Abstract

A sobrecarga de ferro tem sido associado com a carcinogênese em humanos. A administração intraperitoneal de nitrilotriacetato férrico inicia uma reacção de Fenton no túbulos renais proximais de roedores que conduz finalmente a uma elevada incidência de carcinoma de células renais (RCC) após tratamentos repetidos. Foi realizada de alta resolução microarray de hibridização genômica comparativa para identificar as características nos perfis genômicos deste CCRs de ratos induzida por estresse oxidativo. Os resultados revelaram alterações genômicas extensas grande escala com uma preferência para exclusões. Eliminações e amplificações foram numerosas e, por vezes fragmentada, demonstrando que a reação de Fenton é uma causa de tais alterações genômicas

in vivo

. plotagem frequência indicou que dois dos loci mais comumente alterados correspondeu a um

CDKN2A

/

2b

exclusão e um

Met

amplificação. Os tamanhos dos tumores foram proporcionalmente associado com

Met

expressão e /ou amplificação e análise de agrupamento confirmaram nossos resultados. Além disso, foi desenvolvido um procedimento para comparar os padrões inteiros genômicos das alterações no número de cópias entre espécies diferentes com base no relacionamento sintênica cromossômica. Padrões dos CCRs ratos mostrou a semelhança forte aos CCRs humanos entre os cinco tipos de cânceres humanos, seguido por mesotelioma maligno humano, um cancro associado a sobrecarga de ferro. Portanto, uma Fenton reação química dependente de ferro provoca alterações genômicas em grande escala durante a carcinogênese, que podem resultar em perfis genômicos distintas. Com base nas características de extensas alterações do genoma do câncer humano, nossos resultados sugerem que esta reação química pode desempenhar um papel importante durante a carcinogênese humana

Citation:. Akatsuka S, Yamashita Y, Ohara H, Liu YT, Izumiya M , Abe K, et al. (2012) Fenton Reaction Cancer induzida em ratos tipo selvagem Recapitulates Genomic alterações observadas em Câncer Humano. PLoS ONE 7 (8): e43403. doi: 10.1371 /journal.pone.0043403

editor: Kamaleshwar Singh, Texas Tech University, Estados Unidos da América

Recebido: 02 de março de 2012; Aceito: 19 de julho de 2012; Publicação: 29 de agosto de 2012

Direitos de autor: © Akatsuka et al. Este é um artigo de acesso aberto distribuído sob os termos da Licença Creative Commons Attribution, que permite uso irrestrito, distribuição e reprodução em qualquer meio, desde que o autor original ea fonte sejam creditados

Financiamento:. Este estudo foi apoiada pela Princesa Cancer Research Fund Takamatsu (10-24213); um Grant-in-Aid para Cancer Research do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-estar do Japão; e um Grant-in Aid do Ministério da Educação, Cultura, Desporto, Ciência e Tecnologia do Japão. Os financiadores não tiveram nenhum papel no desenho do estudo, coleta de dados e análise, decisão de publicar ou preparação do manuscrito

CONFLITO DE INTERESSES:.. Os autores declararam que não existem interesses conflitantes

Introdução

O câncer é uma doença de alterações genômicas acumulados, presumivelmente causado por um processo sistemático durante a lesão celular e reparação. agentes causadores de carcinogênese são numerosos, incluindo γ, radiação ultravioleta, inflamação, produtos químicos e sobrecarga de ferro [1]. dados genômicos de uma variedade de cancros humanos é actualmente analisadas quer com hibridização genômica comparativa baseada em array (CGH) [2] ou sequenciamento de última geração [3], [4]. Estes projectos são realizados para encontrar mutações genéticas causais que levarão à identificação de novos produtos químicos ou de anticorpos dirigidos para as interações de moléculas de sinalização responsáveis. se espera que estes esforços para resultar em desenvolvimentos de medicamentos eficazes. No entanto, a prevenção do câncer na vida diária é tão importante quanto a sua terapia.

