Sumário

quinase

ciclina G-associado (GAK), um jogador-chave no tráfico de membrana mediada por clatrina, é abundante em várias células cancerosas. Aqui, nós relatamos que a expressão GAK é positivamente correlacionada com a pontuação de Gleason em espécimes cirúrgicos de pacientes com câncer de próstata. fibroblastos embrionários de ratinhos knockout que expressam uma forma de cinase morta (KD) de GAK constitutiva mostrou hiper-fosforilação do receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR). Além da bem conhecida inibidores de EGFR gefitinib e erlotinib, a luteolina flavonóide dietética era um potente inibidor da actividade de cinase de Ser /Thr da GAK

In vitro

. Co-administração de luteolina e gefitinib às células PC-3 teve um efeito maior sobre a viabilidade celular do que a administração de cada composto individualmente; Esta diminuição na viabilidade foi associada com drástica diminuição da regulação da expressão da proteína GAK. Uma análise detalhada matriz microARN revelou um aumento da expressão de miR-630 e miR-5703 após o tratamento de células PC-3 com luteolina e /ou gefitinib, e a sobre-expressão exógena de miR-630 provocou a paragem do crescimento destas células. GAK parece ser essencial para a morte celular, porque a co-administração de gefitinib e luteolina de células U2OS do osteossarcoma EGFR-deficiente também teve um maior efeito sobre a viabilidade celular do que a administração de qualquer dos compostos isoladamente. Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que GAK pode ser um novo alvo terapêutico para o câncer de próstata e osteosarcoma

Citation:. Sakurai MA, Ozaki Y, Okuzaki D, Naito Y, Sasakura T, Okamoto A, et al. (2014) gefitinib e luteolina de detenção causar o crescimento do cancro da próstata humano PC-3 As células através da inibição da ciclina G-quinase associada à indução e de miR-630. PLoS ONE 9 (6): e100124. doi: 10.1371 /journal.pone.0100124

editor: Ichiro Aoki, da Escola de Medicina da Universidade de Yokohama, Japão

Recebido: 20 de fevereiro de 2014; Aceito: 21 de maio de 2014; Publicação: 27 de junho de 2014

Direitos de autor: © 2014 Sakurai et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este trabalho foi apoiado em parte pelas bolsas-in-Aid para a Investigação Científica S (No. 15.101.006), Scientific Research B (No. 20370081 e 23370086) e Investigação exploratória (No. 21.651.085) para HN; e Investigação Científica C (No. 22.570.185) para Nova Iorque a partir do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

o câncer de próstata é um dos cancros mais frequentemente diagnosticada e é a principal causa de mortes por câncer do sexo masculino em todo o mundo [1]. Porque é essencialmente ditada por receptor de androgénio (AR) de sinalização, de cancro da próstata avançado é tipicamente tratada por terapia de privação de androgénio, em que a castração cirúrgica ou médica é realizado para bloquear AR activa sinalização, eliminando o ligando ou afectar o receptor directamente [2] . Embora eficaz, a ablação do andrógeno controla câncer de próstata metastático por apenas alguns anos e quase todos os pacientes desenvolvem câncer de próstata hormônio-refratário progressiva (HRPC). terapia de privação de androgénio não é curativa para estes pacientes, mesmo quando combinado com terapias mais eficazes que têm como alvo a síntese central da testosterona, tal como o inibidor de abiraterona CYP17A1 e o antagonista de AR MDV3100 [3], [4]. Identificação de um novo alvo que controla AR sinalização indiretamente, ou mesmo um alvo que não está relacionado com a sinalização AR, pode ser útil para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas para HRPC.

A quinase ubiquamente expressa ciclina G-associado (GAK) regula o tráfico de membrana mediado por clatrina, actuando como um cofactor essencial para desencapsulamento Hsc70-dependente de vesículas revestidas por clatrina no citoplasma [5], [6]. GAK também está localizada para o núcleo [7], onde actua como um coactivador de transcrição de RAs. Notavelmente, GAK expressão é aumentado significativamente em células HRPC [8]. Além disso, GAK desempenha um papel na manutenção da maturação adequada centrossoma e congression cromossoma mitótica, e knockdown mediada por siARN da GAK activa o ponto de verificação fuso-montagem, que detecta saliente, desalinhada, ou anormalmente cromossomas condensados, que conduz a paragem do ciclo celular na metafase [9]. GAK é essencial para o crescimento celular desde GAK knockout (GAK

