Abstract
anti-inflamatórios não-ativado droga gene-1 (NAG-1) é induzida por não esteróides anti-inflamatórios e possui actividades pró-apoptóticos e anti-tumorigénica. Embora o ácido tolfenâmico (TA) induz a apoptose em células de câncer de cabeça e pescoço, não foi determinada a relação entre NAG-1 e AT. Este estudo investigou a indução de apoptose em células de câncer de cabeça e pescoço tratados com TA eo papel da NAG-1 expressão neste indução. TA reduzida cabeça e a viabilidade celular do cancro do pescoço de uma forma dependente da dose e a apoptose induzida. A apoptose induzida foi coincidente com a expressão de NAG-1. A sobre-expressão de NAG-1 aumentou o efeito apoptótico de TA, enquanto a supressão de NAG-1 por expressão pequenos ARN interferentes atenuados apoptose induzida por TA. TA inibiu significativamente a formação de tumor tal como determinado por modelos de xenotransplante, e este resultado acompanhou a indução de células apoptóticas e de NAG-1 expressão em amostras de tecido de tumor. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram que TA induz apoptose via NAG-1 expressão em cabeça e pescoço carcinoma de células escamosas, fornecendo uma explicação mecanicista adicional para a actividade apoptótica de TA
Citation:. Kang SU, Shin YS, Hwang HS, Baek SJ, Lee SH, Kim CH (2012) ácido tolfenâmico induz a apoptose ea inibição do crescimento em Câncer de Cabeça e Pescoço: Envolvimento de NAG-1 Expression. PLoS ONE 7 (4): e34988. doi: 10.1371 /journal.pone.0034988
editor: Subhash Gautam, Henry Ford Health System, Estados Unidos da América
Recebido: 09 de janeiro de 2012; Aceito: 08 de março de 2012; Publicação: 19 de abril de 2012
Direitos de autor: © 2012 Kang et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados
Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Coreia do Research Foundation Grant (KRF-013-2009-1-E00015) e CCRB através do Projeto “GRRC” de Gyeonggi Governo Provincial, Coreia (GRRC Ajou-2011-A03). Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito
CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes
Introdução
Com mais de 500.000 casos em todo o mundo e uma alta taxa de mortalidade, carcinoma de cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é o sexto tipo de câncer mais comum em homens. Mesmo com tratamentos melhorados, a taxa de sobrevida global foi inferior a 50% nos últimos 30 anos [1]. Embora alguns pacientes a alcançar sobrevivência a longo prazo, especialmente aqueles diagnosticados com doença em estágio inicial, a maioria dos pacientes com este tipo de câncer tem doença avançada no momento do diagnóstico. Esses pacientes correm um risco de doença recorrente, metástases à distância, ou segundo tumor primário, e têm uma sobrevida média de apenas 6-8 meses [2]
A taxa de sobrevida global em 5 anos para pacientes com CECP avançado é cerca de 30%, que é essencialmente inalterada em relação à taxa registrada há duas décadas, apesar de vários ensaios clínicos de tratamento. Portanto, as estratégias preventivas são desejáveis, e muita pesquisa se destina actualmente à quimioprevenção que visa prevenir a progressão CECP em um estágio inicial. No entanto, que os agentes quimiopreventivos são a mais segura e mais eficaz contra HNSCC permanece obscuro. É de importância clínica para investigar a eficácia de drogas anti-inflamatórias não esteróides (NSAIDs) como agentes quimiopreventivos.
agentes quimiopreventivos desempenhar um papel importante em interromper o processo carcinogénico e inibir a recorrência de lesões pré-cancerosas. Actualmente, os agentes farmacêuticos que têm sido mais amplamente investigados como agentes quimiopreventivos são NSAIDs. NSAIDs têm sido clinicamente utilizados como agentes quimiopreventivos para polipose adenomatosa familiar, com o modo de actuação sendo a inibição de ciclo-oxigenase-2 (COX-2) [3], [4]. No entanto, as actividades anti-tumorigénica e quimiopreventivos de AINEs, também têm sido observadas em células COX-2 deficiente, indicando que os AINEs, também exercem o seu efeito anti-cancro por meio de um mecanismo diferente do que a COX-2 de supressão. Um tal mecanismo envolve a indução de genes activados por AINE-1 (NAG-1) [5].