No presente estudo, procuramos resolver papéis de estresse oxidativo mediado pelo ferro durante a carcinogênese usando CGH baseada em array. O stress oxidativo é constitutivamente causada pelo metabolismo do oxigénio molecular [5], mas é principalmente regulado por vários sistemas antioxidantes. No entanto, em uma variedade de condições patológicas, cargas de estresse oxidativo exceder a capacidade antioxidante [6]. O ferro é o metal pesado mais abundante em mamíferos, tal como roedores e humanos. Considerando que o ferro é essencial para o transporte de oxigénio, como um componente da hemoglobina, o excesso de ferro tem sido associada com a carcinogénese [7], [8], presumivelmente através de uma reacção de Fenton [9]. formas iónicas, de ferro são pouco solúveis a um pH neutro, mas nitrilotriacetato férrico (Fe-NTA), um quelato de ferro, é solúvel a pH 7,4 e é um agente catalítica eficiente para a reacção de Fenton [10]. Na década de 1980, o nosso grupo demonstrou que repetidas administrações intraperitoneais de Fe-NTA de induzir uma elevada incidência de carcinoma de células renais (RCC) em roedores [11], [12]. Mais tarde, mostrou que a lesão renal ocorre através de uma reacção de Fenton com uma variedade de produtos químicos mediada por radicais hidroxilo, tal como 8-hidroxi-2′-desoxiguanosina [13], [14] e 4-hidroxi-nonenal [15] , [16]. Fica estabelecido que uma sobrecarga de ferro em muitas condições patológicas está associada com a presença de ferro catalítico [17], [18].

Assim, avaliando todo genoma de CCRs, poderíamos encontrar um princípio geral para o alterações genômicas em condições de oxidação-esforçado. Nós relatamos um

CDKN2A /2b

exclusão usando a análise de microssatélites neste modelo [19]. Neste estudo, avaliou-se todo o genoma de CCRs de rato induzidas por Fe-NTA e as suas linhas de células usando CGH com base na matriz. Além disso, transformamos os dados em um genoma humano através de relações sintênica cromossômica e analisou a associação.

Resultados

Vistas de todo o genoma de DNA copiar o número de Alterações no induzida por Fe-NTA Rat CCRs

Quinze ratos amostras de DNA RCC, que incluiu 13 amostras de tumores primários e 2 amostras de linha celular, foram hibridizadas em microarrays Agilent oligonucleotídeos para CGH com 181.978 loci genômica (adesão GEO: GSE36101). Comparando diferentes perfis CGH com base na matriz de forma quantitativa é difícil. Uma mudança no número de cópias médio é causada por poliploidia e a contaminação de células normais. Por conseguinte, temos desenvolvido um método estatístico que considera estes factores para estimar o número de cópia cromossómica (Métodos S1). Neste trabalho, análises de dados baseada em array CGH perfil baseiam-se nos números de cópias estimadas usando esse método.

baseada em matriz CGH profiling revelou que genomas dos CCRs de ratos induzidos Fe-NTA são muitas vezes complexas e têm muitas extensas alterações cromossómicas (Figs. 1A e S1). A análise de frequência genoma inteiro com 15 amostras identificadas regiões recorrentes de uma aberração número de cópias nos CCRs-induzidas Fe NTA (Fig. 1B). número de cópias aberrações foram determinadas com base na distribuição dos valores da relação log2 que foram recalculados com o número de cópias estimado para um conjunto de 13 tumores primários e 2 linhas de células (Fig. S2). Nessa distribuição, os limites que representou ganho e de perda foram escolhidos ± 0,377. Uma amplificação representando limiar foi escolhido em 0,811 ao passo que uma deleção homozigótica (perda completa) foi designado para a posição na qual o número de cópias foi estimada como 0. A característica global mais típico revelado pela análise de frequência era uma predisposição para perder uma grande extensivamente região de cromossomos, especialmente para os cromossomos 3, 5, 6, 8, 9, 14, 15, 17 e 20. A segunda característica foi uma amplificação frequente durante um longo região pericentromérica no cromossomo 4.

