T reguladoras (Treg) infiltrar glioblastoma humano (GBM); estão envolvidos em progressão tumoral e correlacionam com o grau do tumor. eliminação transitória de Tregs usando CD25 anticorpos que destroem (PC61) foi encontrado para mediar regressão GBM em modelos pré-clínicos de tumores cerebrais. Os ensaios clínicos que combinam esgotamento Treg com vacinação tumor estão em andamento para determinar se transitória Treg esgotamento pode melhorar as respostas imunes anti-tumorais e melhorar a sobrevivência a longo prazo em pacientes com câncer.

Achados

Usando um intracrabial singênica glioblastoma (GBM) modelo do rato que mostram que a depleção sistémica de Tregs 15 dias após a implantação do tumor usando PC61 resultou numa diminuição em Tregs presente em tumores, a drenagem dos gânglios linfáticos e do baço e melhorou a sobrevivência a longo prazo (50% dos ratinhos sobreviveram 150 dias). Não foi observada nenhuma melhoria na sobrevivência quando Tregs foram esgotados 24 dias após a implantação do tumor, o que sugere que a carga tumoral é um factor importante para determinar a eficácia da depleção de Treg em ensaios clínicos. Em um modelo dependente de células T de regressão do tumor cerebral provocada pela entrega intratumoral de vectores adenovirais (Ad) expressando tirosina quinase 3 ligando Fms-like (Flt3L) e Herpes Simplex Tipo 1-Timidina quinase (TK) com ganciclovir (GCV), demonstramos que a administração de PC61 de 24 dias após a implantação do tumor (7 dias após o tratamento) de células T inibiu a regressão do tumor dependente e sobrevivência a longo prazo. Além disso, a depleção com expansão clonal PC61 completamente inibida de linfócitos T específicos para o antigénio de tumor, em resposta ao tratamento.

Conclusões

Os nossos dados demonstram, pela primeira vez, que, embora a depleção Treg inibe a progressão /elimina tumores GBM, a sua eficácia é dependente da carga do tumor. Conclui-se que esta abordagem seja útil num ambiente de doença residual mínima. Além disso, também demonstram que a depleção de Treg, usando PC61 em combinação com a imunoterapia, inibe a expansão clonal de células T específicas para o antigénio de tumor, o que sugere que os novos alvos, mais específicos para bloquear Tregs será necessária quando utilizadas em combinação com terapias anti que activam imunidade tumoral

Citation:. Curtin JF, Candolfi M, Fakhouri TM, Liu C, Alden A, Edwards M, et al. (2008) Treg depleção Inibe Efficacy of Cancer Imunoterapia: Implicações para os ensaios clínicos. PLoS ONE 3 (4): e1983. doi: 10.1371 /journal.pone.0001983

editor: Karen S. Aboody, City of Hope Medical Center e Instituto de Pesquisas Beckman, Estados Unidos da América

Recebido: 09 de janeiro de 2008; Aceite: 10 de março de 2008; Publicação: 23 de abril de 2008

Direitos de autor: © 2008 Curtin et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho é suportado pelo National Institutes of Health /Instituto Nacional de Doenças neurológicas Acidente vascular cerebral (NIH /NINDS) Grant 1R01 NS44556.01, Minority Suplemento NS445561.01; 1R21-NSO54143.01; 1UO1 NS052465.01, 1 SR3 TW006273-01 para M.G.C .; NIH /NINDS Grants 1 SR1 NS 054.193,01; SR1 NS 42.893,01, U54 NS045309-01 e 1R21 NS047298-01 para P.R.L. O Bram e Elaine Goldsmith e do Grupo Medalhões Cadeiras dotado no Gene Therapeutics a PRL e MGC, respectivamente, o Linda Tallen David Paul Kane Anual da Fundação Fellowship e pelo Conselho de Governadores na CSMC. MC é suportado pelo NIH /NINDS 1F32 NS058156.01

Conflito de interesses:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

Glioblastoma multiforme (GBM) é um tumor cerebral primário mortal que é altamente invasiva com células tumorais que se infiltram no tecido cerebral circundante saudável [1]. A sobrevivência média dos pacientes diagnosticados com GBM é de um ano (4-6 meses após o retorno), com menos do que 5% dos pacientes restantes vivos 5 anos após o diagnóstico [2]. Melhorias na cirurgia, quimioterapia e radioterapia não foram traduzidos em melhorou significativamente o prognóstico para pacientes com GBM; sobrevivência a longo prazo (5 anos após o diagnóstico) não melhorou desde 1950 [3]. A recorrência do tumor quase sempre ocorre mesmo se a cirurgia com sucesso remove a maioria da massa tumoral primária. Os novos tratamentos para prevenir ou tratar a recorrência do tumor são necessários urgentemente para tratar pacientes com diagnóstico de GBM.