– /-) ratos são embrionário letal [10] e de fibroblastos de rato embrionárias (MEF) derivada de GAK

– /- ratos não conseguem dividir e, finalmente, tornar-se senescentes [ ,,,0],11], devido ao rompimento da endocitose mediada por clatrina. No entanto, nós anteriormente mostraram que knockout ratinhos que expressam a forma da cinase-dead de GAK (GAK-kd) foram MEFs letais e KD-GAK não embrionárias cresceram normalmente [12], sugerindo que a perda de actividade de GAK quinase pode não ser letal em células normais que expressa a quantidade adequada de GAK. Esta evidência sugere que um inibidor da actividade de cinase de GAK poderia ser utilizado para desenvolver uma terapia-alvo molecular romance que inibe selectivamente o crescimento de células com expressão HRPC GAK melhorada controlando sinalização AR indirectamente.

Gefitinib [13], um inibidor de tirosina-quinase selectivo para o receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR), também inibe a actividade de quinase da GAK [14]. Embora EGFR [15] e GAK [8] são expressos em níveis elevados no cancro da próstata e sua expressão aumentada está associada com mau prognóstico [8], [15], a administração de sozinho gefitinib é ineficaz [16] e as administrações combinadas de gefitinib e terapia de radiação [17] ou docetaxel [18] têm limitado os efeitos terapêuticos. A luteolina, um flavonóide dietético comum encontrada numa grande variedade de plantas e de alimentos [19], é um outro antagonista de proteína tirosina quinases associados ao EGFR. Semelhante a gefitinib, luteolina provoca a paragem do crescimento de células PC-3 de cancro da próstata humanos através da regulação de genes reguladores do ciclo celular [20]. Luteolina também inibe as topoisomerases de ADN, os objectivos clínicos de fármacos anticancerígenos [21]. Portanto, luteolina pode ser útil como um fármaco anti-cancro, embora a sua

fidedigno

alvo (s) e os mecanismos moleculares envolvidos na inibição da proliferação de células de cancro permanecem ainda desconhecidos devido ao seu amplo espectro de propriedades farmacológicas.

o objetivo deste estudo foi identificar um novo fator que controla AR sinalização indiretamente em pacientes HRPC, e examinar se GAK poderiam ser direcionados para a terapia de não só HRPC, mas também outros tipos de câncer com expressão GAK reforçada. Com efeito, temos aqui relatam que um aumento na expressão de PGE em pacientes HRPC correlaciona-se positivamente com a classificação de Gleason, uma medida da gravidade da doença. Ambos GAK e AR localizada para os núcleos de células cancerosas em espécimes cirúrgicos GAK-positivo. Um

In vitro

ensaio de cinase revelaram que a luteolina e gefitinib inibe a actividade de quinase da GAK, com uma potência semelhante, sugerindo a sua utilidade como inibidores da actividade de cinase da GAK. Em comparação com os efeitos de cada droga por si só, a co-administração de luteolina e gefitinib para células PC-3 tinha um efeito inibidor maior sobre a viabilidade celular. Estes compostos também tiveram um efeito inibitório na expressão da proteína cumulativa GAK que foi independente da degradação mediada por proteassoma. Tomados em conjunto, os resultados aqui apresentados sugerem que GAK, que é sobre-expresso em muitas células cancerosas, é um candidato novo para prometendo a quimioterapia alvejada.

Materiais e Métodos

Os anticorpos e siRNAs

Anticorpos contra as proteínas seguintes foram utilizados neste estudo: AR (Santa Cruz Biotechnology), caspase 3 activa (Cell Signaling Technology), Ki67 (DakoCytomation), canhoto (Abcam), lamina a /C (Bethyl Laboratories), EGFR ( coelho; Cell Signaling Technology), EGFR (rato; Millipore), ERK1 /2 (Cell Signaling Technology), pERK (Cell Signaling Technology), GAPDH (Fitzgerald) e α-tubulina (Sigma-Aldrich). Os anticorpos monoclonais anti-GAK foram preparados como previamente relatado [7]. Os siRNAs específicos-Lefty1 foram adquiridos de OriGene Technologies e Gene Design by