(A) perfis CGH baseadas em matrizes representativas de dois tumores CCR. As linhas vermelhas mostram os rácios log2 do número de cópia estimada sobre o ploidy câncer inferida versus a posição genômica para todas as sondas de microarray CGH. (B) a distribuição de freqüência de aberrações no número de cópias em todo o genoma do rato. As frequências relativas de amplificação (vermelho escuro), ganho (tomate), perda (verde e amarelo) e deleção homozigótica (verde escuro) no prazo de 13 tumores RCC e duas linhas de células RCC são traçados em cada posição genômica. Dois loci relacionada ao câncer,

Met Comprar e

CDKN2A

, que foram mais frequentemente afectados por número de cópias aberração são indicadas pelas setas.

cromossômica Frequent Perda de Rat cromossomo 5 e deleção homozigótica no

CDKN2A /2b

Locus

cromossoma 5 foi submetido a uma extensa perda no número de cópias, e não menos do que em outros cromossomos (por exemplo, cromossomos 6, 8 e 20 ) (Fig. 1B). No que se refere à perda extensa, deleções foram mais frequentemente observado no

CDKN2a /2b

locus no cromossoma 5 (Fig. 2A). Esta região comumente excluído incluiu dois loci (

CDKN2A

e

Cdkn2b

) por três genes supressores de tumores distintos (

p16

e

p19

em

CDKN2A

;

p15

em

Cdkn2b

) (Fig 2B).. Desligamento do

p16 /p19

e

expressão p15

mRNA foi confirmada nas amostras que continham uma deleção homozigota no

CDKN2A /2b

lugar (Fig. 2C e 2D) . Em amostras com uma deleção hemizygous no

CDKN2A

loco (ou seja, FB32-4, FB28-7),

p16

e

p19

expressões foram reprimidos, presumivelmente porque o regiões promotoras dos alelos restantes foram metilados. No entanto, algumas das amostras, quer com um hemizigótico ou nenhuma eliminação (por exemplo, FB14-3; BF51-1; FB14-6; FB30-5 e FB33-7) mostrou uma marcada sobre-expressão de

p16

e

p19

.

(A) O gráfico de barras representa as regiões de perda cromossômica (amarelo verde) e homozigoto deleção (verde escuro) ao longo cromossomo 5 para 13 tumores RCC e duas linhas de células RCC. A linha vermelha vertical no fundo indica a posição do

CDKN2A

lócus. (B) vista do gráfico de barras centrado no

CDKN2A /2b

loci ampliada. As regiões genómicas de todos os genes RefSeq incluídos na gama apresentada do cromossoma são representadas como barras verticais no fundo. (C) Análise da expressão de

CDKN2A

(

p16

INK4a

e

p19

Arf

) por 13 tumores RCC e duas linhas de células RCC, usando o Real -time PCR com pares de primers específicos para cada transcrição diferente. Os valores no

y

-axis indicar o nível de expressão de mRNA relativa em comparação com uma média daqueles em rins normais de três ratos controle. análise (D) A expressão de

Cdkn2b

(

p15

Ink4b

) por 13 tumores RCC e duas linhas de células RCC por PCR em tempo real. Os valores no

y

-axis indicar o nível de expressão de mRNA relativa em comparação com uma média daqueles em rins normais de três ratos controle.

amplificações freqüentes sobre a região pericentromérica do cromossomo 4 e amplificação no

Met

Locus

Durante um longo porção da região pericentromérica no cromossomo 4, foram observados número de cópias frequentes ganho e amplificação (Fig. 1B). amplificação genómica e expressão gênica nas áreas correspondentes do cromossomo 4 foram na maior parte proporcional (Fig. S3). Um gráfico de barras da região amplificada ao longo da região pericentromérica no cromossomo 4 revelou que

Met

reside oncogene na seção genômica sobreposição mais comum (Fig. 3A). A secção mais sobreposição com um comprimento de aproximadamente 222 kb consistiu de uma região amplificada em 11/15 amostras e continha apenas um gene curada-RefSeq (

Met) (Fig. 3B). Um aumento maior do que 5 vezes em

Met

expressão de ARNm foi observada em 6 amostras entre as 9 tumores que continham uma amplificação genómica de

Met (Fig. 3C).

(A) O gráfico de barras representa as regiões de amplificação ao longo de um 65 Mb região pericentrometic do cromossomo 4 para 13 tumores RCC e duas linhas de células RCC. Quatro graus de amplificação são indicadas por barra de gradação de cor; quanto mais escuro o vermelho, quanto maior for a amplitude. (B) uma vista ampliada do diagrama de barras mostra acima na vizinhança da região mais sobreposição. As regiões genómicas de todos os genes RefSeq incluídos na gama apresentada do cromossoma são representadas como barras verticais no fundo. Análise (C) A expressão de

Met Compra de 13 tumores RCC e duas linhas de células RCC por PCR em tempo real. Os valores no

y

-axis indicar o nível de expressão de mRNA relativa em comparação com uma média daqueles em rins normais de três ratos controle.