A imunoterapia tem sido proposta como uma abordagem poderosa para evitar a recorrência do tumor, eliminando as células tumorais, poupando circundante normal células saudáveis ​​[4], [5]. Vários ensaios clínicos estão em andamento para testar se a imunoterapia é segura e eficaz para tratar GBM [6], [7]. GBMs mais antigénios de tumor, tais como MAGE expresso, Her2 /neu, tirosinase, Trp-1, Trp-2, gp100, IL13Rα2, Survivina (revisto em [8]) e o EphA2 [9]. O sistema imunitário normalmente esculpir tumores resultantes da perda de expressão do antigénio do tumor [10], [11], no entanto, a localização do GBM no cérebro, um locus de privilégio imune [12], [13], ou a presença de uma altamente ambiente imunossupressor em tumores cerebrais [14], [15] pode ser razões pelas quais GBM comumente mais de antígenos tumorais expressos em pacientes. células dendríticas autólogas (DC) carregadas com péptidos tumorais GBM [16] ou lisado de tumor autólogo [17] foram utilizados para vacinar pacientes em duas recentes de Fase I de ensaios clínicos. Não houve aumento significativo na sobrevivência foi observada usando lisados ​​tumorais autólogas [17]. No entanto, o tempo médio de progressão ea sobrevida média dos pacientes tratados com vacinas peptídicas base foi aumentada em comparação com os pacientes que foram tratados durante o mesmo período de tempo com as terapias convencionais [16]. Curiosamente, uma sub-população de respondedores ao tratamento foram identificados pela expressão de baixas concentrações de TGF-p no cérebro. expressão intratumoral de TGF pode suprimir a resposta imune adaptativa contra o antígeno [4], [5] e foi preditivo de desfecho clínico após a vacinação [16]. Além disso, o antigénio de tumor circulantes CD8 específicas,

+ linfócitos T foram identificadas em pacientes GBM [18], mas o ambiente imunossupressor no tumor impede a eliminação de GBM a partir destes pacientes.

respostas de células T contra antigénio tumoral medida por tetrâmeros e ELISPOT nem sempre se correlacionam com regressão do tumor em ensaios clínicos imunoterapias teste para GBM humana [19]. Isto sugere que a supressão de respostas imunitárias eficazes contra antigénios tumorais podem interferir com a regressão do tumor dependente imune. Recentemente, pesquisadores têm investigado se o esgotamento de um subconjunto de linfócitos T chamados linfócitos T reguladoras (Tregs) pode potenciar imunoterapias contra o câncer. Tregs são uma subpopulação de células T CD4

+ linfócitos T que expressam constitutivamente o factor de transcrição Foxp3, a elevada afinidade de IL2 receptor de CD25 e do ligando de B7 CTLA4 [20]. Tregs são necessários para a manutenção da tolerância durante toda a vida do organismo [21] e mutações em Foxp3 são conhecidos por causar doenças auto-imunes agudas em seres humanos [22]. Foxp3

+ Tregs se acumular dentro gliomas humanos durante a progressão do tumor [23] e foram correlacionadas com o grau do tumor [24]. A sobrevivência foi melhorada quando Tregs foram esgotadas de ratinhos portadores de tumor GL261 utilizando anticorpos CD25 administrado 7 dias após a implantação do tumor e três vezes por semana durante 3 semanas depois [25]. Além disso, a administração de anticorpos que destroem CD25 foram também demonstraram melhorar a sobrevivência quando administrado em combinação com DC transfectadas com ARNm de tumor num modelo de GBM [26].