Chemicals e suplementos dietéticos

Os seguintes produtos químicos e suplementos dietéticos foram utilizados neste estudo:. Gefitinib (Tocris Bioscience), erlotinib ( Kemprotec), SB203580 (LC Laboratories), LutiMax (CalComp Nutrição), Oryza luteolina (Oryza Oil Fat Chemical), luteolina (Sigma-Aldrich), o resveratrol (Sigma-Aldrich), e DMSO (Sigma-Aldrich)

cultura celular

células

o PC-3 foram fornecidos pelo Cancer japonesa investigação Recursos Bank. Todas as outras células de cancro humano foram adquiridos a partir da American Type Culture Collection. As células foram mantidas em 5% de CO

2 a 37 ° C em meio de Dulbecco modificado por Eagle suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS, Hyclone Laboratories), 100 U /ml de penicilina, e 100 ug /ml de estreptomicina. WT (GAK-Kd

+ /+) e GAK-KD

– /- MEFs foram mantidas em meio de MEF (meio de Eagle modificado por Dulbecco suplementado com 10% de FBS, penicilina, estreptomicina, e 50 mM de 2-mercaptoetanol) tal como descrito anteriormente [22].

FEG estimulação

Depois de duas lavagens em salina tamponizada com fosfato (PBS), MEFs foram cultivadas em meio de soro baixo MEF (contendo 0,5% de FBS) para 12 h. Rato de EGF (Sigma) foi adicionada ao meio de cultura a uma concentração final de 10 ng /ml (por análise de Western blot) ou 100 ng /ml (por imunofluorescência), e as células foram então incubadas em 5% de CO

2 a 37 ° C durante os tempos indicados.

análise FACS

as células foram coradas utilizando o estojo de reagentes Cycletest Além disso ADN (BD Bioscience), de acordo com as instruções do fabricante. A análise foi realizada utilizando um instrumento FACS Calibur com software CellQuest (BD Bioscience).

Curva de crescimento análise

Cerca de 1,0 × 10

3 PC-3 células foram semeadas em uma Petri 3,5 centímetros prato e incubou-se a 37 ° C durante a noite. Gefitinib, luteolina, e o resveratrol foram então dissolvidos em DMSO e adicionado ao meio de cultura no tempo zero.

Medição

A viabilidade celular utilizando o miR-630

Expressão de miR-630 a partir da miRNASelect PEPFAR HSA-miR-630 vector de expressão foi realizada de acordo com instruções do fabricante (celular Biolabs). Para determinar a viabilidade, as células foram plaqueadas em placas de 6 poços a uma densidade de 1 x 10

5 células por poço e então tripsinizadas aos indicados pontos temporais. O número de células em proliferação foi determinada utilizando um contador de células automatizado Condessa (Invitrogen).

A análise histológica

espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos a prostatectomia radical foram fixados em formalina tamponada a 10%, embebidos em parafina, e, em seguida, cortada em 4 mm cortes seriados de espessura. Os primeiros cortes foram corados com hematoxilina e eosina e utilizado para o diagnóstico patológico da região inflamada. As três secções restantes foram submetidos a análises de imuno-histoquímica, tal como descrito anteriormente [23]. Resumidamente, secções desparafinadas foram autoclavadas em tampão de citrato 0,1 M, bloquearam-se com albumina de soro de bovino, e, em seguida, incubadas com anticorpos primários em PBS contendo 2% de albumina de soro bovino. As incubações e reacções anticorpo secundário aumento do sinal foram realizadas utilizando o kit de mancha simples Histofine (Nichirei) e a cor foi desenvolvida utilizando aminoethlcarbazole (AEC Impacto; Vector Laboratories). As secções foram contrastadas com hematoxilina para visualização nuclear e, em seguida, montado usando Ultramount Aqueous Montagem Permanente Médio (Dako). As imagens foram gravadas usando um microscópio (BX51; Olympus) equipado com uma câmera CCD (DP72; Olympus).

Western blot análise

Para preparar lisados ​​de células inteiras, as células foram lisadas a 4 ° C durante 30 min em tampão RIPA modificado (Tris 10 mM-HCl a pH 7,5, NaCl 150 mM, EDTA 1 mM, 1% de NP-40, 1 mM de ditiotreitol, 0,1% de SDS, e% de desoxicolato a 0,1) suplementado com inibidores de protease 1% cocktail (Sigma-Aldrich), NaF 1 mM, 1 mM de Na

3VO

4, e 10 mM de β-glicerofosfato. Após centrifugação, os lisados ​​límpidos foram submetidos a SDS-PAGE. As proteínas resolvidas foram transferidas para membranas de PVDF, que foram bloqueados e, em seguida, coradas imunologicamente com os anticorpos indicados em solução salina tamponada com Tris contendo Tween 20 e 5% de leite desnatado. As bandas proteicas imunorreactivas foram visualizadas utilizando reagentes Ocidental relâmpago Além disso ECL (PerkinElmer).