Em conjunto, sobre aberrações cromossómicas para estas duas câncer loci -relacionados, cada carcinoma examinou incluindo as duas linhas celulares continham o

Met

amplificação ou a

CDKN2A /2b

supressão (Tabela 1, Fig. 2B e 3B). Outras alterações genéticas comuns encontram-se resumidos na Tabela S1 (20 genes eliminados, comum em tumores RCC 2-4) e a Tabela S2 (340 genes amplificados, comuns em tumores 2-9 RCC). Entre os

Zbtb38

amplificação foi confirmado para a sobre-expressão (Fig. S4).

tamanho do tumor de CCRs induzida por Fe-NTA é regulada por características genéticas

examinaram as associações entre alterações genéticas e várias características RCC incluindo as resumidas na Tabela 1. Entre todas as relações examinados,

Met

expressão e o tamanho do tumor foram proporcionalmente associados (Fig. 4a). Além disso, um agrupamento hierárquico de tumores baseados em padrões inteiros de alterações cromossómicas revelou que um grupo de grandes tumores (isto é, FB7-7, FB30-5 e FB33-7) correspondeu a um aglomerado distinto (Fig. 4B). Por isso, uma característica do tumor, o tamanho no momento do tumor foi clinicamente evidente, foi associada com os perfis inteiras CGH com base na matriz.

(A)

Met

expressão é significativamente correlacionada com o tamanho do tumor . coeficiente de correlação de Pearson (r) e o valor P correspondente são escritos na área de desenho. (B) de agrupamento hierárquico dos tumores CCR com base em toda a padrões genoma do número de cópias mudanças. Os tumores de grande porte formar um cluster distinta.

A comparação do número de cópias perfis de alteração em Cancer Genomas Entre ratos e humanos

Para determinar o princípio geral de alterações genômicas em larga escala em câncer entre espécies de mamíferos, comparamos genomas do câncer de ratos e seres humanos como todo um espectro de alterações cromossômicas. Em primeiro lugar, transformou os perfis CGH baseados em matriz de rato em cromossomas humanos de acordo com uma sintenia entre as duas espécies. Em seguida, comparou-se os integrais com base em padrões de números de cópias estimadas usando métodos de análise de dados multidimensionais. Descobrimos que RCC de rato induzida por Fe-NTA foi mais semelhante ao RCC humanos, seguido de mesotelioma maligno humano (Figs. 5A e 5B).

(A) A trama cor representa uma matriz de similaridade entre os CCRs rato e vários cancros humanos. RRCC, carcinoma de células renais de rato; hPDAC, o adenocarcinoma ductal pancreático humano; hTALL, de células T humanas de leucemia linfoblástica aguda; hGBM, glioblastoma multiforme humano; HRCC, carcinoma de células renais humanos. (B) Resumo numérico da matriz de similaridade. O número em cada quadrado indica um valor médio do índice de semelhança (definido entre -1000 e 1000). Consulte a seção Materiais e Métodos para mais detalhes.

Discussão

Neste estudo, relatamos pela primeira vez, análises de todo o dados de CGH-array com base aplicada a uma Fenton carcinogênese induzida por química em um modelo de rim de ratos [20]. Descobrimos que o estresse oxidativo provoca extensas alterações genômicas do genoma do câncer induzido a nível cromossómico (Fig. 1A). É bem conhecido que a maioria dos tumores sólidos malignos humanos possuem ganhos ou perdas em numerosas cromossomas [21], [22], e a amplificação pode ser um alvo apropriado para quimioterapia do cancro. Durante o processo cancerígeno desses tumores, instabilidade cromossómica é pensado para contribuir como fator de condução [23]. Entre selvagens modelos de roedores carcinogênese, no entanto, alguns modelos de relatórios utilizando amostras de tumores primários extensos alterações genéticas por causa da instabilidade cromossômica [24], [25]. induzida por radiação linfoma maligno murino [26] e o adenocarcinoma de pulmão de murino induzida por 4- (metilnitrosamino) -1- (3-piridil) -1-butanona, um agente cancerígeno presente no fumo do tabaco [27], revelou ligeiramente mais grosseiras do que as aberrações cromossómicas os tumores espontâneos correspondentes, embora a baixa resolução na (array bacteriana cromossomo artificial [BAC] de ~6,500) relatório. Os fatos que controlam ratos não apresentam CCRs [11], [12] e modelo RCC rato induzida por Fe-NTA exibe uma equivalência com cancros humanos em alterações genômicas a nível cromossómico apoiar fortemente a ideia de que esta carcinogênese modelo imita um processo cancerígeno real em aqueles seres humanos que não têm características de susceptibilidade ao câncer fortes.

