
miR-145
miARN (B) em tempo real de RT-PCR. C, uma diminuição na atividade da luciferase (unidades de luciferase) após transfecção com luciferase plasmídeo de codificação contendo o
miR-145
sítio de ligação foi observada após o knockdown de DCLK1 em AsPC-1 células cancerosas pancreáticas humanas. Knockdown de DCLK1 também resultou na regulação negativa da KRAS (D) e RREB1 (E) ARNm, alvos a jusante de
miR-143/145
cluster de miARN, analisados utilizando em tempo real de RT-PCR. Os valores são apresentados como média ± SEM, e
asteriscos
denotam diferenças estatisticamente significativas (*
p Art 0,01). Comparação com Control (NP sozinho)
no geral, esses dados tomados em conjunto demonstram um papel regulador potencial para DCLK1 na expressão de fatores da iPSC em cânceres de pâncreas através de
miR-145
miRNA.
DCLK1 regula deixá-7a e sua LIN28B alvo a jusante em
câncer pancreático
nas células de câncer pancreático e colorretal, já anteriormente demonstrado que DCLK1 regula negativamente miRNA let-
7a
. knockdown mediado por siRNA de DCLK1 resultou na regulação negativa da let-
7a
alvos a jusante c-myc e KRAS. Em xenoenxertos de tumores pancreáticos tratados com NPsiDCLK1, observou-se uma regulação positiva significativa de let-
7a
(Figura 4A) e subsequente regulação negativa do seu alvo a jusante de c-myc (ARNm e proteína) (Figura S1). Relatórios sugerem que LIN28B, um factor de manutenção pluripotência regula miRNA let-
7
e por sua vez let-
7
regula LIN28B (devido à presença de local de ligação na 3 ‘UTR de LIN28B) , o que sugere um ciclo de feedback negativo dupla entre LIN28 e let-
7
[46,47]. Aqui nós queria ver se NPsiDCLK1 regula alvos a jusante de let-
7a
miRNA. células AsPC-1 foram transfectadas com o plasmídeo do gene que codifica a luciferase do pirilampo sob o controlo de UTR 3 ‘contendo o sítio de ligação para let-
7
. Após a transfecção, as células foram tratadas com NPsiDCLK1 e submetidas a medição da luciferase. Após a knockdown de DCLK1, observou-se uma regulação negativa significativa de
let-7
atividade luciferase dependente (Figura 4B), indicando que NPsiDCLK1 regula alvos a jusante de let-
7
em células de câncer de pâncreas. Com base em análise em tempo real de RT-PCR de tumores tratados com NPsiDCLK1, observou-se uma regulação negativa significativa de ARNm LIN28B comparação com NPsiSCR ou tumores tratados com controlo (Figura 4C). Estes dados indicam que DCLK1 regula LIN28B via
let-7
mecanismo dependente.
A, knockdown siRNA mediada por DCLK1 no tumor xenotransplantes resulta em aumento da expressão de
pri-let- 7a
miRNA. B, Seguindo o knockdown de DCLK1, uma diminuição na
let7a miR-
actividade de luciferase dependente foi observada em células AsPC-1. C, mRNA LIN28B alvo a jusante de let-
7a
foi regulada negativamente em tumores tratados com NPsiDCLK1. Valores nos gráficos de barras são dados como média ± SEM, e asteriscos denotam diferenças estatisticamente significativas (*
P Art 0,01). Comparação com Control (NP sozinho)
DCLK1 regula miR-200 genes da família e EMT no cancro pancreático
EMT é um processo altamente conservado, caracterizado por a conversão fenotípica das células epiteliais para as células mesenquimais [7]. EMT é essencial em vários processos incluindo a morfogénese órgão, cicatrização de feridas, a metástase do câncer e remodelação do tecido embrionário em desenvolvimento. Estudos recentes têm demonstrado que
miR-200a, b
e
c
(
miR-200
) são conhecidos para regular EMT e angiogênese [48]. Estudos anteriores demonstraram que DCLK1 é sobre-expresso em tecidos de câncer pancreático humano e co-localiza com caracol e lesma. Após a knockdown de DCLK1, uma regulação baixa significativa de ZEB1, ZEB2, Caracol e SLUG foi observado após aumento da expressão de
pri-miR-200a
em AsPC-1 células cancerosas [11]. Da mesma forma no ASPC-1 xenoenxertos de tumores, uma indução de duas vezes de
pri-miR
-200
um
(
P
0,01) (Figura 5A) foi observada . Além disso, quisemos investigar o efeito da DCLK1 knockdown na expressão de
miR-200b e
c
em AsPC-1 xenotransplantes tumorais. Similar ao
miR-200a
, foi observada uma regulação positiva significativa de
miR-200b (1,5 vezes) (Figura 5A) e