A purificação de proteínas recombinantes

Purificação de proteínas GST-tag para ensaios de cinase foi realizado como descrito anteriormente [22]. Resumidamente,

E. coli

células BL21 transformada com o plasmídeo pGEX foram incubadas em meio de Luria-Bertani a 37 ° C até atingirem uma absorvância de 0,4-0,8 a 600 nm. A expressão de cada proteína recombinante foi induzida por exposição durante a noite das células para IPTG 0,5 mM a 20 ° C. As células foram então recolhidas e lisadas por sonicação em PBS contendo 1% de Triton X-100, 1 ug /mL de leupeptina, 1 ug /mL de aprotinina, 1 ug /mL de pepstatina A, benzamidina 1 mM, 100 ug /mL de fluoreto de fenilmetilsulfonilo, 1 NaF mM e 1 mM Na

3VO

4. Após centrifugação, o lisado clarificado foi adsorvido à glutationa Sepharose 4B (Amersham Pharmacia Biotech), lavadas com PBS, e depois eluída com um tampão contendo 10 mM de glutationa reduzida (Nacalai Tesque).

In vitro

ensaio de cinase de GAK

In vitro

ensaios de cinase foram realizados utilizando marcado com GST AR humana (~ 150 ug /ml) como a amostra de teste e purificada GAK humana GST-marcado (~ 100 ug /ml) como a quinase de teste. Um fragmento purificado do subtipo B’γ3 de rato PP2A (B’γ; ~ 10 ug /ml) foi utilizado como um substrato de controlo positivo GAK, como descrito anteriormente [22]. Aurora A cinase (-50 ug /ml) e 2 Lats1 quinase /(~ 25 ug /ml; na presença ou ausência de Mob1A (~ 50 ug /ml) como seu activador) foram utilizadas como enzimas de controlo positivo, e uma cinase -Dead (KD) forma de Aurora cinase (-50 ug /ml) foi usado como um controlo negativo para a fosforilação da AR. As cinases e proteínas de substrato foram incubadas durante 30 min a 30 ° C em 10 de tampão de reacção ul (10 mM de HEPES pH 7,5, 50 mM de NaCl, 10 mM de MgCl

, MnCl2 5 mM de

2, 1 mM de DTT, NaF 5 mM, e mM β-glicerofosfato) 50 contendo ATP 5 mM e 10 uCi [γ-

32 P] ATP (PerkinElmer). Caso seja necessário, gefitinib, erlotinib, SB203580, resveratrol, e luteolina foram incluídos nas concentrações indicadas. A reacção foi parada pela adição de 4 × tampão de Laemmli (0,4 M de Tris-Cl pH 6,8, 8% SDS, 20% glicerol, 10% de 2-mercaptoetanol e 0,2% de azul de bromofenol). As amostras foram resolvidas por SDS-PAGE de gradiente utilizando um aparelho Mini Multigel II (Daiichi Pure Chemicals) e foram detectados por autorradiografia. As quantidades de proteínas carregadas no gel foram monitorizadas por coloração com Azul Brilhante de Coomassie (Bio-Rad) ou SimplyBlue SafeStain ™ (Life Technologies).

microarray genoma humano análise

analisa

Microarray foram realizadas como hibridações de uma só cor usando Agilent Whole Human Genome oligonucleotide microarrays (4 × 44K; código do produto: 4112F). O ARN total foi extraído a partir de células PC-3 24 h após o tratamento com DMSO, 60 uM luteolina, 60 uM gefitinib, ou 60 ^ M mais 60 uM luteolina gefitinib usando um kit Mini-miRNeasy de acordo com as instruções do fabricante (Qiagen). A qualidade do ARN foi determinada utilizando o kit RNA 6000 Nano LabChip da Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies). O ARN foi transcrito reverso usando a transcriptase reversa AffinityScript (Agilent Technologies) e iniciadores oligo-dT, contendo a sequência do promotor de T7 ARN polimerase.