por outro lado, camundongos com múltiplos genes associados ao câncer geneticamente modificadas mostram alteração genética deste tipo [28]. Pensamos que esses experimentos correspondem a um fenótipo estabelecida modificador [29] e, assim, o processo cancerígeno em humanos que têm traços de susceptibilidade ao câncer fortes, tais como a síndrome de Li-Fraumeni (

p53

) [30] ou melanoma famílias (

p16

) [31]. Como um modelo de rato RCC hereditária, nós também analisou os CCRs de ratos Eker, que não apresentem características agressivas, como a metástase [32], [33], [34]. Observou-se que estes CCRs mostraram alterações genéticas nulos ou sutis (Fig. S5). Assim, o stress oxidativo, incluindo a induzida por excesso de ferro, pode ser uma das causas da carcinogénese humana renal. De fato, inúmeros estudos epidemiológicos têm associado trabalhadores da indústria de ferro e aço com um aumento do risco RCC [35].

Uma análise gráfico de frequência revelou duas características notáveis. Em primeiro lugar, as aberrações cromossómicas mostrou uma preferência para a perda contra a ploidia de cada genoma do câncer. Principalmente, a aberração foi representado por uma deleção em cada um todo nível cromossómico (monossomia) ou a um nível segmentar (Fig. 1B). O alvo mais comum para a perda foi o

CDKN2A /2b

lócus. A predominância de perda no perfil de alterações cromossómicas pode ser atribuído para a fase precoce da carcinogénese. Nós já demonstraram que as células com uma deleção hemizygous em

CDKN2A

aparecer logo algumas semanas após o início de uma administração Fe-NTA [36].

A nossa análise presente revelou que a perda monoalélicos de cromossoma 5 na íntegra ou de um equivalente vasta região é o primeiro grande evento. De fato, encontramos apenas um caso (6,7%) de uma perda monoalélicos de uma região extremamente estreito (~350 kilobases;. Figuras 2A e 2B). Fe-NTA catalisa a geração de radicais hidroxilo através de uma reacção de Fenton especificamente no lúmen dos túbulos renais proximais, o que leva a degeneração e necrose /apoptose destas células [37], [38]. Porque rim é um órgão vital que executa excreção de ureia, a reabsorção de moléculas valiosas, bem como a manutenção da homeostasia iónica, a regeneração das células tubulares remanescentes é intensamente promovido. Sob estresse oxidativo crônico pelas administrações Fe-NTA repetidas, este processo de degeneração e regeneração iria continuar por meses ou anos, aumentando o risco de eventos de mitose em simultâneo com a reparação de dano oxidativo ao DNA. Acreditamos que esse estresse oxidativo provoca a replicação do DNA anormal e segregação errada cromossômica, o que leva ao aparecimento de células aneuplóides. Surpreendentemente, esta série de acontecimentos parecem ocorrer em meses, que conduz a uma incidência elevada (~ 90%) de RCC em ratos no prazo de dois anos. células aneuplóides geralmente apresentam fenótipos consistentes com o aumento da necessidade de energia e estresse proteotoxic. No entanto, a aneuploidia pode promover a tumorigénese sob os dois mecanismos hipotéticos seguintes: 1) aneuploidia pode causar uma vantagem proliferativa através da perda de controlo transição G1 /S sob condições em que as células euplóides normais não se dividem [39] e 2) aneuploidia pode avançar tumorigénese pela promover a instabilidade genômica, conseqüentemente, aumentando a capacidade de evoluir de tumores [40]. A eliminação frequente do