Nós desenvolvemos recentemente uma abordagem de terapia génica combinada destinada a engenharia do microambiente do tumor para induzir a migração para dentro da massa do tumor de APCs e induzir morte de células de tumor [27]. A nossa abordagem consiste em expressar tirosina-quinase 3 de ligando do tipo fms (Flt3L), que induz a infiltração de células dendríticas (DC) para o parênquima cerebral [28] em combinação com o gene condicional citotóxica Timidina cinase (TK) [27], [29], que na presença de GCV induz a morte das células tumorais. Esta abordagem combinada induz a regressão do tumor dependente de células T [27]. Nós fato para avaliar os efeitos induzidos pelo esgotamento das Tregs; na progressão do tumor em ratinhos portadores de GBM não tratados e sobre a regressão do tumor do cérebro dependente da célula T induzida por Ad-Flt3L e tratamento Ad-TK. Os nossos dados demonstram que a depleção de Tregs CD25 utilizando o hibridoma específica PC61 induzida a regressão do tumor e a sobrevivência a longo prazo, quando administrado 15 dias após a implantação do tumor, independente de linfócitos T específicos de antigénios tumorais. Em combinação com a entrega intratumoral de Ad-Flt3L e Ad-TK, no entanto, verificou-se que a administração de PC61 de 24 dias após a implantação do tumor (7 dias após o tratamento) as respostas imunitárias adaptativas completamente suprimida contra antigénios tumorais GL26. Além Tregs, CD25 também é expresso na superfície da célula de precursor de B e linfócitos T e uma subpopulação de DC maduras [30] e também é regulado positivamente na superfície celular de linfócitos T activados e linfócitos B [31]. No nosso modelo, a administração de CD25-anticorpos também eliminou activados, linfócitos

+ T CD25 e impediu a expansão clonal de células T específicas para o antigénio tumoral. Os nossos dados sugerem que o uso de PC61 visando depleção Treg podem reduzir a eficácia dos regimes imunoterapêuticos suprimindo a activação e a expansão clonal dos linfócitos T específicos de antigénios tumorais.

Resultados

singeneicos tumores intracranianos são GBM densamente infiltrada por células imunes, incluindo Tregs

a acumulação de Foxp3

+ Tregs em gliomas humanos se correlaciona com o grau do tumor e sobrevida do paciente [24]. A acumulação de Foxp3

+ Tregs em gliomas singeneicas de ratinho também tem sido descrito e depleção de Tregs com imunoglobulinas específicas de CD25 pode induzir a regressão do tumor e melhorar a sobrevivência nestes modelos pré-clínicos [25], [32], [33]. A fim de investigar se o esgotamento de Treg poderia melhorar o resultado terapêutico em combinação com a terapia de imunoterapia /gene, que estabeleceu pela primeira vez se Tregs infiltrado no glioma de rato singeneico oriundas da implantação intracraniana de células GL26 para o corpo estriado do cérebro. Implantação de células GL26 singeneicos reprodutivelmente levou ao crescimento linear de tumores (R

2 0,99) com um volume de tumor médio de cerca de 0,5 mm

3 no dia 15 e 30 vezes maiores (15 milímetros

3) em dia 24 (Fig. 1A). Estes tumores exibem infiltração profusa de CD45

+ e F4 /80

+ células, que são evidentes em toda a massa tumoral e também nas fronteiras (Fig 1B). infiltração de células imunes para os tumores também foi avaliada por citometria de fluxo de 24 dias após a implantação do tumor (Fig. 1 C). Detectamos tumor infiltrando mDC (CD11c

+ CD45

+ IA

b +, Fig. 1CI) e MO (CD11b

+ CD45

+ IA

b +, Fig. 1Cii) que representavam 3,5% e 19% do número total de células CD45 + imunes presentes no tumor, respectivamente. Os linfócitos também foram identificados e constituiu ~ 80% do número total de células do sistema imunológico que se infiltram os tumores (Fig. 1 C III-VI) CD45 +. Estes incluíram CD4

+ células T (CD3ε

+ CD4

+ CD8a

-, 26%), CD8a

+ células T (CD3ε

+ CD4

– CD8a

+, 18%), Foxp3

+ Tregs (CD3ε

+ CD4

+ Foxp3

+, 8,4%), as células NK (CD3ε

– NK1.1

+ CD45

+, 18%), as células NK-T (CD3ε

+ NK1.1

+ CD45

+, 7%) e as células B (CD3ε

– CD19

+ CD45

+, 5%). A presença de CD4

+, CD8a

+, CD19

linfócitos +, bem como CD205 mDC também foram observados por imunofluorescência (Fig. 1 D). Além disso, observaram-se grandes números de linfócitos que eram imunorreactivos para CD25 no interior do tumor através de microscopia confocal (Fig. 1 D) e citometria de fluxo (CD3ε

+ CD25

+ CD45

+) (fig. 1 E, F). Além disso, a percentagem de CD3ε

+ células T que expressam CD25 na superfície celular foi ~ 40% do número total de tumores infiltrantes células T e foi muito elevado no nodo de drenagem (cervical) linfa (DLN) (p 0,05) e tumor (p 0,01) (Fig. 1E). quando comparado com o baço de ratinhos portadores de tumor

