Abstract

O câncer colorretal (CRC) é uma das principais causas de Câncer morte relacionada e biomarcadores prognósticos baseados no sangue confiáveis ​​são urgentemente necessários. A enumeração e caracterização molecular de células tumorais circulantes (CTC) tem vindo a ganhar cada vez mais interesse na prática clínica. detecção de CTC por CellSearch

® já foi correlacionada com um resultado desfavorável em câncer colorretal metastático. No entanto, a taxa de detecção CTC na doença CCRm é baixo quando comparado com outras entidades tumorais. Assim, a utilização de ensaios alternativos (ou complementares) pode ajudar a discriminar a utilização de prognóstico CTC como biomarcadores à base de sangue. Neste estudo, amostras de sangue de 47 pacientes com CCRm foram selecionados para CTCs usando o CellSearch aprovado pela FDA

® tecnologia e /ou o AdnaTest

®. 38 amostras podem ser processadas em paralelo. Nós demonstramos que uma análise combinada de CellSearch

® eo AdnaTest

® leva a uma melhor detecção de CTCs em nossa coorte mCRC (taxa de positividade CellSearch

® 33%, AdnaTest

® 30%, combinado 50%). Enquanto CTCs detectados com o CellSearch

® sistema foram significativamente associados com a sobrevivência livre de progressão (p = 0,046), uma correlação significativa em relação à sobrevida global poderia ser visto apenas quando ambos os ensaios foram combinadas (p = 0,013). Estas descobertas podem ajudar a estabelecer melhores ferramentas para detectar CTCs como no tratamento de biomarcadores para a rotina clínica em estudos futuros

Citation:. Gorges TM, Stein A, Quidde J, Hauch S, Rocha K, Riethdorf S, et ai. (2016) melhor detecção de células circulantes do tumor em câncer colorretal metastático pela combinação do CellSearch

® Sistema eo AdnaTest

®. PLoS ONE 11 (5): e0155126. doi: 10.1371 /journal.pone.0155126

editor: Min-Hsien Wu, Chang Gung University, TAIWAN

Recebido: 03 de novembro de 2015; Aceito: 25 de abril de 2016; Publicado em: 16 de maio de 2016

Direitos de autor: © 2016 Gorges et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Data Availability:. Todos relevante os dados estão dentro do papel

Financiamento: TMG, SR, e KP foram apoiados pela cidade de Hamburgo, Landesexzellenzinitiative Hamburgo (LEXI 2012; Tumor de segmentação através de moléculas de superfície celular essenciais na progressão do cancro e difusão).. Estes autores também foram apoiados pela ERC Avançada Investigator Grant dissecar, TRANSCAN ERA-rede: Grant CTC-SCAN. TMG e KP também foram apoiados a partir da Empresa Comum Iniciativa sobre Medicamentos Inovadores no âmbito do acordo de subvenção n ° 115749, recursos dos quais são compostos de contribuição financeira do Sétimo Programa UADRO da União Europeia empresas EFPIA (FP7 /2007-2013) e “contribuição em espécie. Os financiadores forneceu apoio sob a forma de salários para o autor TMG, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. Os papéis específicos destes autores são articuladas na seção “autor contribuições ‘. SH é um funcionário em tempo integral da AdnaGen GmbH, Langenhagen, Alemanha. O AdnaGen GmbH forneceu apoio sob a forma de salário para SH autor, mas não tinha nenhum papel adicional no desenho do estudo, recolha e análise de dados, decisão de publicar ou preparação do manuscrito. O papel específico deste autor é articulada na seção “autor contribuições ‘

CONFLITO DE INTERESSES: SH é do Director Executivo do Research . Desenvolvimento do AdnaGen GmbH (Qiagen). Todos os outros autores declararam que não existem interesses conflitantes. Isto não altera a adesão dos autores para PLOS ONE políticas em dados e materiais de compartilhamento.