CDKN2A

/

2b

locus é observado no mesotelioma peritoneal de rato, uma associada à sobrecarga de tumor de ferro [41], induzida quer por outro composto de ferro (sacarato férrico) [ ,,,0],42] ou pelo amianto [43]. Estes traços comuns de modelos animais sugerem fortemente que

CDKN2A

/

2b

é o principal alvo na carcinogênese mediada por ferro. A mesma alteração genética é observada em mesotelioma rato induzida por nanotubos de carbono de paredes múltiplas [44], em que o envolvimento de ferro ainda não está estabelecida. Nós gostaríamos de acrescentar aqui para o significado biológico de nossos resultados que a deleção homozigótica do

CDKN2A /2B

é frequentemente observada em mesotelioma humana associados à exposição ao amianto [45], [46].

alguns dos tumores com um remanescente

CDKN2A

/

2b

alelo mostrou níveis de expressão extremamente altas de dois produtos a partir deste local,

p16 /INK4a

e

p19 /Arf.

Esta é uma questão atualmente debatida no câncer humano [47]. Existem evidências consideráveis ​​de que várias neoplasias exibir níveis significativos de p16 no citoplasma [48]. Esta pode ser uma tentativa frustrada de impedir a proliferação de células no caso de

Rb

desregulação jusante [49] ou pode representar um mecanismo alternativo para a modulação de vias não identificados. Nossa exposição de dados ~ 50% eliminação hemizygous de

Rb

. Isso exige mais esclarecimentos com a análise epigenética.

A segunda característica determinada utilizando análise de gráfico de frequência foi uma alta incidência de amplificação ao longo de uma região cromossômica limitada para o centrômero do cromossomo 4, apontando para o

Met

lócus. A região que abrange 80 Mb do centrómero do cromossoma de rato 4 é sintênica no cromossoma humano 7. vários cancros humanos, tais como glioblastoma [50] e cancro do pulmão de não pequenas células [51], são relatadas para abrigar amplificações no cromossomo 7. A tirosina MET quinase é um receptor para um factor de crescimento de hepatócitos e está situado a montante do

ras

na via de transdução de sinal, servindo assim como uma vantagem para a proliferação de células [52]. Portanto, é concebível que o tamanho do tumor foi proporcionalmente relacionado com o

Met

nível de expressão (Fig. 3C e 4A). Porque nós dissecar o animal assim que reconhecer o tumor, acreditamos que os tumores de grande porte são mais agressivos na natureza. É de notar que o tamanho do tumor também foi relacionado ao padrão genoma alteração (Fig. 4B), e foi associado com amplificação e superexpressão de

Zbtb38

localizado no cromossoma 8 (Fig. S4). ZBTB38 (CIBZ) reprime a transcrição de modelos metilados [53], que regulam, assim, presumivelmente mecanismos epigenética. A sub-regulação de ZBTB38, um novo substrato de caspase-3, induz a apoptose [54] e deste gene está localizada em um locus de susceptibilidade para cancro da próstata [54]. Estes resultados confirmam a possibilidade de classificação de tumores usando CGH baseado em matriz.

Met

surgiu evolutivamente tarde e é exclusivo para os mamíferos [52]; Poderá, assim, ser associado com a amplificação único em todo o genoma.

amplificação genómica é a hipótese de ocorrer através do ciclo de quebra-fusão-ponte [55], [56], [57]. A reação de Fenton provoca danos ao DNA de cadeia dupla [10]. Os nossos resultados mostraram que estas amplificações consistia de uma mistura de amplificações de baixo nível de amplo espectro e, amplificações de alto nível estreitas fragmentados (Fig. 3A). Isto sugere um mecanismo de feedback positivo para a amplificação, a partir de amplificação de baixo nível em toda a gama. Nós suspeitamos que um envolvimento de duplas minutos, e uma presença de loci genômica suscetíveis. Essa hipótese requer um estudo mais aprofundado. Foi interessante que dois tumores genes supressores,

CAV1

[58], [59] e

ST7

[60], cercaram o

Met

lugar (Fig. 3B) . Esta pode ser a razão pela qual o

Met

loco foi um denominador para os CCRs de ratos. exome todo ou sequenciação do genoma pode revelar ainda mais novas descobertas em relação mutação pontual e translocação cromossômica.