NAG-1 foi identificado a partir de indometacina (um inibidor de COX) biblioteca de genes induzida por [5]. NAG-1 é um membro do fator de crescimento transformador-beta (TGF-β) superfamília e também é conhecido como macrófagos inibidora de citoquina-1 (MIC-1), factor de diferenciação do crescimento 15 (GDF15), e o factor derivado de próstata (PDF) [6], [7], [8]. Purificada NAG-1 recombinante é capaz de inibir a induzida por lipopolissacárido factor de necrose tumoral-alfa (TNF-α) produção de macrófagos, o que sugere que a NAG-1 actua como uma molécula reguladora autócrino [9].
In vitro
e
in vivo
, NAG-1 tem actividades anti-tumorigénica e pró-apoptóticos independentes da inibição da COX [5], [10]. AINEs e vários compostos anti-tumorigénica com atividades quimiopreventivos, incluindo resveratrol, a genisteína, catequinas e peroxissoma receptor- ativado por proliferadores
γ
ligantes, regular NAG-1 expressão de uma forma independente de prostaglandina [11], [12] [13], [14], [15].
no entanto, até agora, a relação, se houver, entre NAG-1 e AT em HNSCC não foi investigada. atividade pró-apoptótica de NAG-1 pode fornecer uma base molecular para explicar agente quimiopreventivo, antitumorigenesis TA-mediada.
Neste estudo, nós examinamos a regulação da NAG-1 expressão durante a apoptose induzida por TA em células de CECP . NAG-1 RNA interferente pequeno (siRNA) inibição mediada de NAG-1 expressão atenuada apoptose induzida por TA. Além disso, o
in vivo
actividade anti-tumorigénica de TA em camundongos, foi investigada para avaliar o uso de TA como um agente quimiopreventivo para CECP. Os dados sugerem que a indução de NAG-1 pode fornecer um novo mecanismo para a compreensão dos efectores a jusante para a apoptose induzida por TA para CECP.
Materiais e Métodos
As linhas celulares e reagentes
Quatro linhas estabelecidas humanos de cabeça e pescoço de células cancerosas – KB (uma linha de células de câncer oral), SCCQLL1 (uma linha de células de câncer oral), HN3 (uma linha de células de câncer de laringe) e FaDu (uma linha de células de câncer de hipofaringe) – foram obtidas da American Type Culture Collection (Manassas, VA) e coreano Linha celular Banco (Seoul, Coreia). As células foram cultivadas em meio modificado por Dulbecco de Eagle com soro de bovino fetal a 10% e penicilina-estreptomicina a 100 U /ml (Gibco, Carlsbad, CA) a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 5% de CO
2 e 95% ar. TA, diclofenac, sulindac sulfureto, indometacina, piroxicam e (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) foram dissolvidos em água esterilizada, como solução de reserva para
In vitro
estudos. Para investigar o efeito do TA sobre as células normais, usamos células HaCaT (queratinócitos normais) que foram obtidos a partir de celular Linha Korean Bank (Seul, Coréia).
A proliferação celular ensaio
A viabilidade celular foi testado utilizando um ensaio baseado na conversão de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difenil-tetrazólio (MTT, Sigma Aldrich). solução de MTT foi adicionado a 40 ul de suspensão de células durante 4 h. Após três lavagens com solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,4), o produto de formazano insolúvel foi dissolvido em 100 ul de dimetilsulfóxido. A densidade óptica (OD) foi medida para cada poço de cultura, utilizando um leitor de microplacas (Bio-Tek, Winooski, VT) a 540 nm. O OD de células de controlo foram tomados como 100% de viabilidade.
desoxinucleotidil Terminal dUTP-biotina nick rotulagem final (tunel) Ensaio
fragmentação de DNA mediada por transferase foi analisado com o
in situ
kit de detecção da morte celular (Roche Molecular Biochemicals, Basileia, Suiça), de acordo com as instruções do fabricante. As células coradas foram analisadas com um microscópio de fluorescência (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemanha).