(a) GL26 volume do tumor 7, 14 e 21 dias após implantion para o corpo estriado do cérebro de ratinhos C57BL /foi determinada seis ratinhos. coloração astrocítica reactivo (GFAP +) foi usada para definir a fronteira do tumor com o tecido cerebral não-maligno. As secções representativas do cérebro do rato portadores de tumores implantados 7, 14 e 21 dias e corados com GFAP estão apresentados à esquerda. cinética de crescimento de tumor foram essencialmente exponencial durante o período de tempo analisados ​​com um tempo de duplicação de aproximadamente 1,8 dias. 5 ratinhos foram usadas para determinar o volume do tumor em cada ponto de tempo. (B) a infiltração de células imunitárias em tumores intracranianos GL26. secções do cérebro de ratinhos portadores de tumores foram coradas com anticorpos contra CD45 (leucócitos) ou F4 /80 (macrófagos /microglia activada). imagens confocais representativos mostram células imunes (verde) no interior da massa do tumor e nas fronteiras de tumor. DAPI (azul) foi utilizado para corar os núcleos. Setas amarelas indicam células imuno-reactivos. T: tumor. (C) do tumor infiltrado de células imunitárias foram isoladas a partir de tumores 24 dias após a implantação do tumor e analisados ​​utilizando citometria de fluxo. (I) Dot lote de CD11c contra I-Ab, que foi fechado pela primeira vez para leucócitos CD45 + ao vivo. DC (CD11c + CD45 + I-Ab +) são mostradas na caixa vermelha. (Ii) Os macrófagos (MO) foram avaliadas por gating leucócitos ao vivo com CD45, em seguida, traçando CD11b contra I-Ab. A caixa vermelha delineia a população de macrófagos infiltrantes tumorais (CD11b + CD45 + I-Ab +). (Iii) células T foram coradas com CD3ε-PE, CD4-PerCP e CD8a-FITC. A trama mostra CD4 contra CD8a quando as células foram fechado em primeiro lugar para CD3ε + leucócitos ao vivo. As células T CD4 + e células CD8a + T estão apresentados em caixas vermelhas. (Iv) Tregs infiltrado no tumor foram observadas por coloração com CD3ε-PE, PerCP-CD4-FITC e Foxp3. CD3ε + leucócitos vivos foram fechado e gráficos de pontos exibir Foxp3 contra coloração CD4. A população de Tregs (CD4 + Foxp3 + CD3ε +) são mostradas na caixa vermelha. (V) as células NK e NK-T foram visualizados por gating CD45 ao vivo + leucócitos, em seguida, exibindo NK1.1 contra CD3ε. A população de células NK se infiltram no tumor (CD3ε- CD45 + NK1.1 +) e células NK-T (CD3ε + CD45 + NK1.1 +) são apresentados em caixas vermelhas. (Vi) Tumor infiltrando células B são visualizados através gating para leucócitos ao vivo, em seguida, traçando CD45 contra CD19. A população de células B (CD19 + CD45 +) é mostrado numa caixa vermelha. As percentagens de cada população de células imunitárias infiltrar o tumor em relação ao número total de células CD45 + de tumor é indicado em gráficos de pontos representativos. coloração (D) de Nissl foi usada para visualizar os tumores no cérebro. Os tumores são densos em substância de Nissl, então mancha mais escura do que o tecido cerebral normal. Imagens representativas confocais mostram tumor infiltrado de células T CD4 +, células T CD8 +, CD205 + mDCs, células B CD19 + e células CD25 + imunes (visto no verde) e DAPI (azul) foi usada para visualizar os núcleos. Setas amarelas indicam células imuno-reactivos. (E) análise de citometria de fluxo da percentagem de células T que expressam CD25 em baços, DLN e em ratinhos portadores de tumores intracranianos cérebro GL26 tumores 24 dias após a implantação do tumor. (F) gráficos de pontos representativos de CD25 vs CD3ε em células imunológicas isoladas a partir do baço, LN e tumor. As percentagens de população de células CD25 + em relação ao número total de células CD3ε + no tumor, drenando os gânglios linfáticos ou do baço são indicados em gráficos de pontos representativos.