Introdução

morte é geralmente causada por o crescimento de células cancerígenas agressivas em novos locais na relacionada ao câncer corpo (formação de metástases) que foram divulgados a partir dos tumores primários. O câncer colorretal (CRC) é uma das neoplasias mais comumente diagnosticado e uma das principais causas de mortes relacionadas ao câncer [1]. Cerca de um quarto dos pacientes com metástases CRC apresentar (CCRm) no momento do diagnóstico (doença síncrona) e mais pacientes desenvolvem metástases durante o decurso da sua doença, que resulta na taxa relativamente alta mortalidade associada com CRC [2].

diferentes marcadores de prognóstico pode ser actualmente utilizado em CCRm, por exemplo, análises de células brancas do sangue, a quantidade de desidrogenase de lactato, estatuto de desempenho, a localização do tumor primário e as metástases, marcadores moleculares (por exemplo, mutações no gene BRAF), ou avançados agrupamento integrativa) [3-7]. Além disso, a dinâmica de crescimento do tumor foram mostrados para oferecer informações sobre o tratamento sobre o prognóstico futuro [8, 9].

enumeração e caracterização molecular das células tumorais capturadas a partir de um exame de sangue minimamente invasivo (células tumorais circulantes, CTCs) é cada vez mais utilizado na prática clínica para o monitoramento da doença e descobrir relevância prognóstica [10]. CTC são fáceis de obter através de amostragem de sangue periférico menos invasivo e que permite uma progressão do tumor de “monitorização em tempo real” contínua. Até agora, o CellSearch

® sistema é a única abordagem que tem sido apuradas pelo FDA americano EUA (Food and Drug Administration) para a detecção de CTC na mama metastático, cólon e cancro da próstata [11-13]. Detecção de CTCs usando CellSearch

® foi recentemente correlacionado com um resultado desfavorável em CCRm [14]. No entanto, estudos realizados em pacientes com CCRm usando CellSearch

® demonstrou um rendimento muito inferior de CTCs neste tipo de tumor em comparação com o de mama ou câncer de próstata [11-13]. Espera-se que “únicas” de 30-40% dos pacientes com CCRm Harbor 3 ou mais CTC por 7,5 ml de sangue [15]. Portanto, o uso de outros (ou complementares) ensaios pode melhorar a nossa compreensão dos mecanismos da biologia do câncer e relacione o uso de CTCs como biomarcadores de câncer em mCRC. Por exemplo, discordância significativa entre CellSearch

® eo AdnaTest

® na detecção de CTCs de pacientes com CCRm já foi observado [16]. O sistema CellSearch

® utiliza imunocoloração e define CTC como células que expressam tanto EpCAM e pankeratins e não expressam CD45, bem como ter um núcleo coradas com DAPI (4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole). Em contraste, o AdnaTest

® utiliza uma plataforma de RT-PCR para três transcrições diferentes (

EpCAM

,

EGFR

,

CEA

) para identificar as células tumorais dentro a fracção de células enriquecida-EpCAM.

a análise combinada de ambos os ensaios pode, por conseguinte, melhorar a sensibilidade da detecção CTC pela aplicação de duas abordagens metodológicas (imunocitoquímica e RT-PCR) e aumentar a gama de marcadores CTC. Esta é uma vantagem importante, tendo em conta a heterogeneidade fenotipica bem conhecido dos CTC [10]. O objetivo deste estudo foi analisar a relevância clínica de CTCs, comparando e combinando dois ensaios diferentes para a detecção de CTC em um pequeno grupo de pacientes com CCRm (n = 47). Para este objectivo, o AdnaTest

® eo CellSearch

® sistema foram empregados em paralelo. Nossos dados mostram que uma análise combinada de ambos os ensaios leva ao aumento das taxas de detecção de CTCs com informação prognóstica adicional. Estas descobertas podem ajudar a estabelecer novas ferramentas de diagnóstico para usar de CTCs como no tratamento de biomarcadores para a rotina clínica em estudos futuros.