A citometria de fluxo de detecção de apoptose
A apoptose foi detectada utilizando o isotiocianato de Anexina V-fluoresceína (FITC) de detecção da apoptose kit (BD Biosciences, Bedford, MA). Resumidamente, as células foram plaqueadas em 6 poços de cultura de pratos e incubadas com 0, 10, 20, e 40 uM, durante 24 h TA. As células foram colhidas, lavadas com PBS e coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI). Cedo e apoptose tardia foram quantificados de acordo com as instruções do fabricante. A apoptose foi detectada utilizando um sistema FACS Canto (BD Biosciences, Bedford, MA), com configurações de excitação e emissão de 488 e 530 nm, respectivamente.
potencial de membrana mitocondrial (MMP) Ensaio
MMP de células intactas foi medida por citometria de fluxo com a sonda catiónico lipófilo 5,5 V, 6,6 V-tetracloro-1,1 iodeto ethylbenzimidazolcarbocyanine V V 3,3-tetra (JC-1, Molecular Probes, Eugene, OR). O meio de cultura foi rapidamente removido a partir das células KB aderentes, e as células foram lavadas com PBS. As monocamadas de células foram incubadas com DMEM e 5 ug /ml de JC-1 a 33 ° C durante 20 min. As células foram subsequentemente lavadas duas vezes com PBS frio e tripsinizadas. As pelotas de células foram então ressuspensas em 500 ul de PBS. A mudança de MMP foi medida por citometria de fluxo (BD Biosciences) e microscopia de fluorescência às 72 horas após a irradiação.
Transfectiom de NAG-1 cDNA e interferência de RNA (RNAi)
Todas as experiências de transfecção foram realizada utilizando reagente Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) de acordo com as instruções do fabricante, como previamente descrito [5]. Após incubação durante 24 h, o meio foi removido e as células foram lavadas com PBS e tratados com TA ou veículo durante 24 h. ADNc NAG-1 foi descrita anteriormente [5]. siRNA de controlo e de NAG-1 (sentido e anti-sentido CUCAGUUGUCCUGCCCUGUdTdT ACAGGGCAGGACAACUGAGdTdT) foram adquiridos a partir de Invitrogen.
análise Western blot
As células foram lavadas com PBS frio e suspensas em tampão RIPA (Sigma-Aldrich) suplementado com PhosSTOP e completa Mini EDTA-free (Roche Molecular Biochemicals, Basel, Suíça). As proteínas a partir de células KB foram electrotransferidas para membranas Immobilon-P (Millipore, Bedford, MA). A detecção de proteínas específicas foi realizado com um kit de quimioluminescência aumentada Western blotting de acordo com as instruções do fabricante.
estudo animal
células KB (1 × 10
6) re-suspensas em PBS foram administrada por via subcutânea para o flanco inferior direito de cada /c nu /nu rato BALB. Após 1 semana, quando os tumores atingiram cerca de 100 mm de diâmetro, os ratos foram divididos aleatoriamente em dois grupos (n = 10 por grupo) e o tratamento foi iniciado. O tratamento foi iniciado no dia após a implantação da célula quer com injecção intraperitoneal de TA (25 mg /kg) por dia (grupos de tratamento) ou apenas solução salina (grupo de controlo). Os tumores foram medidos com um compasso de calibre de deslizamento uma vez a cada 2 dias e os volumes (mm
3) foram calculados de acordo com a fórmula V = A x B
2 × 0,52, em que A é o diâmetro superficial maior e B é o diâmetro superficial menor [16]. Os animais foram sacrificados, e os tumores foram recolhidos e pesados 17 dias após a implantação. Metade do tecido foi congelados instantaneamente em azoto líquido e usada para a extracção de proteínas. A outra metade foi fixada durante a noite em formalina tamponada neutra e processados por métodos de rotina. Western blotting de NAG-1 foi realizada em amostras tumorais e de amostras normais de tecidos moles. Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina da Universidade de Ajou.