Finalmente, foram comparados os resultados atuais de ratos com tumores humanos correspondentes ao transformar os dados baseados em cromossômica sintenia (Fig. 5A e 5B). Espera-se que a alteração genómica de RCC de rato induzida por Fe-NTA foi mais semelhante à humana RCC presumivelmente porque as células alvo são as mesmas. No entanto, surpreendentemente, o mesotelioma humano foi o segundo mais similar. Agora, é estabelecido que a maioria dos resultados mesotelioma humana decorrentes da exposição ao amianto, eo processo patogénico principal envolvido é a sobrecarga de ferro [8], [61]. A mesma origem mesodérmica de células tubulares renais e células mesoteliais pode fazer com que a semelhança dos perfis de CGH com base na matriz. tumor endodérmico, como adenocarcinoma pancreático ductal (PDAC), e tumor ectodérmica, como glioblastoma multiforme (GBM), apresentaram uma diferença significativa nos perfis genômicos.

Em conclusão, mostramos que repetiu reações de Fenton em wild- ratos do tipo induzida câncer que recapitulou alterações genômicas semelhantes àquelas em cancros humanos, sugerindo o envolvimento do estresse oxidativo como um fator importante na carcinogênese humana. Neste modelo carcinogênese renal, alterações preferidos eram exclusão;

CDKN2A /2B

exclusão e

Met

amplificação foram as principais modificações do gene alvo. Uma análise comparativa entre espécies contribuiria para identificação de agentes cancerígenos candidatos.

Materiais e Métodos

induzida por Fe-NTA de células renais Carcinoma modelo

experimentos carcinogênese induzida por Fe-NTA foram realizado utilizando ratos macho F1 híbridos que eram um cruzamento entre Fischer 344 e Brown-Norway estirpes endogâmicas (Charles River, Yokohama, Japão) tal como previamente descrito [62]. Treze casos RCC foram utilizados neste estudo, e determinou-se o grau histológico do tumor de acordo com a classificação da Organização Mundial de Saúde modificado como descrito previamente [62]. Os detalhes estão resumidos na tabela 1. Os comités de Experimentação Animal da Faculdade de Medicina, Universidade de Kyoto Graduate School of Medicine e Nagoya University Graduate School of Medicine aprovou este estudo. linhas celulares FRCC001 e FRCC562 ​​foram estabelecidos a partir CCRs induzidas Fe-NTA primários como descrito anteriormente [63].

Hibridação Genômica Comparativa

O DNA genômico dos tumores e linhas celulares à base de matriz foi isolado com DNeasy (Qiagen, Valencia, CA). -Matriz baseada CGH foi realizada com um Agilent 185 K genoma de rato CGH microarrays (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) tal como anteriormente descrito [64]. Treze tumores primários e duas linhas de células de Fe-NTA CCRs induzidas foram analisadas utilizando ADN extraído de referência a partir de um rim normal de um rato de Brown-Norway imbred estirpe. Uma amostra de um RCC fêmea Equer de rato [32] foi analisado utilizando ADN extraído de referência a partir de um rim normal de um rato macho Equer. Duas amostras adicionais RCC de ratos Eker do sexo masculino foram analisados ​​com Rat Genome CGH Microarray 105A (G4436A; Agilent Technologies), utilizando DNA extraído de referência um fígado normal de outra masculina Eker rato. Os dados CGH normalizadas com base na matriz foram processados ​​para gerar um perfil segmentada por segmentação binário circular (CBS) [65] com um nível de significância alterada (alfa = 0,0001). O procedimento de processamento de dados para a estimativa do número de cópias é detalhado nos Métodos S1.