Material e Métodos

série de pacientes

pacientes consecutivos agendada para quimioterapia paliativa para CRC do ambulatório do Departamento de Oncologia e Hematologia do Centro Médico da Universidade de Hamburgo-Eppendorf foram recrutados. As características dos pacientes estão resumidas na Tabela 1. A maioria dos pacientes já foram extensivamente pré-tratados, que recebe o tratamento linha 3

rd (mediana) (gama: 1-8). Em geral, mais de 80% dos doentes receberam fluoropirimidinas, oxaliplatina, irinotecano e bevacizumab e cerca de 40% dos pacientes anticorpos de EGFR. Os dados demográficos e padrões de metástases eram esperados, embora a população total era um pouco mais jovem do que a população CRC metastático mediana, provavelmente relacionado com o fundo hospital universitário. O estudo foi realizado em conformidade com a Declaração da Associação Médica Mundial de Helsinki e as diretrizes para a experimentação com seres humanos pelas câmaras de Médicos do Estado de Hamburgo ( “Hamburger Ärztekammer”). foi aprovado o protocolo experimental (Aprovação No. PVN-3779) pelo Comité das Câmaras de Médicos do Estado de Hamburgo ( “Hamburger Ärztekammer”) Ética. Todos os participantes assinaram consentimento informado antes do início do estudo. No total, amostras de sangue (5 ml e 7,5 ml) de 47 pacientes foram coletadas em AdnaCollect

® tubos de coleta de sangue (AdnaGen

®) ou CellSave

® tubos de preservação (Janssen Diagnostics), e processado dentro de 24 h (AdnaTest

®) ou 96 h (CellSearch

®) de acordo com as orientações dos fornecedores.

AdnaTest

®

para o enriquecimento e análise de células tumorais circulantes (CTC) do AdnaTest ColonCancerSelect e o AdnaTest ColonCancerDetect, (AdnaGen GmbH, Langenhagen) foram usados ​​para preparar ARNm, seguido por uma RT-PCR para um multiplex PCR mais tarde de acordo com as instruções do fabricante [16]. Todas as informações necessárias sobre o processamento da amostra pode ser encontrada na página https://www.adnagen.com. Resumidamente, 5 ml de sangue foi tomada para um enriquecimento de CTC, utilizando partículas magnéticas revestidas de anti-corpo que consistem de uma mistura de anticorpos contra o EpCAM epítopos diferentes As células enriquecidas foram subsequentemente lisadas e o ARNm foi purificado por meio de contas de oligo-dT contidos no kit de transcrição reversa seguido por (Sensiscript, Qiagen, Hilden). O cDNA resultante foi processada em um PCR multiplex para transcritos associados ao tumor (

do receptor do factor de crescimento epidérmico

(

EGFR

),

antígeno carcinoembrionário

(

CEA

) e

EpCAM

), bem como

actina

como controle de limpeza. A PCR foi realizada utilizando o HotStarTaq Master Mix (QIAGEN GmbH, Hilden, Alemanha). A visualização dos fragmentos de PCR foi realizada com um Bioanalyzer 2100 utilizando o ensaio de DNA1000 (Agilent Technologies, Waldbronn, Alemanha). CTC foram positivamente identificados, se foi detectado, pelo menos, um dos marcadores de PCR multiplex.

CellSearch

®

Para o isolamento dos CTC utilizando CellSearch

®, detecção CTC foi realizada como descrito em outro lugar [17]. Os critérios para um evento para ser definido como CTC foram: um ciclo a morfologia oval, um núcleo visível (DAPI-positivo), e um padrão de coloração positivo para uma célula epitelial específica (queratina-positivas e CD45-negativo). Para a determinação de EGFR em CTCs, o CellSearch

® Tumor fenotipagem Reagente EGFR foi aplicado no quarto canal do sistema [18].