miR-200c
(2 vezes ) (Figura 5A) após o knockdown de DCLK1. Em seguida, queríamos investigar se DCLK1 regula os alvos a jusante de
miR-200
. Foi realizado um ensaio de repórter luciferase para
miR-200
. AsPC-1 células foram transfectadas separadamente com plasmídeos que codificam o gene da luciferase sob a regulação de locais de ligação de miRNA (três plasmídeos contendo cada sítios de ligação para
miR-200a, b
ou
c
) na sua 3 ‘UTR. Após transfecção, nós tratamos as células com NP-siDCLK1. Os lisados celulares foram submetidos a medição da luciferase. Após a knockdown de DCLK1, houve uma regulação baixa significativa da actividade da luciferase mediada
miR-200a
,
miR-200b e
miR-200c
(Figura 5B). Estes dados indicam que DCLK1 regula
miR-200
e seus alvos a jusante em PDAC. Observou-se também uma redução subsequente de
miR-200
jusante metas ZEB1 e ZEB2 (Figura 5C), Caracol e SLUG (Figura 5D) seguindo o knockdown de DCLK1 em xenoenxertos de tumores pancreáticos. Além disso células AsPC-1 foram tratados com NPsiSCR ou NPsiDCLK1 e submetido a ensaio de invasão usando câmaras de invasão BD Biosciences Matrigel (BD BioCoat
TM). Observou-se uma inibição significativa da invasão seguindo o knockdown de DCLK1 (Figura 5E e F). Estes dados em conjunto indicam que knockdown de DCLK1 inibe EMT e invasão de regulação
miR-200
em xenoenxertos de tumores e células cancerosas no pâncreas humano. Da mesma forma que nossos estudos anteriores, seguindo o knockdown de DCLK1, também observamos a inibição da NOTCH1 via
miR-144
(Figura S2) em AsPC-1 xenotransplantes tumorais.
A, siRNA mediada knockdown dos resultados DCLK1 no aumento da expressão de
pri-miR-200a
,
pri-miR-200b e
pri-miR-200c
por real-time RT-PCR . B, Após o knockdown de DCLK1, uma diminuição na
miR-200a
,
miR-200b e
atividade miR-200c
dependente luciferase foi observado em células AsPC-1 . xenoenxertos de tumor tratado com NPsiDCLK1 demonstrou uma regulação negativa de EMT factores de transcrição e ZEB1 ZEB2 ARNm (C), diminuição do caracol e Slug expressão de ARNm de (D). E, a inibição da DCLK1 resultados na inibição da invasão de siRNA mediada em células AsPC-1. As setas brancas indicam as células invadidas através da matriz Matrigel. F gráfico, barra representa a quantificação de células invadidas a seguir a cada tratamento. As células foram contadas em 5 campos diferentes para cada inserção. Valores nos gráficos de barras são dados como média ± SEM, e asteriscos denotam diferenças estatisticamente significativas (*
P Art 0,01). Comparação com Control (NP sozinho)
DCLK1 regula fatores angiogênicos em PDAC
tem sido demonstrado que
miR-200
inibe a invasão adenocarcinoma de pulmão e metástase alvejando VEGFR1. Um sítio de ligação putativo para
miR-200
foi observada na UTR 3 ‘de VEGFR1, e demonstrou-se que
miR-200
regula negativamente a VEGFR1 [48]. Além disso, um estudo recente demonstrou que VEGFR1 e VEGFR2 tem um local de ligação para
miR-200b
e com base no ensaio de repórter baseado em luciferase
miR-200b
regula esses fatores angiogênicos [49]. Estes dados indicam que VEGFR1 e VEGFR2 são alvos a jusante de
miR-200
. Aqui, encontramos DCLK1 regulação
miR-200
e seus alvos a jusante. Queríamos investigar o efeito de DCLK1 knockdown em fatores angiogênicos VEGFR1 e VEGFR2. Observou-se uma regulação negativa significativa de ARNm VEGFR1 (Figura 6A), proteína (Figura 6B e C – painel da esquerda) em tumores tratados com NPsiDCLK1 comparado com o controlo e tratados com NPsiSCR tumores. Observamos, também, a regulação negativa do mRNA VEGFR2 (Figura 6E) e proteína (Figura 6C – painel da direita) em xenoenxertos de tumor pancreático tratados com NPsiDCLK1. Além disso, foram realizados ensaios de repórter de luciferase para baseada VEGFR1 e VEGFR2. células AsPC-1 foram transfectadas com o gene de luciferase com VEGFR1 ou VEGFR2 UTR 3 ‘, tratado com NPsiDCLK1 e submetidas a medição da actividade de luciferase. Seguindo o knockdown de DCLK1, observou-se uma regulação negativa significativa de VEGFR1 (Figura 6D) e VEGFR2 (Figura 6F) 3 ‘UTR actividade da luciferase mediada. Estes dados em conjunto indicam que DCLK1 regula VEGFR1 e VEGFR2
através de miR-200
no PDAC.