RT-PCR quantitativo Análise

O ARN total foi isolado utilizando reagentes ISOGEN (Nippon Gene Co., Ltd., Tóquio, Japão ) de acordo com o protocolo do fabricante. ADNc foi sintetizado utilizando um kit de PCR de ARN ver. 3.0 (Takara Bio, Shiga, Japão) com iniciadores aleatórios. Um kit Platinum SYBR Green qPCR SuperMix UDG-(Invitrogen, Carlsbad, CA) e um Sistema de Real-Time PCR 7300 (Applied Biosystems, Foster City, CA) foram usadas para análise de PCR quantitativo em tempo real. Rato β-actina foi utilizado como um controlo interno. Os iniciadores utilizados foram os seguintes:

p16

INK4A

, 5′-aaacgccccgaacactttc-3 ‘e 5′-gttcgaatctgcaccatagga-3’;

p19

Arf

, 5′-accccaagtgagggttttct-3 ‘e 5′-agagctgccactttgacgtt-3’;

p15

Ink4b

, 5′-tccacaggctagagggaaaa-3 ‘e 5′-gtgcaggtgactccttggtt-3’;

Met

, 5′-ttaagcgagagcacgacaaat-3 ‘e 5′-ccacataggaaaacgcactgt-3’;

Zbtb38

, 5′-gtagctgctgctccaaatcc-3 ‘e 5′-cctgttgagggtggtgaact-3′; β-actina, 5’-tgtgttgtccctgtatgcctctg-3 ‘e 5′-atagatgggcacagtgtgggtg-3’.

Dados Humanos

Foram utilizados dados CGH baseadas em matrizes humanas de adenocarcinoma ductal pancreático (hPDAC) [ ,,,0],28], de células T da leucemia linfoblástica aguda (hTALL) [28], glioblastoma (hGBM) [66], linha celular de mesotelioma (hMM) [67] e carcinoma de células renais (HRCC) [56]. Os dados Agilent CGH-array com os antigos quatro tipos de câncer humano foram obtidos de Expressão Gênica do NCBI Omnibus (GEO) website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Os números de acesso GEO para os conjuntos de dados são GSE7599 (hPDAC), GSE7603 (hTALL), GSE9177 (hGBM) e GSE22237 (hMM). Os dados RCC humana foi obtida através de análises com microarrays BAC (4.361 clones) [68]. Definimos índice de similaridade entre os dois perfis CGH com base na matriz da seguinte forma. Primeiro, foi calculado o coeficiente de correlação de índices log2 do número de cópia estimada sobre o ploidy câncer inferido pelas posições genômicas correspondentes a todos os Agilent 44 sondas de microarranjo K humana CGH. Em seguida, multiplicou-se o valor em 1 × 10

3 após alterar o valor absoluto em sua raiz quadrada.

Informações de Apoio

Figura S1.

perfis matriz-CGH de todos os CCRs examinados. linhas vermelhas mostram os rácios log2 de número de cópias estimado mais de ploidia câncer inferida contra posição genômica para todas as sondas de microarray CGH

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043403.s001

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Figura S2.

Distribuição dos valores da razão log2 de número de cópia estimada para todas as sondas em todos os microarrays realizadas.

doi: 10.1371 /journal.pone.0043403.s002

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Figura S3.

Exemplo de expressão mundial muda de acordo com a alteração genômica. Diferenças no genoma e transcriptoma são analisados ​​entre dois CCRs, FB7-7 tendo ampla gama de amplificação no cromossomo 4 contra FB28-7 ter nenhuma alteração genômica substancial no cromossomo 4. (A) Sky Blue Circle trama indica rácio do número de cópias estimadas com base em baseada-array CGH (FB7-7

vs

FB28-7). plot círculo vermelho indica proporção de sinais normalizados em microarray de expressão Affymetrix (FB7-7

vs

FB28-7). (B) dos valores da relação de expressão são em média ao longo do cromossoma. Aqui, círculo trama vermelha indica o valor médio em janelas de 2 Mb

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043403.s003

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Figura S4.

Zbtb38

expressão do mRNA é comprovadamente associado ao seu número de cópias do cromossoma. perfis (A) de matriz-CGH de dois tumores RCC abrigando amplificação sobre

Zbtb38

lócus no cromossomo análise 8. (B) A expressão de

Zbtb38

em 13 RCC tumores por PCR em tempo real. Os valores do

y

-axis indicar o nível de expressão de mRNA relativa em comparação com uma média daqueles em rins normais de três ratos controle

doi:. 10.1371 /journal.pone.0043403.s004

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Figura S5.

perfis matriz-CGH de três hereditária (Eker rato) tumores renais.