A análise estatística

A fim de comparar os resultados de o

sistema CellSearch ® e os AdnaTest

® experimentos, CTC conta de CellSearch

® dados foram transformados para positivo (≥3 CTCs) ou negativo ( 3 CTCs) desde ≥3 CTCs /7,5 ml de sangue têm sido associados ao prognóstico clínico [13]. estado CTC (positivo /negativo) e correlação com a localização de metástases foi testada com o teste exacto de Fisher 2×2 [19] e corrigido para ensaios múltiplos. O teste de McNemar com correção de Yate para a continuidade foi realizada para encontrar a concordância entre os dois métodos. De progressão livre e sobrevida global (PFS e OS) estima para ambos os métodos foram calculados pelas curvas de Kaplan-Meier e comparadas pelo teste log-rank [20].

Resultados

análise da amostra clínica usando o AdnaTest

® e CellSearch

®

Usando o AdnaTest

®, 13 dos 43 (30%) pacientes analisados ​​foram positivos para CTCs. CTC foram positivamente identificados, se foi detectado, pelo menos, um dos marcadores de PCR multiplex. CTCs de 8 pacientes apresentaram sinais positivos para

EpCAM

. Quatro desses pacientes apresentaram adicionalmente sinais para

CEA

, ao passo que um paciente foi positivo para

EpCAM

,

CEA

, e

EGFR

. Cinco pacientes apresentaram exclusivamente sinaliza para

CEA

sem sinais de expressão de qualquer outro marcador (Fig 1A). Para CellSearch

® analisa, apenas os pacientes com ≥3 CTCs foram classificados como “CTC-positivo” porque este corte foi correlacionada com um resultado desfavorável em CCRm [13, 21]. Catorze dos 42 (33%) analisaram amostras foram positivas para CTCs (intervalo: 3-44 células). células EGFR-positivo (moderada a forte expressão) foram encontrados em seis dos 14 pacientes (intervalo de 1-4 células EGFR-positivo dentro da coorte CTC-positivo) (Fig 1B). Neste estudo, 38 amostras de sangue clínicas poderiam ser analisados ​​em paralelo. Combinando o AdnaTest

® e CellSearch

® 19 dos 38 (50%) analisaram amostras tornou-se positivo para CTCs (Fig 1C). Dentro deste grupo,

sinais de EGFR

/EGFR não se relacionou pois somente um paciente foi

EGFR

-positivo com o AdnaTest

®, mas teve CTCs EGFR-negativos com CellSearch

® (doente 42). Um resumo detalhado do CTC análises encontram-se listados na Tabela 2. As amostras foram Quinze CTC-negativos em ambos os ensaios do CTC e 5 pacientes foram CTC-positivo em ambos os ensaios. Sete amostras foram positivas em CellSearch

® e negativo para o AdnaTest

®, enquanto que sete casos eram exclusivamente positivo para AdnaTest

®. Os resultados de ambos os ensaios não se correlacionou significativamente (kappa de Cohen = 0,1066, p = 0,51) (Fig 1D).

(A) marcador Resumido análises de CTCs detectados com o AdnaTest

®. CTCs foram positivamente identificados, se pelo menos um dos marcadores PCR multiplex (

EpCAM

,

CEA

, ou

EGFR

) foi detectado. (B) CTC enumeração por CellSearch

® incluindo a determinação EGFR. (C) CTC taxa de positividade do AdnaTest

®, CellSearch

®, ou ambos ensaio em combinação. (D) Comparação entre o AdnaTest

® eo CellSearch

® sistema.

Correlação dos achados CTC para o site metastático e terapia

Usando o AdnaTest

®, nenhuma correlação foi encontrada em relação CTC-positividade ea localização das metástases (p 0,05). Achados semelhantes foram observados quando se utiliza CellSearch

® (p 0,05). Combinando ambos os ensaios também não resultou em uma correlação significativa entre a localização e estado de metástase CTC (p 0,05). estado CTC não se correlacionou com ter uma ou múltiplas metástases (p 0,05) em qualquer um dos métodos de detecção CTC. Curiosamente, a taxa de positividade CTC foi associado com uma linha superior da terapia, mediana 2

nd linha em caso de CTC negatividade em relação a mediana 4

th linha em caso de CTC positividade.