Análise estatística
Quando os dados foram obtidos a partir de três experimentos independentes, os parâmetros foram expressos em ± médios SD. Comparação dos meios de diferentes grupos foi realizada utilizando uma análise de variância. O teste de Student-Newman-Keuls foi utilizado para comparações de pares de resultados encontrados para ser significativa por medidas repetidas de ANOVA. A significância estatística foi inferida a
p
. 0,05
Resultados
Indução da NAG-1 e apoptose em células de CECP por vários NSAIDs
Para investigar os efeitos dos AINEs sobre o crescimento de células CECP, as quatro linhas de células de carcinoma epidermóide seleccionados foram incubadas com várias concentrações (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, e 200 ^ M) de TA, durante 16 h e células a viabilidade foi medida pelo ensaio de MTT. Como mostrado na Fig. 1, vários NSAIDs reduziu a viabilidade celular de uma forma dependente da dose (Fig. 1A) e TA reduziu significativamente a viabilidade das linhas de células de carcinoma epidermóide (Fig. 1B). Especialmente, TA foi o mais potente indutor tanto apoptose e NAG-1 expressão (Fig. 1 e 2), e foi selecionado para futuras pesquisas. Em seguida, para investigar os efeitos tóxicos de TA sobre as células normais, foi realizado ensaio de proliferação celular em células HaCaT (queratinócitos normais). As células HaCaT foram tratados com TA durante 16 h nas concentrações indicadas (0, 5, 10, 30, 50, 70, 100, 150, 200 uM). A viabilidade relativa das células HaCaT foi examinada utilizando o ensaio de MTT (Fig. 1C). TA foi citotóxico minimamente em HaCaT até 100 uM, mas TA foi citotóxico significativo nas células com as concentrações elevadas.
Os resultados do ensaio de proliferação. As células foram plaqueadas em placas de 96 poços de cultura de tecidos a 1000 células /poço num volume final de 100 ul de meio e foram deixadas a aderir durante 2 dias. As células foram depois tratadas uma vez com doses variadas de TA durante 24 h. A proliferação celular foi estimada pelo ensaio de MTT. Os valores representam a média ± S.D. de cinco experiências independentes. *
p Art 0,05; **
p Art 0,01, em comparação com o grupo controle. (A) A linha de cabeça e de células do cancro do pescoço KB foi tratada com AINEs. (B) citotoxicidade do TA em várias células CECP. (C) A citotoxicidade da AT em células de queratinócitos normais (HaCaT)
(A) NAG-1 expressão foi induzida por AINEs na seguinte ordem:. TA, indometacina, sulindac sulfureto, diclofenac e piroxicam . Expressão de NAG-1 foi medida por análise de Western blot e normalizados para o nível de a-tubulina de expressão. (B) Indução de NAG-1 expressão em várias linhas celulares de cancro da cabeça e pescoço por TA. (C e D) TA dose e dependente do tempo aumenta os níveis de proteína NAG-1 em células KB. As células KB foram tratados com 0, 10, 30, e 40 uM, durante 24 h TA. Expressão de NAG-1 foi medida por análise de Western blot e α-tubulina foi utilizada como controlo de carga. A mesma membrana foi despida e re-sondadas com PARP clivada e clivado anticorpo caspase-3.