A exaustão das Tregs usando PC61 induz a regressão do tumor cerebral mas também reduz as células T no tumor e DLN

Considerando que detectada extensa infiltração de regs T dentro dos tumores intracranianos GL26, que visa a esgotar esta população de células imunitárias, a fim de determinar o seu efeito sobre a progressão de células de tumor e em anti-tumoral resposta imune induzida por um abordagem imunoterapêutica dependente de células T, isto é, o Ad-Flt3L /TK. O hibridoma de IgG1 de rato PC61 verificou-se ligam com alta afinidade para o receptor da IL-2 (CD25) [34] e

In vivo

administração de PC61 a ratinhos provoca o esgotamento de Tregs por mais de uma semana [33] , [35]. Desta forma, utilizamos este anticorpo para induzir a depleção de células T reg

in vivo

em um modelo de glioma intracraniano rato singênica. Em primeiro lugar, determinar se PC61 afetaria a viabilidade das células do tumor e crescimento

in vitro

e

in vivo

. A incubação de células GL26 com PC61 não afetou a viabilidade celular GL26 (Fig. 2A) ou a proliferação

in vitro

(Fig. 2B). Em seguida, administrado IgG PC61 ou controlo de isotipo para os ratinhos portadores de tumor atímicos nu /nu, que foram mostrados para ser deficiente em regs T [26], [36]. Ao somar com outros relatórios [26], descobrimos que o crescimento do tumor em T reg deficiente

nu /nu

camundongos deficientes imunológico não foi afetada pelo PC61; tanto de controlo de isotipo ou os ratinhos injectados com PC61 sucumbiram devido à carga de tumor 18-22 dias após a implantação do tumor.

células GL26 (A) foram incubadas durante 48 h com 100 ng /ml de PC61 ou 100 ug /ml de IgG1 de rato de controlo de isotipo. As células foram então colhidas e coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio para identificar células apoptóticas. Não houve aumento significativo na apoptose foi observada quando as células foram incubadas com PC61 ou de controlo de isotipo de imunoglobulinas compara com os controlos não tratados (p 0,05). Um grande aumento na apoptose foi observada quando as células foram incubadas durante 4 h com H2O2 (P 0,001). As barras de erro representam o erro padrão a partir de 3 repetições e o ensaio foi repetido 3 vezes. One Way ANOVA com pós-teste de Tukey foi utilizado para calcular diferenças significativas (*** p 0,001). (B) A proliferação de células foi medida por GL26 detectar a incorporação de BrdU no ADN. Não foi observada diferença significativa na proliferação (p 0,05) quando as células foram incubadas com PC61 (rato IgG1αCD25) em comparação com controlos de isotipo (IgG1 de rato), ou células não tratadas (*** p 0,001 comparado com negativo (ausência de células) de controlo, ns = não significativo). (C) atímicos nu /nu ratinhos (Balb /c de fundo) foram inoculados com uma única injecção intracraniana de células GL26 e tratou-se 15 dias mais tarde com 1 mg, quer PC61 ou controlo de isotipo de imunoglobulinas injectados i.p. A sobrevivência foi monitorizada e os ratinhos foram eutanizados quando moribundos. Nenhuma diferença significativa na sobrevida foi observada usando um teste de log rank (p 0,05) (n = 5)

Depois de excluir qualquer efeito direto de PC61 sobre o crescimento de células tumorais que estudaram o efeito da T. esgotamento reg no tipo selvagem camundongos C57 /B6 rolamento glioma GL26 intracraniana. O paradigma experimental utilizado é representado na Fig. 3A. Depleção de Tregs 15 dias após a implantação de células tumorais aumentou significativamente o número de sobreviventes de longo prazo com 40% dos ratinhos ainda estavam vivos depois de 150 dias (P 0,05, Figura 3B.). Esta foi mais do que 5 vezes mais do que a sobrevivência médio de murganhos portadores de tumor de controlo (Fig. 3B). Nenhum aumento significativo na sobrevida a longo prazo foi observado quando Tregs foram esgotados em tumores maiores (24 dias) (p 0,05) e apenas 10% dos ratos sobreviveram a longo prazo deste grupo (Fig 3B.). Curiosamente, não foram observadas quaisquer respostas de DTH quando injetaram células GL26 irradiados na planta da pata de sobreviventes de longo prazo de Treg empobrecido ratos (Fig. 3C). A fim de avaliar os efeitos do tratamento com PC61

in vivo

, foi analisada a presença de Foxp3

+ CD4

+ Tregs infiltrar a massa GBM, bem como nos gânglios linfáticos de drenagem e do baço após a injecção intraperitoneal de PC61 (dias 15 e 24) ou o controlo do isotipo de IgG1 de rato (dias 15 dias) em ratos portadores de tumor. injecção PC61 no dia 15 levou a uma redução de 9 vezes (p 0,001) no número de tumores infiltrantes Tregs quando medida utilizando citometria de fluxo de 12 dias mais tarde (dia 27), e a injecção de PC61 no dia 24 levou à depleção quase completa de Tregs (p 0,001) em que o tumor 3 dias mais tarde (dia 27) (Fig. 3D). Como esperado, as populações periféricas Treg nos nódulos linfáticos de drenagem (Fig. 3E) e baços (Fig. 3F) foram também significativamente reduzidos em comparação com os controlos de isotipo tratados (p 0,001). Curiosamente, foi observada uma redução de 3 vezes na percentagem absoluta de células CD4