Correlação do CTC conclusões ao resultado clínico

curvas de Kaplan-Meier e log-rank estatística para casos CTC-negativo e CTC-positivos não revelaram correlação significativa em relação à sobrevida livre de progressão (PFS) quando se utiliza o AdnaTest

® (p = 0,43) (Figura 2A). Para CellSearch

® foi observada uma associação significativa entre PFS e estado CTC (p = 0,0467) (Figura 2B). Uma combinação de ambos os ensaios novamente não mostrou uma correlação significativa para PFS mas revelou uma tendência (p = 0,084) (Fig 2C).

Nós também testamos se a presença de CTCs pela AdnaTest

®, CellSearch

® ou os resultados combinados foram associados com sobrevida global reduzida (oS) em nosso paciente coorte mCRC. Usando a análise de Kaplan-Meier uma correlação significativa só poderia ser visto quando ambos os ensaios foram combinadas (p = 0,013), enquanto que os ensaios individuais sozinho não forneceu informação prognóstica significativa (AdnaTest

®: p = 0,31, CellSearch

®: p = 0,080) (Fig 3A-3C).

Discussão

o câncer colorretal é uma das principais causas de morte relacionada ao câncer e biomarcadores à base de sangue confiáveis ​​são urgentemente necessários para melhorar a seleção do tratamento inicial e modificações durante o tratamento. Até o momento, o marcador à base de sangue mais utilizado no CRC é CEA para obter informações de prognóstico no início do estudo e informação preditiva durante o tratamento [22-24]. Apesar do uso generalizado da CEA como um biomarcador de sangue não é nem doença específica, influenciada por outros fatores, e não tão confiável quanto outros biomarcadores mais recentes de sangue com base (por exemplo CTCs) [25].

OS é o mais terminal fiável em estudos clínicos e a detecção dos CTC já foi demonstrado ter um impacto no prognóstico muitas entidades tumorais, incluindo CCRm [11, 12, 21, 26-28]. Em nossa coorte, pudemos observar uma maior taxa de detecção de CTC e melhor informação prognóstico para OS quando pentear dois diferentes sistemas-o de detecção de CTC CellSearch aprovado pela FDA

® tecnologia ea AdnaTest

®. O prognóstico da PFS significativamente correlacionada com a detecção de CTC ao usar CellSearch

® sozinho (valor-p 0,046 vs. 0,43 quando se utiliza o AdnaTest

® e 0,084 para análises combinadas de ambos os ensaios). No entanto, PFS, por definição, refere-se à data em que é detectada a progressão e, além disso, depende da avaliação radiológica por um clínico, tornando PFS um ponto de extremidade mais confiável.

discordâncias significativas entre CellSearch

® eo AdnaTest

® na detecção de CTC já foram publicados [16, 29, 30]. No entanto, nenhum desses estudos correlacionaram a incidência do CTC para o resultado clínico. No presente estudo, uma combinação da CellSearch

sistema ® e o AdnaTest

® aumentou a taxa de detecção de 30% a 50% (30% quando se utiliza o AdnaTest

®; 33% quando se utiliza CellSearch

® (≥3 CTCs); 50% se ambos os ensaios foram combinadas). CTC índice de positividade parece estar associado com a linha avançada de tratamento (Tabela 2), que argumenta em favor da hipótese de que as contagens mais elevadas CTC permitir aos doentes para adquirir resistência a terapias sistémicas. Tendo em vista a heterogeneidade acentuada da CTC no CRC [31], a presença de mais CTC deve aumentar a probabilidade de abrigar os clones resistentes.

Embora pudemos demonstrar claramente que ambos os métodos em combinação melhorar a taxa de positividade para CTC , 50% dos pacientes ainda estavam negativa, apesar da presença de metástases evidentes. Além limitações técnicas dos ensaios (veja o próximo parágrafo) pode haver uma biologia interessante por trás da observação de que níveis CTC em CRC são mais baixos do que em câncer de mama. Pode-se argumentar que a disseminação de células tumorais in CRC é menos pronunciada, o que também explicaria por que os pacientes de CRC com metástases hepáticas podem ser curadas pela cirurgia em cerca de 20%, enquanto tal cura é raramente alcançado pelo mesmo tratamento no cancro da mama.