Para explorar o relacionamento entre a apoptose induzida por NSAID e NAG-1 expressão, células CECP foram tratadas com várias As concentrações de proteína e de NSAID níveis de NAG-1 foram medidos por análise de Western blot. Como mostrado na Fig. 2, vários NSAIDs induziu a expressão de NAG-1 de proteínas em células KB (Fig. 2A) e TA expressão induzida de NAG-1 em várias células CECP (Fig. 2B). TA também induziu expressão de NAG-1 proteína em doses e tempo-dependente maneiras (Fig. 2C e 2D). Quando as células foram tratadas com 40? M de TA durante vários tempos, a indução de NAG-1 de proteína foi observada após 3 h em células KB (fig. 2D). A mesma membrana foi despida e re-sondados para clivado poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e caspase-3 clivada, que também foram induzidos por TA (fig. 2C e 2D). No geral, estes resultados sugerem que o AT induzida morte celular por apoptose e a paragem do crescimento celular em linhas de células de carcinoma epidermóide é, provavelmente, mediada pela expressão da proteína pro-apoptótica NAG-1. Para determinar se a morte celular induzida por TA foi por apoptose, foi realizada de células activadas por fluorescência (FACS) com Anexina-V /PI e coloração TUNEL. Como mostrado na Fig. 3, células de anexina V-FITC-positivos foram também aumentadas por tratamento TA em células KB (Fig. 3A) e de células de TUNEL-positivos por TA aumentou de uma forma dependente da dose (0, 10, 20, e 40 uM) em KB células (Fig. 3B). MMP pode ser usado como um índice de abertura do poro mitocondrial, que é um indicador de disfunção mitocondrial. A análise quantitativa dos sinais de fluorescência vermelha e verde de JC-1 intracelular corante reflecte o grau de dano mitocondrial. Portanto, examinámos o efeito de TA em MMP nas células KB para determinar se a perda de MMP poderia desempenhar um papel na apoptose induzida por TA. Como mostrado na Fig. 3C, uma alta de MMP foi mantida em células de controlo, como indicado pela fluorescência predominantemente vermelha do corante JC-1. No entanto, o tratamento TA aumentou a fluorescência verde célula indicando uma perda de MMP e o dano mitocondrial (Fig. 3C).
(A) para a detecção de citometria de fluxo de células apoptóticas, as células foram plaqueadas em 6 poços de cultura e pratos incubadas com 0, 10, 20, 30 e 40 uM, durante 24 h TA. As células foram colhidas e lavadas com PBS e depois coradas com anexina V-FITC e iodeto de propídio (PI). Cedo e apoptose tardia foram quantificados. Os dados são valores médios obtidos a partir de três experiências independentes e barras representam desvios padrão. (B) Os resultados da análise TUNEL. Apoptose em células KB foi determinado pelo método TUNEL em utilizando um kit de detecção de células in situ. As células foram tratadas com as concentrações indicadas de TA durante 24 h. TUNEL coloração foi aumentada em morte celular apoptótica. Esquerda, 4 ‘, 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI); meio, TUNEL; direita, se fundem. A barra de escala indica 50 um. (C) O efeito de TA na via apoptótica mitocondrial. Após a aplicação de 10, 20, 30, e 40 uM TA durante 24 h, a fluorescência de JC-1 mudou de vermelho-laranja para verde, indicando despolarização da membrana mitocondrial potencial (MMP). A mudança MMP foi objetivamente medidos utilizando citometria de fluxo. Os dados representam a média ± DP de três experiências independentes. *,
P Art 0,05; **,
P Art 0,01; ***,
P Art 0,001 comparado com o grupo controle
A superexpressão e supressão de NAG-1 promove e atenua a apoptose induzida por TA, respectivamente
em seguida, tentou esclarecer o significado da NAG-1-regulação na apoptose induzida por TA. ADNc NAG-1 humana foi transfectada em células KB. NAG-1 sobre-expressão causou aumento da clivagem de caspase-3 e clivada de PARP, e tratamento de KB /NAG-1 com 40 uM TA reforçada tanto caspase-3 clivada e clivado da PARP, em comparação com células de controlo tratadas com TA (fig. 4A). Em paralelo com o aumento da caspase-3, as células KB /NAG-1 marcadamente aumentada características morfológicas típicas da apoptose, incluindo a coloração de células Anexina V-positiva e de TUNEL positivo, em comparação com células de controlo. Este efeito foi ainda aumentado por tratamento TA (fig. 4B e 4C). Nós, então, examinou se a supressão da NAG-1 expressão pode modular a apoptose induzida por TA. As células KB transfectadas com NAG-1 ou ARNsi de controlo foram tratadas com ou sem 30 uM TA durante 24 h. A análise de imunotransferência demonstram que a transfecção de ARNsi contra NAG-1 suprimiu a expressão de NAG-1, PARP clivada e clivada da caspase-3 na presença de TA, em comparação com células de controlo transf ectadas (Fig. 5a). Sob estas condições, TA mediada por células Anexina V-positivos e TUNEL positivos foram significativamente atenuada em células transfectadas com ARNsi NAG-1 (Figs. 5B e 5C). Tomados em conjunto, estes resultados sugerem que a NAG-1 desempenha um papel na apoptose e que a inibição de NAG-1 em células KB afectar a apoptose induzida por TA. Além disso, estes resultados sugerem que a induzida por TA NAG-1 sobre-regulação pode ser um dos mecanismos subjacentes que contribuem para a apoptose induzida por TA.