+ células T (Fig. 4A) e CD8a

+ células T (Fig. 4B) infiltrantes no tumor após a administração de PC61. populações Além disso, PC61 significativamente empobrecido de CD4

células + T (p . 0,05, Fig 4C) e CD8

células + T (p. 0,01, Fig 4D) nos nódulos linfáticos tumor de drenagem. Não houve alteração verificada nas percentagens de células CD4 +

T e CD8a

+ T células do baço (p . 0,05, Fig 4E-F) e MO e DC manteve-se inalterada em tumores e drenagem gânglios linfáticos embora um ligeiro aumento no baço (Fig. 5).

(a) Diagrama que representa os diferentes tratamentos administrados aos 4 grupos de ratos portadores de tumor. células GL26 foram implantadas no cérebro de todos os ratinhos no dia 0 e foram tratadas pelo fornecimento intratumoral de solução salina no dia 17 com depleção de CD25

+ células que utilizam PC61 no dia 15 (verde) ou no dia 24 (vermelho). grupos de controlo de ratos portadores de tumor receberam roedores controle isotipo IgG1 no dia 15 (azul), ou nenhuma administração sistêmica de imunoglobulinas (Black) como indicado. Os ratinhos foram utilizados tanto para os estudos de sobrevivência, ou sacrificados no momento do implante do tumor de 27 dias, para a análise de populações de células imunitárias através de citometria de fluxo. (B) curva de Kaplan-Meier visualizadas sobrevivência dos 4 grupos de ratos descritas em (A). Dez ratos foram usados ​​em cada grupo e um teste de log-rank foi usado para calcular a significância entre grupo não tratado e os grupos tratados PC61. * P 0,05 comparado com os ratos não tratados e ratinhos tratados com controlo de isotipo. (C) ensaio de DTH foi realizada em ratinhos sobrevivente a longo prazo 100 d após a implantação do tumor. Os ratos tinham sido inicialmente tratado com PC61 no dia 15 (linhas verdes). células irradiadas GL26 em PBS na pata traseira direita (caixa cheia) ou controlo de PBS na pata traseira esquerda (caixa aberta) de camundongos. A espessura da almofada da pata foi determinado 0 h, 4 h, 24 h e 48 h após injecção de células irradiadas ou PBS. Two Way ANOVA com pós-teste de Tukey foi utilizado para calcular diferenças significativas. (D-F) Tregs (CD3ε

+ CD4

+ Foxp3

+) infiltrando tumores (D), linfonodos drenantes (E) ou baços (F) foram quantificados em camundongos administrados roedores controle isotipo IgG1 ( ISO) ou PC61 no dia 15 (15) ou no dia 24 (24), tal como indicado nos gráficos (esquerda). gráficos de pontos (direita) exibir dados representativos de 5 ratos por grupo. As percentagens de regs T em relação ao número total de células CD45 +, os tumores em nódulos linfáticos de drenagem (DLN) ou baço são indicados em gráficos de pontos representativos. One Way ANOVA com pós-teste de Tukey foram utilizados para determinar diferenças significativas (*** p 0,001).

camundongos C57BL /6 foram desafiados com células tumorais no dia 0, e tratado no dia 17 de entrega intratumoral de solução salina. Tregs foram esgotados em cada dia 15 ou dia 24 por injecção ip de PC61. Células imunes foram isolados a partir do baço, do LN cervical e o tumor intracraniano no momento do implante do tumor de 27 dias, para determinar a percentagem de células T CD4 + e células T CD8a + em cada tecido. A percentagem de infiltração de tumor células imunes que eram células T CD4 + (células CD4 + + CD3ε CD8a-) (A) e células CD8a + T (CD4 + CD3ε CD8a +) (B); a percentagem de células imunitárias nos nodos linfáticos de drenagem que eram células T CD4 + (células CD4 + + CD3ε CD8a-) (C) e células CD8a + T (CD4 + CD3ε CD8a +) (d); e a percentagem de células imunes do baço que eram células T CD4 + (células CD4 + + CD3ε CD8a-) (E) e as células CD8a + T (CD4 + CD3ε CD8a +) (F) são mostrados nos gráficos (esquerda). gráficos de pontos representativos para cada grupo de tratamento são exibidos no lado direito (fechado para leucócitos ao vivo com FSC vs SSC e linfócitos CD3ε + T). As percentagens de cada população de células imunitárias em relação ao número total de células CD45 +, os tumores em nódulos linfáticos de drenagem (DLN) ou baço são indicados em gráficos de pontos representativos. One Way ANOVA com pós-teste de Tukey foram utilizados para calcular diferenças significativas. (* P 0,05, ** p 0,01).