In vitro

transcrição foi então realizada utilizando a polimerase de ARN de T7 e uma entrada de baixa Quick-Amp Labeling Kit (Agilent Technologies) para rotular os ARNc com Cy3-CTP (Amersham Pharmacia Biotech, Piscataway, NJ). Purificadas ARNc marcadas com Cy3 (1,650 ng) foram hibridados com as micromatrizes. Lavar roupa, digitalização e análise de genes foram realizados de acordo com o protocolo do fabricante (Agilent Technologies). software Feature Extraction Agilent (v. 10.5.1) foi utilizado para avaliar a qualidade do local e extrair estatísticas de intensidade de recursos. A Plataforma Subio e Subio Básico Plug-in (v1.15; Subio Inc.) foram então usados ​​para calcular entre amostras de dobra-mudanças, que foram analisadas por do

t

-Testes estudante de uma amostragem. Os dados de microarranjos foram depositadas no banco de dados Gene Expression Omnibus (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo) sob o número de acesso GSE53180.

análise de microarray miRNA Humano

A análise microarray miRNA foi realizada usando Agilent SurePrint v18.0 Humano matrizes miRNA, que contêm 20-40 apresenta segmentação 1919 miRNAs humanos catalogados na versão 8.0 do banco de dados Sanger (design ID 025.416). Alíquotas de RNA total (100 ng) foram usadas para preparar sondas de miARN, de acordo com o protocolo da Agilent (v. 2.4). Resumidamente, o ARN total foi desfosforilado com fosfatase alcalina de intestino de vitela, desnaturado com DMSO, e depois marcado com Cianina 3-PCP utilizando ligase de RNA de T4 e o miARN Labeling Kit. As sondas foram hibridadas com as matrizes durante 20 h a 55 ° C com rotação usando o Agilent miARN hibridação Kit. microarrays duplicadas foram realizadas para PC-3 células tratadas com DMSO, luteolina, gefitinib ou luteolina e gefitinib. As lâminas foram lavadas com Tampão de Lavagem Gene Expression 1 (Agilent) à temperatura ambiente durante 5 min e, em seguida, com Gene Expression tampão de lavagem 2 (Agilent) a 37 ° C durante mais 5 min. Após a hibridação e lavagem, as lâminas foram digitalizadas utilizando um scanner Agilent (G2505C). As imagens foram extraídas usando software Agilent Feature Extraction (v. 10.7.3) e software Agilent GeneSpring GX (v. 12.6). Utilizou-se o sinal do gene total dos arquivos de dados GeneView (extraído com configurações padrão no software Agilent Feature Extraction). As diferenças nos níveis de expressão de miARN foram normalizados utilizando a amostra tratada com DMSO PC-3 como um controlo. aFold-mudanças superiores a 2,0 e

P

-Valores inferior a 0,05 (de Student

t

-teste) foram considerados para análise posterior. Os dados de microarray de miARN foram depositadas na base de dados Gene Expression Omnibus sob o número de acesso GSE53178.

Quantitative real-time PCR

analisa

quantitativa de RT-PCR foram realizadas utilizando um instrumento ABI Prism 7900 (PE Applied Biosystems) e sondas TaqMan Assay-on-Demand para Lefty1 (Hs00764128_s1), miR-630 (HSA-mir-630), e miR-5703 (HSA-mir-5703), de acordo com os protocolos do fabricante (Agilent Technologies).

a análise estatística

as barras de erro para todos os dados representam SDs da média.

P

-Valores foram calculados utilizando Student

t

-Testes, salvo indicação contrária.

Ética

As amostras humanas foram colhidas por biópsia da próstata de pacientes com câncer com dados clínicos relevantes no Hospital Universitário Kinki. Todos os experimentos utilizando amostras humanas foram aprovados pelo comitê de ética da Universidade de Osaka (Aprovação # 326) e da Universidade de Kinki (Aprovação # 23-088); nosso comitê de ética dispensou a necessidade de consentimento. espécimes cirúrgicos de pacientes submetidos à prostatectomia radical no Hospital da Universidade Kinki (Osaka, Japão) foram fixados em formalina a 10% tamponada, embebidos em parafina, e, em seguida, cortada em 4 mm cortes seriados de espessura.