células /vector /NAG-1 e KB KB foram tratados com 30 uM TA durante 24 h, e a apoptose foi analisada utilizando um ensaio de TUNEL e por FACS com anexina V-FITC /PI. (A) Western Blot. Quantidades iguais de lisados celulares (30 ug) foram resolvidas por electroforese em gel de sulfato de poliacrilamida dodecil de sódio (SDS-PAGE), transferidos para membrana de nitrocelulose e sondados com anti-NAG-1, PARP clivada, caspase-3, ou α-tubulina anticorpo. (B e C) a apoptose em células KB foi determinado pelo método de TUNEL e por FACS com AnnexinV-FITC /PI, como descrito na Fig. 3. Os dados são valores médios obtidos a partir de três experiências independentes e barras representam desvios padrão. A barra de escala indica 50 um.
células KB transfectadas quer com o indicado NAG-1 siRNA ou ARNsi de controlo negativo foram tratadas com ou sem 30 uM TA durante 24 h. A apoptose foi analisada pelo ensaio de TUNEL e por FACS com AnnexinV-FITC /PI. (A) Western Blot. Quantidades iguais de lisados celulares (30 ug) foram resolvidas por SDS-PAGE, transferidos para membrana de nitrocelulose e sondados com anti-NAG-1, PARP clivada, caspase-3, orαα-tubulina. (B e C) a apoptose em células KB foi determinado pelo método de TUNEL e por FACS com AnnexinV-FITC /PI, como descrito na Fig. 3. Os dados são valores médios obtidos a partir de três experiências independentes e barras representam desvios padrão. A barra de escala indica 50 um.
Efeito da TA na tumorigenicidade e apoptose em camundongos BALB /c nu /nu
Para determinar se os resultados acima mencionados eram evidentes
in vivo
, foram utilizados os /c camundongos nu /nu BALB dividiu-o aleatoriamente, em grupo controle e tratamento em grupo (25 mg /kg TA) após a formação do tumor (cerca de 100 mm de diâmetro). Todos os ratinhos sobreviveram durante todo o período experimental. A administração de TA afetou significativamente a formação de tumores e desenvolvimento (
p Art 0,05;. Figuras 6A e 6B). No entanto, não houve diferença significativa entre os dois grupos no peso corporal. TUNEL coloração revelou que a AT aumentou significativamente o número de células positivas TUNEL (Fig. 6C). Para investigar o nível de NAG-1 nos tumores, Western blotting de NAG-1 expressão em espécimes de tumor de ratinhos BALB /c ratinhos nu /nu foi realizada. indução forte de
in vivo
NAG-1 na expressão de proteínas, que foram extraídos a partir de tumores em ratinhos tratados com TA foi evidente, em comparação com ratinhos de controlo. (Fig. 6D) Os dados sugerem que o AT aumenta a expressão de NAG-1 em tumores e de que a NAG-1 induzida suprime o tamanho de tumores.