GL26 células foram implantadas no corpo estriado do cérebro de ratinhos C57BL /6. imunoglobulinas de rato de controlo de isotipo de IgG1 (-) foram administradas nos dias 15 e PC61 foi administrada no dia 15 ou dia 24, como indicado. A percentagem de macrófagos infiltrantes tumorais (MO; CD11b + CD45 + I-Ab +) (A, C, E) e as células dendríticas mielóides (MDC; CD11c + CD45 + I-Ab +) (B, D, F) foram quantificadas no dia 27 pós-tumoral implante utilizando citometria de fluxo no tumor (a, B) DLN (C, D) e do baço (e, F). As percentagens de cada população de células imunitárias em relação ao número total de células CD45 +, os tumores em nódulos linfáticos de drenagem (DLN) ou baço são indicados em gráficos de pontos representativos. 5 e 10 ratos foram analisados ​​por grupo. One Way ANOVA com pós-teste de Tukey foi utilizado para determinar a significância estatística.

O tratamento com PC61 impede ativação de respostas imunes anti-tumorais adaptativas e inibe a regressão do tumor quando usado em combinação com Ad-Flt3L e Ad- TK

também destinado para investigar os efeitos de depleção de Tregs utilizando uma imunoglobulina anti-CD25 sobre a eficácia da imunoterapia dependente de células T mediada por entrega intratumoral de Ad-Flt3L e Ad-TK [27], [37]. Activado CD4

+ e CD8

linfócitos + T upregulate CD25 da superfície da célula após a ligação inicial do TCR com antigénio apresentado no MHC de [30], [31] e isto poderia explicar a redução aparente em células T que foi observada em tumores (Fig. 4A-B) e DLN (Fig. 4C-D) após a administração de PC61. Para investigar esta ainda mais, e determinar se a eliminação de Tregs usando PC61 poderia afectar adversamente a imunoterapia dependente de células T de GBM, que implantados tumores no corpo estriado no dia 0 e os ratinhos foram tratados com Ad-Flt3L e Ad-TK 17 dias mais tarde, enquanto PC61 ou imunoglobulinas de controlo de isotipo foram administradas a grupos no dia 15 ou dia 24 (Fig. 6A). Quando injetado Ad-Flt3L e Ad-TK para o tumor no dia 17 (quando o tumor era um milímetro

3 em tamanho (Fig. 1A) observou-se um aumento robusto na sobrevivência, com 50% dos ratos vivos 150 dias depois ( p 0,01, Figura 6B) que não foi afectada negativamente pela administração de rato controlo isotipo IgG1 (p .. 0,05) PC61 administrado 2 dias antes da injecção de Ad-Flt3L e Ad-TK redução da sobrevivência a 30%, embora isto não era estatisticamente diferente dos controlos de isotipo tratado (p . 0,05, Fig 6B). no entanto, quando os ratinhos tratados com Ad-Flt3L e Ad-TK no dia 17 e empobrecido Tregs no dia 24, observou-se que a sobrevivência a longo prazo foi significativamente reduzido em comparação com ratinhos que não receberam PC61. (p . 0,05, Fig 6B) Apenas 10% dos murganhos portadores de tumor sobreviveram 150 dias mais tarde, sugerindo que a administração de PC6 17 d após o parto intratumoral de Ad-Flt3L e Ad-TK afecta adversamente o t . regressão do tumor do cérebro dependente da célula em sobreviventes de longo prazo, após tratamento com Ad-Flt3L e Ad-TK, uma resposta de DTH às células GL26 irradiados na almofada da pata foi observado quando os ratos tinham sido administrados quer PC61 (p 0,01) ou controlos de isotipo (p 0,001) (Fig. 6C). Além disso, o tratamento de portadores de tumor ratinhos com Ad-Flt3L e Ad-TK induziu um aumento robusto no número total de células T responsivas tumorais que secretada IFNy quando co-incubados com BMDC carregado com extractos celulares GL26 (p . 0,001, Fig 6D ). Curiosamente, não observamos qualquer aumento de IFN-y secretoras de linfócitos T em resposta a BMDC carregado com extratos de células GL26 quando PC61 foi injetado quer antes (15 dias) ou post (24 dias) de tratamento usando Ad-Flt3L e Ad-TK (p 0,05, Fig. 6D). O número de tumores infiltrantes Tregs foi reduzida após entrega sistémica de PC61 (p . 0,001, Figura 6E) e a percentagem de Tregs foi também significativamente reduzida em DLN e baço, (p . 0,001, Fig 6F-G), independentemente do facto os ratinhos foram tratados com solução salina ou com Ad-Flt3L e Ad-TK.