Resultados

GAK localiza-se principalmente para o núcleo em células cancerosas

Embora GAK localiza principalmente para o citoplasma em células normais, tais como TIG-1, demonstramos recentemente que uma fracção da proteína é também encontrada no núcleo [7 ]. Notavelmente, um estudo anterior utilizando uma terapia hormonal tissue microarray neo-adjuvante demonstraram que a expressão de GAK aumenta significativamente durante a progressão do cancro da próstata a independência de androgénio [8]. Para determinar se a expressão de GAK é aumentada nos núcleos de células cancerosas, imunoblots foram usadas para medir os níveis de proteína em fracções GAK citoplasmáticos e nucleares de várias linhas celulares de cancro. Em células humanas de cancro da próstata insensível a hormonas (PC-3), GAK foi expresso a um nível mais elevado no núcleo do que no citoplasma; este resultado foi confirmado usando dois anticorpos monoclonais diferentes (pistas 3 e 4 na Fig. 1). Embora a quantidade de PGE foi baixa, os núcleos de células humanas de cancro da próstata sensível a hormonas (LNCaP) também expressa GAK (pista 6 na Fig. 1). Além disso, a banda de GAK nuclear migraram mais rápido do que a banda de GAK citoplasmática, sugerindo modificações distintas da proteína nestes compartimentos celulares. Foram também observados resultados semelhantes para as células do cancro do colo do útero HeLaS3 células MCF-7 de cancro da mama MDA-MB231 e, bem como (Fig. 1). Em contraste, GAK estava presente a níveis mais elevados na fracção citoplasmática do que a fracção nuclear da TIG-1 fibroblastos normais (Fig. 1). Notavelmente, células cancerosas da hormona de minúsculas (PC-3 e MDA-MB231) GAK expresso em níveis mais elevados do que as células cancerosas sensíveis a hormona (LNCaP e MCF-7). Tomados em conjunto, estes resultados indicam que a PGE é modificado e expresso em células de cancro, especialmente as células metastáticas.

análise de Western blot de GAK, lamina A /C, e α-tubulina (controlo) em citoplásmico (Cit) e nuclear (Nuc) extrai do cancro da próstata (PC-3 e LNCaP), cancro da mama (MDA-MB231 e MCF-7) e linhas celulares de cancro do colo do útero (HeLaS3). Lamina A /C foi usada como um marcador nuclear. Utilizaram-se dois anticorpos anti-GAK diferentes. As setas e setas indicam as bandas GAK identificados principalmente nas frações nucleares e citoplasmáticos, respectivamente.

GAK Nuclear é expresso em níveis elevados em espécimes cirúrgicos de pacientes com câncer de próstata

Para determinar se a sobre-expressão nuclear de GAK ocorre

in vivo

, imuno-histoquímica de espécimes cirúrgicos normais e cancerosas de pacientes com câncer de próstata 42 foram realizadas. Embora GAK só foi expressa fracamente em tecidos normais, a proteína foi expressa em níveis elevados nos núcleos de células cancerosas (Fig. 2A-E). Um teste do qui-quadrado revelou uma correlação positiva estatisticamente significativa entre GAK imunocoloração e a pontuação de Gleason (Tabela 1 e Tabela S1).

A-D, hematoxilina e eosina (HE) (A, B) e anti imunocoloração -GAK (C, D) de secções representativas da prostatectomia radical canceroso (A, C) e normal (B, D) de tecidos de pacientes com cancro da próstata (n = 42). Barra de escala = 50 mm. E, maior ampliação poder da área de box mostrado na barra de C. Escala = 50 mm.

Over-ativação da sinalização AR está associada com a progressão da próstata-cânceres dependentes de androgénio. Porque GAK interage com o AR

in vitro

[8], a imunocoloração foi usado para determinar se GAK também colocaliza com a AR

in vivo

. A localização nuclear de GAK e a AR foi detectado nos núcleos das células de cancro a partir de todos os espécimes cirúrgicos GAK-positivo (n = 4 pacientes com uma classificação de Gleason ≤7 e n = 5 pacientes com uma pontuação de Gleason ≥8) (Fig. S1) . No entanto, apesar da sua localização nuclear, fosforilação direta da AR por GAK não foi detectado por um

in vitro

ensaio da quinase (Fig. S1E). Além disso, em três amostras independentes de pacientes, GAK e o AR não colocalize com Ki-67, um antigénio do cancro que é encontrado principalmente em células em crescimento e está ausente em células (Fig. S2) que descansa. Esta descoberta sugere que co-localização de GAK ea AR não se correlacionam necessariamente com o crescimento das células cancerosas.