(A) ratinhos BALB /c nu /nu ratinhos foram aleatoriamente divididos em dois grupos iguais (de controlo e 25 mg /kg) após a injecção de células KB. Após a formação de tumor (cerca de 100 mm de diâmetro), foi iniciado o tratamento com injecção intraperitoneal de qualquer TA (25 mg /kg) por dia (grupos de tratamento) ou um volume igual de solução salina apenas (grupo de controlo). Os animais foram sacrificados e os tumores foram recolhidos e pesados 17 dias após a implantação. (B) O gráfico do volume e peso dos tumores. (C) TUNEL coloração em grupos de controle e tratamento. A barra de escala indica 50 um. (D) GAN-1 expressão em tumores implantados KB. A indução de NAG-1 por TA é comparado com cada controlo.
Discussão
AINEs inibem a síntese de COX-dependente de prostaglandinas que medeiam as respostas inflamatórias em vários tecidos [3], [ ,,,0],4], [5]. AINEs, também induzem a inibição do crescimento celular, apoptose, e antiangiogenesis; a activação das vias envolvidas nestes efeitos é crítica para as actividades anticancerígenas reportados dos AINEs e inibidores de COX-2 relacionados, tais como celecoxib [17], [18], [19], [20], [21]. Estudos epidemiológicos extensas do papel dos NSAIDs na prevenção e tratamento do cancro do cólon tem proporcionado provas de que a utilização de NSAIDs, tais como a aspirina e alguns inibidores COX-2, que está associada com uma diminuição da incidência e /ou mortalidade de cancro do cólon [22], [23], [24].
recentemente, relatou-se que os AINE ter outros objectivos para além da COX-2. He et al [25]. relataram que a proliferação Peroxissoma delta do receptor activador (PPARô) é também um alvo -regulated polipose adenomatosa coli (APC) de AINEs. Além disso, os metabolitos de NSAIDs pode suprimir o sinal de sobrevivência factor nuclear-kB (NF-kB) por meio de (IκKα) inibição da quinase I kB α [26]. Estes indicam que os AINEs inibem o crescimento do tumor por meio das vias de COX-dependentes e independentes de.
TA é um potente AINE, bem tolerado com um efeito secundário gástrico baixo e alto índice terapêutico, em comparação com outros AINEs [27] . Possui actividades analgésicas e antipiréticas como evidenciado em vários modelos animais e mostrou resultados promissores no tratamento de longo prazo de osteoartrite, artrite reumatóide, enxaqueca e [27]. TA também afecta a apoptose em células de cancro colorectal, bem como metástase e tumorigénese em modelos de cancro pancreático [28] [29], [30].
Especificidade de proteína 1 (SP1) degradação por TA inibe várias linhas celulares de cancro incluindo as células cancerígenas pancreáticas [28], [29]. Assim, o SP1 pode ser outro alvo molecular possível para a apoptose induzida por TA. TA também diminuiu vários genes Sp-dependentes e proteínas, tais como factor de crescimento endotelial vascular (VEGF), VEGFR1, survivina, ciclina D1, e Bcl-2, e essas respostas contribuir para a sua actividade anti-cancerígena [31]. Recentemente, Kim et al. mostrou que as proteínas de COX-1 e COX-2 não foram alterados pela TA TA e que a inibição do crescimento celular induzida ocorreu de um modo independente de COX-em células KB CECP [32].
Apesar destes avanços no conhecimento, o mecanismo molecular da TA em antitumorigenesis em HNSCC não é clara. É provável que vários mecanismos são operativas. Os efeitos de TA sobre o crescimento de células de cancro humano KB e o mecanismo subjacente a estes efeitos foram presentemente investigados.