Ambos os ensaios utilizados nos nossos estudos dependem da expressão de marcadores de superfície de células epiteliais e são, portanto, susceptíveis de perder as populações CTC que tenham sido submetidos a uma completa transição epitelial-a-mesenquimal (EMT) [32-34]. No entanto, trabalho recente demonstrou-se que células de cancro com um fenotipo intermédio são, provavelmente, os mais agressivos capazes de disseminar e superar em locais distantes, devido à sua alta plasticidade [35, 36]. O sistema CellSearch

® eo AdnaTest

® são ambos capazes de detectar CTCs EMT-associados [37, 38]. Assim, os ensaios CTC utilizados na presente investigação e epitelial alvo CTC intermédios, enquanto CTC mesenquimais puros (sem qualquer expressão de marcadores epiteliais) são, provavelmente, perdido. A detecção dos CTC mesenquimais pura é de qualquer modo muito difícil, porque mesmo se livre de marcador (isto é,-EpCAM independente) (por exemplo, filtros de) marcadores epiteliais sistemas de captura são utilizadas, tais como as queratinas são geralmente aplicados para a detecção de CTC por causa da falta de mesenquimais marcadores que não são expressos nas células do sangue circundantes. Neste contexto, plastina-3, uma proteína de agregação da actina não regulada negativamente durante EMT em CRC e células de cancro da mama e não-expressos em leucócitos-pode ser um grande avanço [33, 34].

isento de células ácidos nucleicos (por exemplo, ADN de tumor isento de células ou miARNs) também estão a ser discutidos como sendo adequados como novos biomarcadores à base de sangue [39]. Mudanças em sua concentração, bem como alterações de DNA já foram mostrados para ser usado para diagnóstico, monitorização do tratamento, preditiva, ou para fins de prognóstico [40-43]. No entanto, a maioria dos ctDNA é derivado de células tumorais em apoptose, enquanto que a análise CTC tem a vantagem de estudar as células tumorais viáveis, que também podem melhorar a nossa compreensão actual da disseminação de células de tumor em pacientes com cancro. Além disso, até agora nenhum ensaio /protocolo normalizado para a detecção de ácidos nucleicos ou miARNs isentos de células pôde ser estabelecida na doença CCRm e abordagens diferentes para a descoberta desses biomarcadores são utilizados nos laboratórios de todo o mundo. Recentemente, uma estratégia de fluxo de trabalho padronizado foi sugerido para a normalização de dados de expressão de miRNA como um novo ponto de partida para procedimentos padronizados para permitir a comparação de dados em laboratórios diferentes [44]. O desenvolvimento de Assys padronizados que podem ser usados ​​para diagnóstico do companheiro é o foco do consórcio UE-IMI recém-criada chamada CANCER-ID (www.Cancer-id.eu).

Muita debate está em curso se CTCs pode ser usado como biópsias líquidos orientadores decisões de tratamento individualizado [10]. Usando o AdnaTest

® e CellSearch

® fomos capazes de detectar alvos terapêuticos relevantes, tais como

EGFR

/EGFR. Sinais para

EGFR

/EGFR em CTCs não se correlacionou em nosso estudo entre a AdnaTest

® e CellSearch

® (Tabela 2), que é provavelmente devido às diferentes populações CTC capturados com os nossos ensaios . Isso mostra mais uma vez a complementaridade de ambos os ensaios.

Em suma, podemos mostrar que uma combinação de diferentes ensaios de CTC aumenta o aparecimento de CTCs de um grupo não selecionada de pacientes com CCRm. Uma correlação significativa para OS só poderia ser visto quando ambos os ensaios foram combinadas (p = 0,013). Estas descobertas podem ajudar a estabelecer CTCs como no tratamento de biomarcadores para a rotina clínica em estudos futuros.