citoplasmática GAK regula vias de sinalização mediada por EGFR

Down-regulação da GAK reduz a tirosina quinase actividade do EGFR e altera as suas vias de sinalização a jusante [5]. Para determinar se esta regulação é mediada pela actividade de quinase Ser /Thr da GAK, investigámos o comportamento do EGFR em MEFs KD-PGE [12]. Uma análise de imunotransferência de tipo selvagem (WT) e MEFs GAK-Kd revelou a presença de duas proteínas de EGFR em ambas as amostras, de que quanto maior era predominante em MEFs GAK-kD (Fig. 3A). A banda maior desapareceram após o tratamento das células com λ-fosfatase (Fig. 3B, pista 2), sugerindo que representavam uma forma fosforilada do EGFR. O inibidor Tyr-fosfatase de Na

3VO

4, mas não a inibidores de fosfatase Ser /Thr NaF, β-glicerofosfato, e o ácido ocadaico, aboliu este efeito de λ-fosfatase, o que sugere que os resíduos de Tyr no EGFR são constitutivamente fosforilada em MEFs kD-PGE, na ausência de estímulo de EGF (Fig. 3B). Do mesmo modo, quando as MEFs foram privadas de soro durante 11 h, tratada com ciclo-heximida durante 1 h para inibir a síntese de proteína de novo, e, em seguida, estimulada pela adição de EGF, a fosforilação do EGFR foi mais proeminente em MEFs KD-PGE que WT MEFs (Fig . 3C e 3D). Notavelmente, uma proteína de EGFR ainda maior foi detectado em ambos WT e GAK-kd MEFs 10 min após a estimulação EGF (Fig. 3C e 3D), sugerindo que o EGF aumentou o número de resíduos de Tyr fosforilados na de EGFR. Esta hiper-fosforilação acelerou a desfosforilação de cinases fosforiladas extracelulares reguladas por sinais 1/2 (pErk1 /2) (Fig. 3C), os quais são efectores a jusante de EGFR, o que sugere diminuição prematura de sinalização de EGFR.

A , análise de western blot da expressão do EGFR no WT (PGE-kd

+ /+) e mutante (GAK-kd

– /-) MEFs. B, os efeitos de um inibidor de Tyr-fosfatase (Na 50 mM

3VO

4) e inibidores de fosfatase Ser /Thr (NaF 50 mM e β-glicerofosfato 50, ou 2,5 uM de ácido ocadaico) sobre a inibição da fosforilação do EGFR por λ-fosfatase (λPPase; 200 L). A, B, as setas indicam a proteína EGFR fosforilado. Alfa-tubulina (α-banheira) foi utilizado como um controlo de carga. (C, D) análise de transferência de Western dos níveis de expressão do EGFR e ERK1 /2 em WT (+ /+) e GAK-kd (- /-) no seguimento da estimulação EGF MEFs durante os tempos indicados. Ciclo-heximida (50 ug /ml) foi adicionada ao meio de cultura 1 h antes de EGF (10 ng /ml) para inibir a síntese de proteína nova. As setas inclinadas e horizontais indicam as bandas de EGFR fosforilados e hiper-fosforiladas, respectivamente. GAPDH foi usada como um controlo de carga. C, as setas indicam expressão diferencial de ERK1 /2 em WT e MEFs KD-GAK. D, NT, não-tratada. E, a imunocoloração da proteína EGFR no WT (+ /+) e mutantes MEFs tratados com ou sem o inibidor de proteassoma MG132 (50 ug /ml) (- – /). painéis notáveis ​​são cercados por turquesa e linhas verdes. F, os números de células EGFR-positivo em células WT e GAK-kd (homo) na presença ou ausência de MG132. Os dados estão representados como a média ± SEM de n = 3 experiências independentes em cada ponto de tempo.