A, knockdown siRNA mediada por DCLK1 resulta na diminuição da expressão de mRNA VEGFR1 no NPsiDCLK1 tratada xenotransplantes tumorais . Uma diminuição na proteína VEGFR1 foi observado em tumores tratados NPsiDCLK1 (B – Western blot; C – imunofluorescência – painel da esquerda, VEGFR1 vermelho). D, segundo o knockdown de DCLK1, uma diminuição na actividade de luciferase VEGFR1-3’UTR-dependente foi observada em células AsPC-1. E, knockdown de DCLK1 resulta na diminuição da expressão de ARNm em VEGFR2 NPsiDCLK1 tratada xenoenxertos de tumor. F, uma diminuição na actividade de luciferase dependente da VEGFR2-3’UTR foi observada em células AsPC-1. knockdown NPsiDCLK1 mediada por DCLK1 resultou na diminuição da expressão da proteína VEGFR2 estimada usando a análise de imunofluorescência (C – painel da direita, VEGFR2 vermelho). Valores nos gráficos de barras em A, B, D e E, são dados como média ± SEM, e asteriscos denotam diferenças estatisticamente significativas (*
P Art 0,01). Comparação com Control (NP sozinho)
Discussão
miRNAs estão a emergir rapidamente como reguladores críticas de praticamente todos os processos celulares importantes. Desregulação dos miRNAs são bastante comuns em muitos cancros humanos, incluindo PDAC. Em muitos tumores, há quer um sobre-expressão dos chamados miARNs oncogénicos (por exemplo,
miR-155
,
miR-17-5p e
miR-21
) [ ,,,0],15,16] ou downregulation dos miRNAs supressores de tumor (por exemplo,
miR-34
,
miR-15a
,
miR-16-1 Comprar e let-
7
) [17-20]. O let-
7
e
miR-200
famílias são reguladores de programas-chave de diferenciação bem conhecido durante o desenvolvimento. Perda de let-
7
no resultado de câncer em progressão e desdiferenciação, e
miR-200
família foi mostrado para ser um regulador chave da EMT. Além disso, estudos recentes têm relacionado let-
7
com a manutenção de células-tronco e EMT. Assim é bem possível que a progressão tumoral pode representar um processo que resulta na desdiferenciação progressiva (EMT) para um tipo de célula que tem um fenótipo celular como haste. Além disso, este processo parece ser regulado por mecanismos dependentes de miARN [10,11,27,30]. DCLK1 regula EMT em células de cancro pancreático humano
via
um
miR-200a
mecanismo dependente [11] e também é um regulador de let-
7a
no pâncreas e cancro colorectal células, que apoia o conceito de que estes miRNAs são alvos relevantes e inovadoras em vários cancros de tumores sólidos [10,11,27,30,41]. DCLK1 é um marcador putativo de células-tronco intestinais e pancreáticas e é regulada em vários tumores sólidos que fornecem evidências adicionais de seu papel-chave potencial no processo tumorigénico. Neste relatório, nós demonstramos que além de regular vários miRNAs supressores de tumores e metas oncogênicos a jusante, de inibição DCLK1 resulta em regulação positiva de miRNAs que regulam negativamente vários pluripotência chave e factores pró-angiogénicos. Estes dados suportam a noção de que o DCLK1 é um regulador central do processo de tumor.
Repressão ao
miR-143 Comprar e
miR-145
, dois miRNAs co-transcrito localizado no cromossoma 5q humano, tem sido descrita em cancro do pâncreas. Acumulando dados sugerem que possuem actividade supressora de tumor [50,51]. Reduzido
miR-143/145
expressão é uma característica comum de muitos tipos de tumores, incluindo carcinoma colorectal e PDAC [29,50,51]. Além disso, a expressão destes miRNAs inibe a proliferação e ativa a apoptose das células cancerosas
in vitro
e
in vivo
[29].