Neste estudo, foi demonstrado que os AINEs induzem NAG-1 e expressão de apoptose em células de CECP, e que o TA é o NSAID mais potentes dos que foram testados. Embora a indução da apoptose por NSAIDs foi observada em várias células de cancro [10], [11], [33], [34], [35], o AINE específico que causa a indução máxima de NAG-1 expressão depende do tipo da célula cancerosa. Por exemplo, sulindac sulfureto é o mais potente NAG-1 indutor de câncer colorretal e indometacina é o mais potente no câncer sinonasal [5], [10], [36] Estas diferenças estão provavelmente relacionados com a regulação complexa de NAG-1 expressão , que envolve tanto mecanismos de transcrição e pós-transcrição. Além disso, a sua expressão parece envolver elementos cis e trans-acting promotoras, vários factores de transcrição, e de outras substâncias anti-tumorigénica [37]. NAG-1 também é um alvo a jusante da p53 diversificada, ERG-1 e AKT /GSK-3 supressores de tumor vias [12], [13], [14], [38], [39], [40], [ ,,,0],41]. Assim, o mecanismo de NAG-1 regulação depende do tipo de célula e o modo de indução. Outros estudos sobre a indução de NAG-1 em células por TA CECP são necessárias.
Os presentes dados demonstram que a NAG-1 é um dos principais reguladores da apoptose induzida por TA. TA inibiu o crescimento de células KB (Fig. 1). Uma concentração mais elevada de TA (100 fiM) resultou em morte celular superior a 70%, com as células se solte e arredondado-se dentro de 24 h após o tratamento.
Além disso, a apoptose induzida por TA como evidenciado pelo aumento do sub população -G1, fragmentação nucleossomal (dados não mostrados), e PARP clivada (Fig. 2), sugerindo que a apoptose contribui para os efeitos inibidores de TA sobre a viabilidade das células KB. Estes resultados estão de acordo com os relatórios anteriores que a AT induz clivagem PARP em células de câncer colorretal [30] e células de câncer pancreático [28].
manifestos dano mitocondrial como uma hiperpolarização inicial, seguido por uma perda de potencial de membrana mitocondrial e a libertação de proteínas a partir do espaço intermembranar mitocondrial, tal como o citocromo c. perturbação direta e indireta das mitocôndrias pode ativar a via apoptótica. TA induzida significativamente a perda de MMP (Fig. 3), sugerindo que o dano mitocondrial está envolvida na apoptose induzida por TA.
NAG-1 foi induzida por TA em uma dose e forma dependente do tempo (Fig. 2), e a sobre-expressão de NAG-1 aumentou o efeito apoptótico de AT (Fig. 4). Além disso, knockdown mediado por siRNA de NAG-1 atenuado apoptose TA-induzida (Fig. 5), sugerindo que a NAG-1 expressão está intimamente associada com apoptose.
O
in vivo
atividade anticarcinogenic de TA foi investigada em ratos pelados atimicos com células KB como xenoenxertos. A uma dose de 25 mg /kg /dia, o crescimento do tumor inibiu significativamente a TA e de peso e aumento de TUNEL de células coradas positivamente (apoptose) em secções de tumores de tratado versus animais de controlo. Isto foi acompanhado por um aumento da NAG-1 coloração em tumores de ratos tratados (Fig. 6). Estudos clínicos com TA para o tratamento crónico de artrite reumatóide utilizou doses de TA tão elevado como 10 mg /kg /dia, que é apenas 2,5 vezes mais baixa do que a dose necessária para uma inibição do crescimento do tumor HNSCC num modelo de murganho de xenoenxerto. Estes resultados demonstram que a AT é um agente anti-cancerígeno altamente eficaz tanto em
in vitro Comprar e
in vivo
modelos de CECP, e complementa os resultados anteriores [29], [31], [32]. O mecanismo de acção da AT como um inibidor de crescimento de tumor é devido, em parte, para a indução de genes relacionados com NAG-1 NAG-1 e.
A ligação entre a NAG-1 e a indução TA revelou neste estudo fornece um novo mecanismo molecular que podem contribuir para as actividades anti-tumorigênicos de TA em CECP.