(a) ratinhos C57BL /6 foram inoculados com células tumorais no dia 0 e tratou-se no dia 17 por entrega intratumoral de Ad-Flt3L e Ad-TK ou solução salina, como indicado. Tregs foram esgotados em ambos os dias 15 (verde) ou 24 dias (vermelho) por injecção ip de PC61 ou no dia 15 com o controlo do isotipo (azul). Células imunes foram isolados a partir do baço, do LN cervical e o tumor. Os ratinhos foram utilizados para ambos os estudos de sobrevivência ou sacrificados no dia 27 para análise de populações de células imunitárias por citometria de fluxo e ELISPOT. (B) curva de Kaplan-Meier exibindo dados de sobrevivência de 10 ratos por grupo. diferenças estatisticamente significativas para Ad-Flt3L e Ad-TK ratos tratados somente (linha preta, sem esgotamento PC61) foram calculados pelo teste de log-rank (* p 0,05, ** p 0,01). A administração de PC61 para os ratinhos 24 dias após a implantação do tumor (7 dias após o tratamento com Ad-Flt3L e Ad-TK) reduziu significativamente a sobrevivência a longo prazo. (C) ratos portadores de tumor foram tratados com Ad-Flt3L e Ad-TK sozinho (linhas pretas) ou com Ad-Flt3L e Ad-TK com esgotamento PC61 no dia 15 (linhas verdes). sobreviventes a longo prazo (60 dias após a implantação do tumor) foram avaliadas para uma resposta de DTH às células irradiadas GL26 injectados na almofada da pata direita (em comparação com apenas PBS na pata esquerda). Two Way ANOVA com pós-teste de Tukey foi utilizado para calcular as diferenças significativas entre os grupos (*** p 0,001 ratos tratados com Ad-Flt3L e Ad-TK não esgotamento, p 0,01 Ad-Flt3L e Ad-TK ratinhos tratados empobrecido com PC61 no dia 15). (D) ELISPOT de IFN-y mostra o número total de linfócitos T produtoras de IFN-y que foram estimuladas com DC carregado com extractos de tumores GL26. Os linfócitos T foram purificadas a partir de murganhos 10 d após o tratamento com qualquer um Ad-Flt3L e Ad-TK (+) ou de soro fisiológico (-), como indicado. barras pretas são linfócitos T de camundongos que não receberam CD25 esgotando imunoglobulinas. As barras verdes são linfócitos T purificados a partir de ratinhos empobrecidos com PC61 2 dias antes do tratamento com Ad-Flt3L e Ad-TK (dia 15 após a implantação do tumor) e as barras vermelhas são linfócitos T purificados a partir de ratinhos empobrecido com PC61 7 dias após o tratamento com Ad-Flt3L e Ad-TK (dia 24 após a implantação do tumor). (E-G) Tregs (CD3ε

+ CD4

+ Foxp3

+) tumores infiltrantes (E), linfonodos drenantes (F) ou baços (G) foram quantificados em camundongos administrados controle de rato IgG1 isótipo ( Iso) ou PC61 no dia 15 (15) ou no dia 24 (24), tal como indicado nos gráficos (esquerda). A administração de PC61 a ratinhos resultou em depleção a longo termo de Tregs em locais periféricos (baço e nódulos linfáticos) e no tumor. gráficos de pontos (à direita) representante visor significa ± SEM de Foxp3

+ Tregs quantificados a partir de 5 ratos por grupo. O número total de regs T nos tumores (E) e as percentagens de regs T em relação ao número total de células CD45 + nos nodos linfáticos de drenagem (DLN) ou baço (F e G) são indicados em gráficos de pontos representativos. Two Way ANOVA com pós-teste de Tukey foram utilizados para determinar diferenças significativas (*** p 0,001).

O tratamento com PC61 impede aumentos de tumor infiltrando células T e MO, mas não DCs após o tratamento com Ad