A imunocoloração demonstrou que os níveis de EGFR no citoplasma de MEFs GAK-kd foram menores do que aqueles na citoplasma de WT MEFs, sugerindo internalização anormal do EGFR nas células knockout (coluna 2 os painéis da Fig. 3E). Resultados semelhantes foram obtidos quando a experiência foi repetida na presença do inibidor de proteassoma MG132, o que sugere que a anormalidade não foi devido à degradação de proteínas de EGFR (coluna 4 painéis da Fig. 3E). Além disso, o número de células EGFR-positivo foi mais baixa em MEFs GAK-kd do que MEFs WT, e esse fenótipo também era independente da inibição de proteassoma (Fig. 3F). Estes resultados sugerem que constitutiva hiper-fosforilação do EGFR causada por uma falta de actividade de GAK dificulta a localização correcta do receptor, conduzindo à activação reduzida do crescimento de sinalização mediada pelo EGFR. Os resultados descritos acima são consistentes com um relatório recente que MEFs GAK de ratinhos knockout condicional e células GAK knockdown preparadas utilizando pequenas hairpin RNAs exibir alterada tráfico intracelular do EGFR, sofrem uma paragem do crescimento, e reduziram pErk1 2 sinalização /[11]. Tomados em conjunto, estes dados sugerem que a falta de actividade de activação adequada GAK perturba de vias de sinalização mediada pelo EGFR.

luteolina e gefitinib inibe a actividade de quinase da GAK

gefitinib inibe a GAK, o EGFR, e-interagindo receptor de serina /treonina-quinase

in vitro

[14]. Para determinar se a gefitinib inibe a actividade da GAK directamente, um

In vitro

ensaio de quinase foi realizado utilizando PP2A B’γ, um alvo conhecido da GAK, como substrato [22]. Gefitinib GAK inibiu a autofosforilação e a fosforilação de GAK-mediada de PP2A B’γ de uma forma dependente da dose, sugerindo que o gefitinib inibe a actividade de cinase de GAK directamente (Fig. 4A). Os efeitos de outros inibidores da quinase, tais como o erlotinib bem conhecido inibidor de EGFR [24] e o inibidor de SB203580 p38a e GAK [25], sobre a actividade de GAK foram também examinados. Ambos os compostos inibiram a actividade GAK semelhante, apesar de serem ligeiramente menos potentes do que a gefitinib (Fig. 4A).

In vitro

ensaios de quinase foram também utilizados para determinar os efeitos da luteolina (um flavonóide) e resveratrol (um polifenol) sobre a actividade de GAK; estes compostos inibem o crescimento de linhas celulares de cancro da próstata [20], [26]. Notavelmente, 10 uM inibiu a actividade de luteolina GAK drasticamente, enquanto que a mesma concentração de resveratrol teve apenas um ligeiro efeito inibidor (Fig. 4B). Uma análise mais aprofundada revelou que 2 uM de luteolina foi necessária para inibir a actividade de GAK (Fig. 4C). Estes resultados indicam que, em adição a gefitinib, erlotinib e luteolina são novos inibidores da GAK.

A-C, a análise por SDS-PAGE representativa de proteínas submetidas a

In vitro

ensaios de cinase utilizando

32P-γATP, GAK (-100 ug /ml) como a enzima, a PP2A B’γ (~ 10 ug /ml) como o substrato, e as concentrações indicadas de gefitinib, erlotinib, e como inibidores de SB203580. Os sinais incorporados foram detectados por auto-radiografia e os montantes de proteínas carregadas foram avaliados por coloração com azul brilhante de Coomassie (CBB). Os gráficos mostram as razões de intensidade dos fosforilada PP2A B’γ e GAK em relação à de amostras não tratadas. Os dados são representados como a média ± SEM de n = 3 experiências independentes para cada concentração.

A co-administração de gefitinib e luteolina causa a morte de células PC-3

Em seguida, examinámos o efeito da co-administração de gefitinib e luteolina sobre o crescimento de células PC-3 de cancro da próstata. Em primeiro lugar temos usado sequenciação do ADN genómico para examinar a presença de mutações no gene de EGFR em células PC-3 que foram anteriormente relatados para ser abrigado frequentemente por células de cancro do pulmão [27]. Como mostrado na Fig. S3, não foram encontradas mutações em tais locais no genoma de PC-3, o que sugere que uma baixa concentração de gefitinib (~ 1 | iM) pode não ser eficaz em células PC-3. Com efeito, uma concentração mais elevada de gefitinib (60 uM) foi obrigado a parar o crescimento de células PC-3. Curiosamente, quando o número de células em proliferação foram contadas após a exposição das células a 60 uM luteolina, 60 uM gefitinib, ou uma combinação destas drogas, durante 24, 48, ou 72 horas, verificou-se um efeito inibitório cumulativa de gefitinib e luteolina sobre o crescimento celular (Fig. 5A). As células de controlo foram tratadas com dimetilsulfóxido (DMSO) sozinho.